Inducción de la formación de sinapsis por síntesis de neurotransmisores de novo

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3060 (2022) Citar este artículo

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Una pregunta vital en neurociencia es cómo las neuronas alinean sus estructuras postsinápticas con los sitios de liberación presináptica. Aunque se sabe que las proteínas de adhesión sináptica contribuyen en este proceso, el papel de los neurotransmisores sigue sin estar claro. Aquí investigamos si la biosíntesis de novo y la liberación vesicular de un transmisor no canónico pueden facilitar el ensamblaje de sus postsinapsis correspondientes. Demostramos que, tanto en neuronas humanas derivadas de células madre como en neuronas de ratón in vivo de identidad puramente glutamatérgica, la expresión ectópica de enzimas de síntesis de GABA y transportadores vesiculares es suficiente para producir GABA a partir de glutamato ambiental y transmitirlo desde terminales presinápticos. Esto permite la acumulación eficiente y la activación consistente de los receptores GABAA postsinápticos y genera sinapsis GABAérgicas completamente funcionales que operan en paralelo pero independientemente de sus contrapartes glutamatérgicas. Estos hallazgos sugieren que la liberación presináptica de un neurotransmisor en sí mismo puede señalar la organización del aparato postsináptico relevante, que podría modificarse directamente para reprogramar la identidad sináptica de las neuronas.

Las neuronas se comunican entre sí a través de estructuras especializadas llamadas sinapsis. La forma en que las sinapsis establecen y mantienen su identidad sigue sin estar clara. Según una teoría, las moléculas de adhesión celular sináptica (SAM) desencadenan la formación de sinapsis al promover las interacciones trans-sinápticas entre los componentes pre y postsinápticos1,2,3. En apoyo de esta hipótesis, la expresión ectópica de SAM puede mejorar o inducir respectivamente la sinaptogénesis tanto en neuronas como en células no neuronales4,5,6,7. Además, también se informó que las deleciones genéticas individuales de algunos SAM disminuyeron el número de sinapsis en grados variables, aunque no eliminaron por completo el ensamblaje de sinapsis8,9,10.

Curiosamente, a pesar de estos pocos casos, los modelos knock-out (KO) constitutivos o condicionales para la gran mayoría de los SAM no muestran deficiencias a gran escala en la formación de sinapsis y solo afectan su maduración funcional, lo que ocasionalmente podría conducir a una pérdida posterior de sinapsis a lo largo del tiempo11,12,13,14,15. Además, los mecanismos dependientes de SAM aún tienen que explicar la producción de diferentes tipos de sinapsis, porque varios SAM postsinápticos localizados específicamente en las sinapsis principales glutamatérgicas o del ácido γ-aminobutírico (GABA) -érgicas a menudo pueden interactuar con compañeros de unión presinápticos comunes que son similares. distribuidos en ambos tipos de sinapsis16,17,18. Por lo tanto, las señales celulares alternativas distintas de las SAM podrían ser requeridas principal o simultáneamente para la sinaptogénesis y la alineación confiable del aparato sináptico complementario.

Un segundo modelo de sinaptogénesis implica que la liberación de neurotransmisores puede modular directamente este proceso. En respuesta a varios transmisores producidos en las terminales presinápticas, sus compartimentos postsinápticos reclutan distintas clases de receptores que confieren propiedades funcionales a las sinapsis. Esta teoría se ve reforzada por estudios que muestran que la eliminación de los receptores GABAA (GABAAR) puede afectar tanto la morfología como la especificidad del objetivo de un subconjunto de sinapsis GABAérgicas19,20. Se obtuvo evidencia adicional de arreglos postsinápticos dependientes del transmisor a partir de observaciones recientes de que diferentes cotransmisores sintetizados dentro de una sola neurona a menudo pueden segregarse en terminales presinápticos independientes que contactan distintas poblaciones de células postsinápticas21,22,23. Además, algunas neuronas incluso pueden cambiar entre tipos de transmisores de una manera dependiente de la actividad, lo que a su vez altera sus niveles y composiciones de receptores correspondientes en las postsinapsis24,25.

Quizás el caso más convincente para la sinaptogénesis inducida por el transmisor surge de dos estudios seminales que demuestran que la fotólisis rápida del glutamato y GABA 'enjaulados' cerca de las ramas dendríticas puede causar la acumulación local de receptores postsinápticos y proteínas de andamiaje, lo que da como resultado la formación de sinapsis inmaduras que eventualmente pueden integrarse en circuitos neuronales existentes26,27. Este fenómeno también se reprodujo con éxito en diferentes subtipos neuronales ubicados en varias regiones del cerebro de un amplio rango de edad de animales28,29,30. Sin embargo, aún se desconoce (i) si dichos mecanismos pueden operar durante la liberación de neurotransmisores presinápticos fisiológicamente relevantes, (ii) si estas sinapsis nacientes inducidas por el transmisor experimentan una mayor maduración morfológica y/o funcional, (iii) si la identidad del transmisor de una neurona en sí podría manipularse deliberadamente utilizando factores exógenos, (iv) si cambiar el neurotransmisor liberado podría conducir directamente a la producción de diferentes tipos de sinapsis, y (v) si estas sinapsis inducidas por el transmisor también podrían desarrollarse in vivo, especialmente en animales vivos. Abordar estas preguntas podría permitirle a uno comprender los principios fundamentales de cómo se forman las sinapsis y adquieren sus identidades.

En este estudio actual, nos propusimos determinar si la expresión ectópica de enzimas presinápticas exógenas y transportadores vesiculares puede impulsar tanto la biosíntesis como la liberación sináptica de un transmisor alternativo en neuronas comprometidas con el linaje e iniciar la formación de postsinapsis funcionales de un diferente amable. Descubrimos que una sobreexpresión combinatoria de tres proteínas, es decir, vGAT, GAD65 y GAD67, puede sintetizar y transmitir adecuadamente GABA incluso desde neuronas exclusivamente glutamatérgicas, lo que desencadena una producción eficiente de sinapsis de salida GABAérgicas morfológica y funcionalmente maduras, tanto in vitro como in vivo. .

En primer lugar, nuestro objetivo era comprender cómo las neuronas glutamatérgicas protegen su identidad transmisora ​​en las salidas sinápticas y evitan otras especificaciones, por ejemplo, los programas GABAérgicos. Con este fin, empleamos un sistema modelo previamente establecido que genera rápidamente neuronas glutamatérgicas puras a partir de células madre embrionarias humanas (ES, por ejemplo, línea H1) mediante la expresión forzada de un único factor de transcripción Neurogenina-2 (es decir, Ngn2; Fig. 1a)31 . Los registros de abrazadera de voltaje (potencial de retención, Vhold = −70 mV) en el día posterior a la inducción ≈ 56–60 detectaron corrientes postsinápticas espontáneas robustas (sPSC) con actividades de red recurrentes (Fig. S2a complementaria). Estos eventos sinápticos estaban compuestos predominantemente por sPSC excitatorias (es decir, sEPSC), ya que podían eliminarse fácilmente mediante la aplicación aguda de un antagonista del receptor AMPA (AMPAR), cianquixalina (CNQX), pero no del antagonista GABAAR, picrotoxina (PTX), lo que implica que Ngn2- las neuronas carecen de GABAAR postsinápticos, liberación de GABA presináptico o ambos (Fig. S1a complementaria). Sin embargo, las perfusiones de soplo de agonistas exógenos en las mismas condiciones experimentales revelaron la existencia de GABAAR completamente funcionales y sensibles a PTX además de AMPAR, lo que indica que estas neuronas solo transmiten glutamato pero probablemente no GABA desde sus terminales presinápticos (Fig. S1b complementaria) .

a Se indujo neurogénesis en células H1-ES mediante la expresión lentiviral de Ngn2, coinfectadas con virus adicionales que codifican vGAT, GAD65 y/o GAD67; las neuronas se cocultivaron con glía de ratón y se analizaron en el día 56–60. b Una imagen de ejemplo de neuronas humanas inducidas por Ngn2 (puntas de flecha cian) cotransducidas con factores V57, inmunomarcadas para MAP2, Synapsin y teñidas para DAPI nuclear (puntas de flecha blancas). La población negativa para MAP2 y teñida con DAPI indica células gliales de ratón cocultivadas. Recuadro punteado ampliado a la derecha. c, d Trazas de muestra de sPSC registradas a partir de las condiciones indicadas c, y frecuencia acumulada normalizada de decaimientos τ d para eventos rápidos frente a lentos (puntas de flecha azules frente a rojas). Recuadros en d, formas de onda de ejemplo de 10 sPSC escaladas y superpuestas (sombra clara) con los promedios correspondientes (sombra oscura) para el control (arriba) frente a V57 (abajo). e, f Frecuencia promedio (izquierda) y amplitud (derecha) de eventos de sPSC con cinética de descomposición rápida (e, decaimiento de τ < 10 ms) versus lenta (decaimiento de f, τ > 10 ms), según lo registrado en neuronas humanas que expresan combinaciones de factores indicadas. g, h Rastros representativos g e histograma acumulativo de decaimiento τ h de sPSC registrados a partir de neuronas Ngn2 que coexpresan factores V57, antes (Ctrl) y después de tratamientos agudos con PTX y/o CNQX (como se indica). yo-k. Probabilidades acumulativas (izquierda) y valores promedio (derecha) de sPSC de ancho medio (i), amplitud (j) y frecuencia de eventos (k), medidas en ausencia (Ctrl) o presencia de inhibidores, PTX, CNQX o ambos PTX + CNQX. Todos los datos se presentan como medias ± SEM, con número de células parcheadas/lotes independientes. Los puntos de datos individuales se proporcionan como círculos abiertos del mismo color. Para los paneles e, f, la significación estadística se evaluó mediante la prueba de Kruskal-Wallis emparejada con la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica post-hoc usando la corrección de Bonferroni (ver Datos de origen). Para i, j, k, los valores de asimetría y curtosis (-2 >≈ y ≈ < 2) sugirieron una distribución normal, ya que la significación estadística se sopesó mediante la prueba t de Student no pareada de dos colas, con ***P < 0,005; **P < 0,01; *P < 0,05; ns = no significativo, P > 0,05. Los grupos múltiples en el panel k también se compararon mediante un análisis de varianza (ANOVA unidireccional) emparejado con la prueba post-hoc de Tukey-Kramer, y se informaron los valores de P correspondientes.

Con el fin de identificar los mecanismos presinápticos o postsinápticos que son esenciales para la neurotransmisión GABAérgica pero que posiblemente falten en las células solo Ngn2, a continuación inspeccionamos los resultados de secuenciación de ARN obtenidos previamente por us32. Notamos la presencia de varias subunidades GABAAR, así como las principales moléculas de andamiaje postsinápticas inhibidoras (por ejemplo, gefirina y colibistina), pero solo una expresión mínima de las glutamato descarboxilasas (es decir, GAD65 y GAD67) o el transportador vesicular GABA (vGAT) (Fig. S1c complementaria) ). Sin embargo, estas células tenían una expresión sustancial de enzimas asociadas tanto con la biosíntesis de glutamato como con la carga vesicular (es decir, glutaminasa y vGLUT1/2), lo que nuevamente confirma su identidad glutamatérgica (Fig. S1c complementaria). Por lo tanto, aunque la población de células postsinápticas podría contener los componentes necesarios para el ensamblaje funcional de GABAAR, las neuronas Ngn2 carecen en gran medida de enzimas presinápticas para la síntesis de GABA y la transmisión vesicular.

A continuación, preguntamos si la expresión forzada de GAD65, GAD67 y/o vGAT en células glutamatérgicas Ngn2 puede sintetizar GABA a partir de glutamato ambiental y empaquetarlo en vesículas sinápticas para su posterior liberación. Clonamos ADNc humanos que codifican GAD65, GAD67 y vGAT bajo el promotor humano Synapsin-1, creamos partículas de lentivirus a partir de las construcciones y coinfectamos las neuronas Ngn2 con ellas (Fig. 1a). En los días 56 a 60 posteriores a la inducción, las inmunotinciones para MAP2 dendrítica y el marcador sináptico Synapsin revelaron una formación sustancial de sinapsis (Fig. 1b). Curiosamente, los registros electrofisiológicos de las neuronas que coexpresan GAD65 + vGAT o GAD67 + vGAT, pero ninguno de los dos factores por sí solos, disminuyeron significativamente la frecuencia de las sPSC con un decaimiento rápido de τ sin afectar su amplitud, y simultáneamente aumentaron tanto la frecuencia como la amplitud de las sPSC con decaimiento de τ más lento que en su mayoría estaba ausente en las neuronas de solo Ngn2 (Fig. 1c-f). Por lo tanto, la coexpresión de las enzimas de síntesis de GABA junto con el transportador vesicular de GABA produjo eventos de sPSC probablemente con una identidad diferente a la de las EPSC típicas. Los mayores efectos observados fueron para la combinación vGAT + GAD65 + GAD67 (denominada V57 en lo sucesivo, figura complementaria S2b).

Para determinar las identidades de los eventos de sPSC con decaimientos τ rápidos versus lentos, luego aplicamos bloqueadores de receptores en células Ngn2 que coexpresan factores V57. Los tratamientos agudos de CNQX frente a PTX previnieron de forma selectiva y respectivamente las sPSC rápidas frente a las lentas con anchos medios más pequeños frente a los más grandes, lo que sugiere que representan correspondientemente corrientes sinápticas excitatorias frente a inhibitorias (es decir, EPSC frente a IPSC; Fig. 1g-i ). Los IPSC espontáneos exhibieron amplitudes promedio considerablemente diferentes, podrían inhibirse independientemente de los EPSC, y solo la aplicación de PTX + CNQX, pero ninguno de los medicamentos por sí solo, pudo eliminar todos los eventos de sPSC (Fig. 1j, k). Estos resultados indican que los factores V57 pueden impulsar con éxito la formación de salidas GABAérgicas funcionales en neuronas humanas glutamatérgicas.

Dado que las sPSC podrían ser una mezcla de corrientes postsinápticas en miniatura independientes del potencial de acción (AP) (mPSC) y actividades de red dependientes de AP, buscamos caracterizar aún más sus contribuciones relativas en la liberación de GABA inducida por V57. En el modo de pinzamiento de corriente, las neuronas Ngn2 que coexpresan V57 (denominadas NV57) mostraron AP de referencia repetitivos, que fueron fácilmente abolidos por la tetrodotoxina (TTX), lo que reveló despolarizaciones por debajo del umbral indicativas de potenciales postsinápticos en miniatura auténticos independientes de AP (es decir, mPSP; Fig. 2a, b). En consecuencia, en las grabaciones de abrazadera de voltaje, la aplicación aguda de TTX redujo efectivamente la amplitud y la frecuencia de las sPSC rápidas y lentas, pero no eliminó por completo todos los eventos (Fig. 2c-e). Un tratamiento sucesivo con CNQX eliminó las mEPSC excitatorias rápidas mediadas por AMPAR e ilustró la coexistencia de mIPSC inhibidoras impulsadas por GABAAR insensibles a TTX con decaimientos de τ más lentos y anchos medios más anchos, que podrían silenciarse en consecuencia mediante el tratamiento con PTX (Fig. 2f). –h). Por lo tanto, las terminales presinápticas inducidas por V57 exhibieron una liberación espontánea de GABA tanto en formas dependientes de AP como independientes de AP, activando con éxito los GABAAR postsinápticos.

a Registros de pinza amperimétrica de puntos de acceso espontáneos, en ausencia (Ctrl, izquierda) o presencia de TTX (derecha). Recuadros, áreas ampliadas de las regiones encuadradas con AP (asterisco negro) o despolarización por debajo del umbral (asterisco morado). b Frecuencia media de PA espontánea (izquierda) o despolarización total (derecha), sin (Ctrl) o con TTX. C. Rastros representativos de sPSC (áreas encuadradas ampliadas a continuación) registrados en modo de sujeción de voltaje desde la condición Ctrl frente a tratamientos agudos de TTX, puntas de flecha que apuntan a eventos con decaimiento τ rápido (azul) frente a lento (rojo). d, e Gráficas de probabilidad y promedios de amplitud de eventos (izquierda) y frecuencia (derecha) para sEPSC d o sIPSC e. f Rastros representativos de mPSC registrados solo en presencia de TTX (Ctrl), o después de la aplicación conjunta de CNQX, PTX o ambos (CNQX + PTX). Las puntas de flecha indican eventos EPSC rápidos (azul) frente a IPSC lentos (rojo). g, h Frecuencia normalizada de decaimiento τ para eventos de PSC en miniatura g; Recuadro = 10 trazas de muestra superpuestas (tonos claros) y sus promedios correspondientes superpuestos (tonos oscuros). Gráficas de probabilidad acumulativa de anchos medios de eventos con gráficos de resumen h, para mEPSC resistentes a PTX (azul) frente a mIPSC resistentes a CNQX (rojo). i Formas de onda representativas superpuestas (izquierda, artefactos de estímulo reemplazados por flechas), amplitudes promedio (centro) y CV (derecha) de PSC evocadas por > = 3 pulsos presinápticos consecutivos, registrados a partir de las condiciones indicadas. j Trazas de ejemplo (izquierda) de EPSC e IPSC evocadas por un tren de pulsos (flechas); Los recuadros son estimulaciones pareadas sucesivas de entradas presinápticas con ∆t = 50 ms, presentadas como ensayos superpuestos (6 pulsos pareados consecutivos, tonos claros) con trazas promedio (tonos oscuros). Todas las amplitudes de PSC normalizadas al primer pulso correspondiente (derecha). Tanto los EPSC como los IPSC manifestaron una depresión sináptica significativa, pero de diferente magnitud, posiblemente debido a diferentes grados de desensibilización y/o saturación de AMPAR postsinápticos frente a GABAAR y, por lo tanto, no se pudieron comparar directamente como un indicador de las probabilidades de liberación presináptica. Todos los datos numéricos son medias ± SEM, con el número total de neuronas registradas/lotes experimentales y los puntos de datos representados como círculos abiertos. Las significaciones estadísticas se evaluaron mediante la prueba t de Student no pareada de dos colas (valores de asimetría y curtosis −2 > ≈ y ≈ < 2), o la prueba U no paramétrica de Mann-Whitney de dos colas, para ***P < 0,005; *P < 0,05; ns = no significativo, P > 0,05. Se compararon múltiples grupos mediante ANOVA unidireccional (i, con valor P).

Para examinar si GABA puede ser liberado por actividades presinápticas a gran escala, estimulamos las neuronas con un electrodo de campo y medimos las PSC evocadas. Una vez más, la aplicación aguda de CNQX detectó la presencia de componentes prominentes de IPSC evocados, con un coeficiente de variación (CV) equivalente al de los EPSC evocados, que podrían ser abolidos posteriormente por el tratamiento con PTX (Fig. 2i). Además, cuando se activaron por un tren de estimulaciones de alta frecuencia o pares de pulsos repetitivos, estos IPSC evocados presentaron plasticidad clásica a corto plazo con una fuerte depresión sináptica, como también se observó para los EPSC evocados (Fig. 2j). Por lo tanto, las presinapsis GABAérgicas no canónicas inducidas por V57 obtuvieron propiedades de liberación que eran comparables a las presinapsis glutamatérgicas normalmente producidas por las neuronas Ngn2, presumiblemente debido a que comparten mecanismos de liberación comunes.

Preguntamos si los factores V57 permitieron la formación de nuevas estructuras sinápticas en las células Ngn2 o remodelaron las sinapsis glutamatérgicas potenciales en un destino GABAérgico. Para probar eso, inmunoteñimos las células con anticuerpos presinápticos específicos (Figura complementaria S3a, b). No detectamos ningún defecto en la densidad celular o el crecimiento general de neuritas (Fig. S4a-c complementaria). La transducción de V57 no alteró el recuento o la morfología de las sinapsis totales marcadas por el anticuerpo Synapsin, y solo provocó un incremento menor en el tamaño de la presinapsis excitatoria positiva para vGLUT sin cambiar su densidad (Fig. 3a, b). Sin embargo, los factores vGAT y GAD65/67 sobreexpresados ​​se organizaron principalmente en un patrón agrupado, mejorando sustancialmente el tamaño y el número de presinapsis GABAérgicas, como lo demuestra su elaborada distribución a lo largo de las dendritas, que estaba prácticamente ausente en las neuronas solo Ngn2 (Fig. 3c, d) .

a Imágenes de muestra (izquierda) de neuronas Ngn2 solo frente a NV57 inmunoteñidas con el marcador pan-sináptico Synapsin. Valores promedio (derecha) de la densidad de Synapsin puncta normalizados por el área dendrítica MAP2 y el tamaño de los puntos. b–d Inmunotinciones similares a a, excepto para el marcador de presinapsis glutamatérgica vGLUT b, y los marcadores de presinapsis GABAérgica GAD65/GAD67 c, o vGAT d. e Imágenes representativas de ramas dendríticas marcadas con EGFP de Ctrl (solo Ngn2, fila superior) frente a neuronas V57 (fila inferior) comarcadas para vGLUT y vGAT (puntas de flecha amarillas y cian, respectivamente); Las proyecciones z de máxima intensidad resaltan una distribución intrincada de ambos tipos de sinapsis, especialmente en la condición V57. f La imagen de superresolución (izquierda) de una sola sección óptica de la condición V57 muestra una colocalización mínima entre las señales vGLUT y vGAT; las puntas de flecha grises apuntan a señales parcialmente superpuestas (retícula cian) resueltas en el eje x/zo y/z; el perfil de intensidad muestra la separación de picos entre las señales de una región de interés (línea de puntos amarilla). Se trazaron los coeficientes de Mander (derecha) de colocalización entre vGLUT y vGAT. g, h Igual que a, pero para marcadores postsinápticos glutamatérgicos (Homer, g) o GABAérgicos (Gephyrin, h). i Igual que e, excepto por la coexistencia de elaborados Homer y Gephyrin puncta, especialmente en la condición V57. j Igual que f, pero para los puntos postsinápticos de Homer y Gephyrin que ilustran de manera similar la colocalización mínima. Los valores promedio en los gráficos de barras representan medias ± SEM para el número de campos de visión analizados/lotes independientes. Los puntos de datos individuales se proporcionan como círculos abiertos codificados por colores. La significación estadística se sopesó mediante la prueba t de Student no pareada de dos colas (para valores de asimetría y curtosis -2 >≈ y ≈ < 2), o la prueba U no paramétrica de Mann-Whitney de dos colas (datos de origen), con * **P < 0,005; **P < 0,01; *P < 0,05; ns = no significativo, P > 0,05.

Especialmente en las células V57, el comarcaje con anticuerpos vGLUT y vGAT demostró una intrincada coexistencia de ambos puntos, que ocasionalmente parecían superponerse en imágenes gruesas proyectadas en z (Fig. 3e). Para explorar si se pueden formar sinapsis de diferentes identidades dentro de las mismas regiones presinápticas, utilizamos microscopía de súper resolución. Descubrimos que la mayoría de los puntos copositivos incluían señales vGLUT frente a vGAT que se originaban principalmente en diferentes planos focales y podían resolverse aún más en dimensiones x/z o y/z (Fig. S5a complementaria). Un análisis adicional de secciones ópticas individuales más delgadas sugirió que la mayoría de los puntos sinápticos en la condición V57 comprendían señales vGLUT o vGAT, y no ambas (Fig. 3f). Por lo tanto, las presinapsis glutamatérgicas frente a las GABAérgicas produjeron principalmente sitios de liberación separados espacialmente.

Para evaluar más a fondo cualquier efecto sobre la organización postsináptica, monitoreamos las distribuciones de los marcadores postsinápticos glutamatérgicos y GABAérgicos, por ejemplo, Homer y Gephyrin (Figura complementaria S3a, b). Notamos que la co-transducción de V57 disminuyó frente a aumentó, respectivamente, el número de puntos positivos de Homer frente a gefirina sin afectar sus tamaños, tanto en los segmentos dendríticos como en las regiones perisomáticas de las células Ngn2 (Fig. 3g, h y Figura complementaria S6a). Las neuronas NV57 también mostraron aposiciones sustanciales entre la gefirina postsináptica y los grupos de GABAAR de la superficie celular con vGAT presináptico y GAD65/67 puncta (Fig. S6b-d complementaria). A pesar de estos reordenamientos en las especificaciones sinápticas con una elevación significativa de las características GABAérgicas (Fig. 3i), la condición V57 continuó mostrando una co-localización limitada entre los grupos de Homer y Gephyrin, que presentaban formas distintas y ocupaban diferentes posiciones físicas (Fig. 3j, y Suplementario Figura S5b). Estos resultados implican que la liberación de GABA inducida por V57 de los terminales presinápticos probablemente puede mejorar la acumulación postsináptica de gefirina y GABAAR, que ya se expresaron en neuronas de solo Ngn2. Sin embargo, estas sinapsis GABAérgicas se ensamblan por separado, es decir, físicamente aisladas, de sus contrapartes glutamatérgicas.

Para evaluar qué tan temprano estas sinapsis inducidas adquieren identidad morfológica y desarrollan propiedades funcionales, analizamos las neuronas NV57 en diferentes puntos de tiempo de desarrollo (Fig. 4a). Durante los días 15 a 60 posteriores a la inducción, las células maduraron gradualmente con un aumento constante en la capacitancia de la membrana (Cm), una reducción en la resistencia de entrada (Rm) y un aumento en la formación general de sinapsis, tal como se visualiza mediante el inmunomarcaje de Synapsin (Fig. 4b, c) . A continuación, para monitorear la cinética de maduración relativa de las sinapsis glutamatérgicas frente a las GABAérgicas, realizamos grabaciones de pinzas de parche. Notamos que las frecuencias y amplitudes de las sEPSC mediadas por AMPAR y las sIPSC mediadas por GABAAR aumentaron periódicamente durante este período de tiempo (Fig. 4d, e). También se observaron cinéticas de maduración similares para EPSC e IPSC evocados, en términos de su fuerza y ​​​​tasas de éxito (Fig. 4f, g). De acuerdo, la inmunotinción con anticuerpos vGLUT y vGAT también reveló que las sinapsis glutamatérgicas y GABAérgicas comienzan a formarse tan pronto como el día 15 y continúan aumentando el día 30, ya que su densidad y tamaño tienden a saturarse alrededor del día 45–60 (Fig. 4h, i). Además, en el día 60, tanto los grupos vGLUT frente a vGAT como los grupos Homer frente a Gephyrin ocuparon individualmente solo una fracción de las señales totales de Synapsin, lo que respalda nuevamente la idea de que las sinapsis de diferentes identidades están segregadas en su mayoría (Fig. 4j, k). Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que las sinapsis GABAérgicas inducidas por V57 maduran al mismo tiempo que las sinapsis glutamatérgicas, pero se estabilizan independientemente unas de otras.

un protocolo experimental para b–k; Las neuronas humanas inducidas por Ngn2 se infectaron adicionalmente con virus que expresaban factores V57 y se analizaron cada 15 días desde el día 15 posterior a la inducción hasta el día 60. b Gráficos de resumen de los valores de Cm (izquierda) y Rm (derecha), en diferentes momentos de maduración neuronal. c Imágenes de ejemplo (izquierda) y densidad o tamaño promedio (derecha) de Synapsin puncta constituidos en neuritas positivas para Tuj1, medidas a partir de neuronas NV57 en diferentes etapas de su desarrollo in vitro (ver anotado). d, e Trazas de muestra (izquierda) y parámetros promedio (derecha, frecuencia o amplitud del evento) de sEPSC d mediadas por AMPAR y sIPSC e de GABAAR registradas en presencia de PTX y CNQX, respectivamente, en el día 15–60. f, g EPSC evocados por estimulación (f, con PTX) e IPSC (g, con CNQX) registrados en los puntos de tiempo indicados; trazas de ejemplo (izquierda), amplitudes promedio (centro) y porcentaje de células con respuestas detectables (derecha). h, i Igual que c, excepto por vGLUT (h) o vGAT (i) puntos formados en ramas dendríticas positivas para MAP2. j. Imágenes representativas (izquierda) y coeficientes de Mander (derecha) de colocalización entre Synapsin puncta y señales vGLUT o vGAT. Las neuritas se visualizaron por coexpresión de EGFP soluble. Tanto las señales vGLUT como vGAT ocupan individualmente solo una fracción de las sinapsis totales positivas para Synapsin en el día 60. k Igual que j, excepto por la colocalización entre Synapsin y Homer o Gephyrin, en el día 60. Todos los datos representan medias ± SEM. Los gráficos de resumen también indican el número total de campos de visión analizados (para inmunotinción) o neuronas parcheadas (para electrofisiología)/lotes independientes y puntos de datos individuales (círculos abiertos). La significación estadística para los datos normalmente distribuidos (valores de asimetría y curtosis entre -2 y 2) en los paneles j y k se calculó mediante la prueba t de Student no pareada de dos colas, con ***P < 0,005; ** P < 0,01. Para todas las comparaciones grupales (curso de tiempo, b–i), se realizó ANOVA unidireccional y se establecieron los valores de P.

Dado que la producción de sinapsis GABAérgicas progresó en paralelo con su maduración funcional, preguntamos si la activación dependiente de GABA de GABAAR o GABABR podría promover la formación y/o la estabilidad a largo plazo de estas sinapsis inducidas. Para probar eso, llevamos a cabo tratamientos crónicos con antagonista de GABAAR PTX o antagonista de GABABR CGP55845, intercambiamos la mitad de los medios con medicamentos cada dos días a partir del día 4 a 5, y analizamos las células en el día 56–60 (Fig. 5a) . Descubrimos que la aplicación de PTX, pero no de CGP, redujo considerablemente el número de vGAT y Gephyrin puncta sin afectar sus tamaños (Fig. 5b, c). El tratamiento crónico con PTX no afectó la supervivencia neuronal ni su arborización dendrítica, pero disminuyó la aposición entre las señales vGAT y Gephyrin (Figura complementaria S7a-c), lo que indica defectos específicos en la morfología de la sinapsis GABAérgica.

una estrategia experimental para los paneles b–f; Las neuronas NV57 se incubaron con inhibidores sinápticos, la mitad de los medios se intercambiaron cada dos días desde el día 4–5 posterior a la inducción hasta el día 56–60, y luego se analizaron como se indica (flecha). b, c Imágenes de muestra (izquierda) y densidad o tamaño normalizados (derecha) de grupos de vGAT b y gefirina c formados en dendritas positivas para MAP2, cuando se tratan con DMSO solo (control), PTX 100 µM o CGP55845 10 µM. d Formas de onda mIPSC representativas (arriba) y frecuencia o amplitud del evento (abajo) trazadas como distribución acumulativa (izquierda) con gráficos de resumen (derecha), para neuronas de control frente a neuronas tratadas con PTX (a largo plazo). Los cultivos se lavaron minuciosamente con solución de baño antes de los registros electrofisiológicos; CNQX se utilizó para detener los EPSC. e Trazas de ejemplo (arriba) de corrientes de GABAAR producidas por bocanadas de GABA 1 mM y transferencia de carga total (abajo). f Imágenes de muestra (izquierda) de neuronas de control frente a neuronas tratadas con PTX (puntas de flecha), como inmunoteñidas para epítopos extracelulares de GABAAR superficiales y MAP2 dendríticas. Las regiones encuadradas se magnifican (recuadros recortados, arriba a la derecha), se trazan la densidad normalizada y los tamaños de los grupos de GABAAR (abajo a la derecha), para el control frente al tratamiento con PTX. Todos los datos resumidos son medias ± SEM, con el número total de células registradas (electrofisiología) o campo de visión analizado (imágenes)/lotes independientes, y los puntos de datos individuales se incluyeron como círculos abiertos. Se predijo una distribución casi normal para la mayoría de los conjuntos de datos, según los valores de asimetría o curtosis (-2 >≈ y ≈ < 2). Por lo tanto, la significación estadística se evaluó principalmente mediante la prueba t de Student, no pareada, de dos colas, con ***P < 0,005; *P < 0,05; ns = no significativo, P > 0,05. Los grupos múltiples (b y c) se compararon mediante la prueba de Kruskal-Wallis emparejada con la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica post-hoc, y se informaron los valores P correspondientes.

Para evaluar más a fondo los efectos sobre las propiedades funcionales de las sinapsis GABAérgicas, examinamos la localización superficial y sináptica de los GABAAR. Lavamos PTX y ejecutamos grabaciones de abrazadera de voltaje en medios libres de drogas. De acuerdo con la reducción en el número de sinapsis GABAérgicas, las neuronas tratadas con PTX ilustraron un déficit significativo en la frecuencia de mIPSC sin cambiar su amplitud, cinética de eventos o propiedades intrínsecas de la membrana celular (Fig. 5d y Fig. Suplementaria S7d, e). Para evaluar si este fenotipo se debió a un menor tráfico superficial de GABAAR, aplicamos GABA exógeno por presión-perfusión, pero no notamos ningún efecto sustancial en la transferencia de carga de GABAAR, lo que implica un nivel similar de receptores en la superficie celular (Fig. 5e). Sin embargo, el tratamiento con PTX a largo plazo disminuyó la densidad de los grupos de GABAAR dendríticos sin afectar sus tamaños (Fig. 5f). Por lo tanto, la activación persistente de GABAAR pero no de GABABR regula las propiedades de desarrollo y/o el mantenimiento de las sinapsis GABAérgicas inducidas por V57.

A continuación, investigamos si los fenotipos GABAérgicos mediados por V57 podrían reproducirse cuando las neuronas humanas se diferencian de las células madre distintas de las células H1-ES. Para probar esta idea, aprovechamos una línea de células madre pluripotentes inducidas isogénicas (iPS) que expresaba establemente el transgén Ngn2 tras la inducción de doxiciclina y generaba neuronas humanas con alta eficacia, que eran esencialmente glutamatérgicas y también carecían de expresión endógena de vGAT y GAD65/6733 . Inmediatamente después de la inducción neural, los infectamos con virus V57, los cultivamos conjuntamente con glía y los caracterizamos en los días 35 a 42 cuando alcanzaron una morfología extensa (Fig. 6a y Fig. S8a complementaria). La población mostró cantidades considerables de transducción de ARNm de vGAT, GAD65 y GAD67, y localización de proteínas a lo largo de sus elaborados cenadores dendríticos (Fig. 6b, c y Fig. S8b-d complementaria). Estas estructuras sinápticas enriquecidas con vGAT también reclutaron SAM postsináptica GABAérgica importante, por ejemplo, Neuroligin-2 (Figura complementaria S8e) 12,34,35.

a Imágenes de contraste de fase de células iPS (línea WTC-11, izquierda) y neuronas humanas diferenciadas (día 42, derecha). b, c RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR, b) e inmunotinciones c contra transgenes vGAT o GAD65/67 en neuronas derivadas de células iPS, comarcadas para MAP2 dendrítica, DAPI nuclear y un antígeno nuclear humano HuNu. d Muestre una imagen de superresolución de un solo plano confocal (izquierda) y los valores del coeficiente de Mander (% de área, derecha) confirman una colocalización mínima entre vGLUT frente a vGAT puncta (flechas amarillas frente a cian, respectivamente). e Trazas de ejemplo (izquierda) y relaciones de corriente-voltaje (curvas IV; amplitudes máximas en Vhold = -80 a +20 mV, con incrementos escalonados de 10 mV, derecha) de IPSC desencadenadas por bocanadas de GABA de 1 mM (flechas) en células iPS. neuronas derivadas, en condiciones control y V57. Los datos promedio se ajustan usando líneas rectas (ecuación: y = a + bx); a = 32,5 ± 10 pA, b = 22,33 ± 1,22 pA para las neuronas de control y a = 29,64 ± 18 pA, b = 27,89 ± 2,7 pA para la condición V57. f, g Trazas representativas f y frecuencias de eventos g de sPSC registradas en Vhold = −70 mV o +10 mV, en presencia de PTX o CNQX + CPP, en condiciones de control (arriba) frente a V57 (abajo), como se indica. Las marcas divididas entre trazos concatenan registros continuos de las mismas neuronas; sEPSC (flechas azules) o sIPSC (flechas rojas). h Trazas de ejemplo (izquierda) y amplitudes promedio de mIPSC insensibles a TTX (derecha) registradas en Vhold = −70 mV o +10 mV, en presencia de CNQX + CPP, de neuronas derivadas de células iPS transducidas con factores V57. i. IPSC evocadas generadas por estimulación repetitiva de alta frecuencia en condición V57; trazas superpuestas (izquierda) con liberación síncrona confiable y componente prominente de liberación retardada (recuadro, puntas de flecha con recuadro punteado ampliado) después de que finalizó el tren de estimulación (serie de flechas); amplitudes IPSC promedio y depresión a corto plazo en diferentes Vhold, como se indica (derecha). Los valores promedio se proporcionan como medios ± SEM, con el número total de células registradas (para electrofisiología) o el campo de visión analizado (imágenes)/lotes independientes, o solo el número de lotes (b). Todos los puntos de datos acoplados experimentalmente se proporcionan como círculos abiertos del mismo color con líneas conectadas. Las distribuciones de datos fueron aproximadamente normales (datos de origen), para los valores de asimetría y curtosis -2 >≈ y ≈ < 2. La significación estadística se evaluó mediante la prueba t de Student pareada de dos colas, con ***P < 0,005; *P < 0,05; ND = eventos no detectados.

Al igual que en las neuronas derivadas de células H1-ES, las inmunotinciones conjuntas para vGLUT frente a vGAT o Homer frente a gefirina en estas neuronas derivadas de células iPS también revelaron muy pocas coubicaciones entre dos tipos de sinapsis diferentes, lo que nuevamente sugiere que glutamatérgico frente a GABAérgico. las especificaciones ocupan zonas presinápticas y postsinápticas mutuamente excluyentes (Fig. 6d y Fig. complementaria S8f, g). Las bocanadas de GABA exógenas demostraron IPSC internas considerables en Vhold ≈ −70 mV que se revirtieron alrededor de ≈ 0 mV, lo que nuevamente confirma la presencia de GABAAR superficiales también en neuronas derivadas de células iPS sin o con coexpresión V57 (Fig. 6e). En registros continuos de las mismas neuronas en la condición de control, los tratamientos con CNQX junto con el bloqueador del receptor NMDA (NMDAR) 3-carboxipiperazina-propilácido fosfónico (CPP) silenciaron la mayoría de las corrientes sinápticas independientemente de la Vhold, lo que corrobora su identidad glutamatérgica pura (Fig. 6f, g). En las células V57, la aplicación sucesiva de PTX y CNQX + CPP inhibió respectivamente las sIPSC y las sEPSC, lo que atestigua la coexistencia de sinapsis glutamatérgicas y GABAérgicas (Fig. 6f, g). Además, manteniendo las neuronas V57 a -70 mV, pero no a +10 mV (es decir, cerca del potencial de inversión de Cl estimado, ECl ≈ +14 mV, en la configuración de célula completa sin tener en cuenta el potencial de unión), representó mIPSC auténticos incluso en presencia de TTX, así como desencadenaron IPSC evocados confiables con liberación retardada robusta y plasticidad pronunciada a corto plazo (Fig. 6h, i). Por lo tanto, nuestro enfoque fue altamente reproducible en la generación de sinapsis GABAérgicas humanas completamente operativas in vitro, independientemente de las líneas de células madre reprogramadas.

A continuación, nuestro objetivo fue investigar si los factores V57 pueden producir sinapsis GABAérgicas funcionales también en animales vivos. Para este experimento de prueba de principio, intentamos usar un modelo de sinapsis glutamatérgica basado en dos criterios de selección: (i) el sitio de inyección viral (es decir, los cuerpos celulares de las neuronas presinápticas) está físicamente distante del sitio de grabación (es decir, cuerpos celulares de las neuronas postsinápticas), y (ii) la neurona postsináptica recibe entradas GABAérgicas insignificantes de otras fuentes. Estas restricciones fueron necesarias para garantizar que la transducción viral de los factores V57 se dirija principalmente a la neurona presináptica glutamatérgica deseada, sin potenciar indirectamente ninguna entrada GABAérgica local a la célula postsináptica.

Con este fin, inyectamos partículas de virus en el ganglio espiral del ratón, que da lugar a fibras del nervio auditivo (AN) que proyectan salidas puramente glutamatérgicas (también conocidas como "bulbo terminal de Held") principalmente en los cuerpos celulares de las células arbustivas (BC). ), ubicado a distancia en el núcleo coclear (Fig. 7a)36,37. Realizamos inyecciones lentivirales de factores V57 en los días 2 a 4 posnatales (P2 a 4), preparamos cortes de cerebro y los analizamos en P18 a 32, es decir, cuando un virus de control que codifica RFP mostró una transducción sustancial en el sitio de la inyección (Fig. S9a complementaria). , b). Los BC carecen de una entrada GABAérgica bien definida y reciben principalmente bulbos terminales glutamatérgicos positivos para calretinina de alrededor de 4 a 5 fibras AN o terminales glicinérgicos positivos para vGAT de las interneuronas locales, que forman sinapsis físicamente separadas entre sí (Fig. 7b)38 ,39,40,41. Sin embargo, los animales transducidos con factores V57 demostraron un aumento destacado en la colocalización entre las señales de calretinina y vGAT, lo que indica una inducción exitosa de transgenes dentro de las terminales de fibra AN (Fig. 7b, c). Es de destacar que la eficiencia de transducción in vivo de lentivirus fue relativamente escasa en comparación con nuestro enfoque in vitro (ver Fig. 3c, d) y no alteró significativamente el tamaño del bulbo terminal (Fig. 7b, c).

un diagrama esquemático muestra la estrategia experimental para manipular la identidad del transmisor de la sinapsis del bulbo final. b Imágenes representativas de somas BC (círculos cian) rodeados de calretinina y terminales presinápticos positivos para vGAT, en control (izquierda) frente a animales inyectados con V57 (derecha). Las señales vGAT a menudo se superponían con terminales de bulbo terminal positivos para calretinina en la condición V57 (flechas amarillas), pero mínimamente para la condición de control (flechas blancas). c Tamaño promedio de los terminales AN medidos con señales de calretinina (izquierda), área del bulbo terminal coocupada por la señal vGAT (centro) y fracción de bulbos terminales que expresan vGAT (derecha), presumiblemente inducida por los factores V57. d, e Rastros de muestra d y distribución de frecuencia de decaimientos τ e de sEPSC (puntas de flecha azules e histograma) y sIPSC (puntas de flecha rojas e histograma) registrados en condiciones de control (izquierda) frente a V57 (derecha). Inserciones en e, muestras de trazas sEPSC y sIPSC escaladas y superpuestas para comparar su cinética de eventos. Todos los registros se realizaron en presencia de estricnina 1 µM para suprimir las sIPSC de las entradas glicinérgicas locales. f, g Gráficas de probabilidad acumulada y gráficos de barras promedio de frecuencia de eventos (izquierda) y amplitudes (derecha), para sEPSC mediadas por AMPAR para sIPSC mediadas por GABAAR g. h Trazas de ejemplo de PSC evocadas (artefactos de estímulo reemplazados por flechas grises), registradas desde el control (izquierda) frente a la condición V57 (derecha), después del tratamiento agudo con estricnina 1 µM (trazas azules) o después de las adiciones de NBQX + 10 µM CPP 5 µM (trazas rojas) y Bicuculline 20 µM (trazas negras). Puntas de flecha, EPSC (azul) o IPSC (rojo). i Los gráficos circulares representan la fracción de celdas con tipos de PSC indicados (ya sea solo EPSC, solo IPSC o ambos). j Amplitudes de EPSC evocadas (izquierda) e IPSC (derecha), promediadas a partir de neuronas con respuestas exitosas. Los promedios indican la media ± SEM, con el número total de campos de visión analizados (para imágenes) o neuronas parcheadas (para registro de pinza de parche) / número de animales inyectados y puntos de datos individuales (círculos abiertos codificados por colores). La significación estadística se probó mediante la prueba t de Student no pareada de dos colas (resultados casi distribuidos normalmente) o la prueba U no paramétrica de Mann-Whitney de dos colas, con ***P < 0,005; **P < 0,01; *P < 0,05; ns = no significativo, P > 0,05.

Para determinar si las expresiones ectópicas de V57 en bulbos terminales glutamatérgicos pueden desencadenar la formación de sinapsis GABAérgicas funcionales, llevamos a cabo registros de fijación de voltaje de BC postsinápticos en presencia de estricnina que inhibe preferentemente los receptores de glicina (GlyR) sobre los GABAAR. En la condición de control, los BC exhibieron principalmente sEPSC con decaimientos de τ rápidos, mientras que la inducción V57 provocó un aumento profundo en los sIPSC con decaimientos de τ más lentos (Fig. 7d, e). La transducción de mosaico mediada por lentivirus de los factores V57 no cambió ni la amplitud ni la frecuencia de los sEPSC, pero elevó sustancialmente la frecuencia de sIPSC sin afectar la amplitud de sIPSC (Fig. 7f, g).

Finalmente, inspeccionamos los PSC de los BC evocados por la estimulación AN presináptica. En los animales de control, las PSC evocadas insensibles a la estricnina mostraron una cinética de descomposición rápida y fueron bloqueadas en gran medida por el tratamiento agudo del antagonista de AMPAR NBQX (Fig. 7h, i). Sin embargo, los animales transducidos por factores V57 a menudo mostraban la presencia conjunta de un componente IPSC más lento que solo podía ser inhibido por el bloqueador GABAAR Bicuculline (Fig. 7h, i). Varios BC en la condición V57 también manifestaron IPSC predominantemente evocados sin ningún EPSC detectable, un fenómeno que nunca se observó en la condición de control (Fig. 7i). Cuando se promedió de BC solo con cualquier respuesta medible, la inducción de V57 elevó significativamente la amplitud de los IPSC evocados sin alterar los EPSC (Fig. 7j). Por lo tanto, los factores V57 pueden desencadenar con éxito la formación de sinapsis GABAérgicas funcionales también en un sistema in vivo.

El sistema nervioso central de los mamíferos contiene diferentes tipos de sinapsis que liberan y detectan una variedad de neurotransmisores. La capacidad de sintetizar y transmitir estas distintas sustancias químicas a menudo requiere conjuntos de enzimas mutuamente excluyentes, así como transportadores vesiculares que se expresan endógenamente en ciertos linajes neuronales. Una vez que se establecen los destinos neuronales durante el desarrollo temprano, el tipo de transmisor producido por una neurona presináptica se considera estable e irreversible. Dado que la identidad del transmisor es una característica inherente de subtipos neurales específicos, todas las conexiones sinápticas formadas entre un par dado de neuronas son generalmente homotípicas, por ejemplo, glutamatérgicas o GABAérgicas, que no suelen cambiar con el tiempo42,43.

Aquí ilustramos que la expresión ectópica de vGAT + GAD65 + GAD67 puede asignar una identidad GABAérgica robusta en neuronas humanas y de ratón exclusivamente glutamatérgicas. Esta liberación presináptica de GABA fue capaz de activar los GABAAR postsinápticos y produjo sinapsis GABAérgicas completamente funcionales que manifestaron IPSC en miniatura y dependientes de AP de buena fe con plasticidad pronunciada a corto plazo (Figs. 1 y 2). Estos fenotipos GABAérgicos fueron altamente reproducibles en múltiples líneas celulares, tanto para sistemas in vitro como in vivo (Figs. 6 y 7). La reprogramación directa del tipo de transmisor no alteró el número total de sinapsis, pero provocó una reorganización en las estructuras pre/post-sinápticas (Fig. 3). Las sinapsis GABAérgicas inducidas se formaron independientemente de las sinapsis glutamatérgicas vecinas, pero mostraron una cinética de maduración similar y dependían parcialmente de la actividad GABAAR (Figs. 4 y 5). En resumen, nuestro enfoque instituyó una vía fácil para inducir sinapsis funcionales mediante la síntesis de transmisores de novo (Figura complementaria S10a).

Nuestros hallazgos son completamente consistentes con un informe anterior que indica que la capacidad de liberar glutamato frente a GABA por parte de diferentes subtipos neuronales podría depender principalmente de su expresión diferencial de enzimas específicas del transmisor y transportadores vesiculares44. Una vez producidas, las vesículas que contienen diferentes transmisores pueden no requerir necesariamente mecanismos de liberación especializados únicos para diferentes tipos de sinapsis. De acuerdo con esta teoría, estudios anteriores también han descrito la cotransmisión de diferentes sustancias químicas desde las mismas neuronas y, a veces, incluso desde las mismas terminales presinápticas con sitios de liberación separados espacialmente pero morfológicamente similares21,23,45,46,47,48,49 .

Curiosamente, aunque las neuronas que expresan V57 sintetizaron glutamato y GABA, produjeron eventos mEPSC y mIPSC mutuamente excluyentes con cinéticas distintas. Estos, a su vez, podrían ser inhibidos individualmente por bloqueadores selectivos de receptores sin atenuar la frecuencia de otros tipos de eventos (Figs. 1, 2, 6 y 7). Estos resultados implican que el glutamato y el GABA se cotransmiten pero probablemente no se coliberan simultáneamente para coactivar sus correspondientes receptores. Además, los marcadores presinápticos y postsinápticos que etiquetan las sinapsis glutamatérgicas frente a las GABAérgicas también manifestaron una colocalización limitada (Figs. 3 y 6, y Figs. Suplementarias S5, S8f, g), lo que indica que están segregados físicamente (Fig. Suplementaria S10b) . Nuevamente, se observó un fenómeno similar in vivo para diferentes cotransmisores, que a menudo se distribuyen en vesículas sinápticas separadas y se liberan de forma independiente45,47,50.

¿Cómo facilita la liberación presináptica de GABA la creación de sinapsis funcionales? Hallazgos recientes sugieren que la activación de los GABAAR puede desempeñar un papel fundamental en esta vía, ya que se ha demostrado que la eliminación genética de las subunidades del GABAAR o la inhibición farmacológica con antagonistas específicos altera la formación de sinapsis GABAérgicas20,27. Aunque de acuerdo con esta noción, la exposición a PTX a largo plazo también redujo la densidad de las sinapsis GABA-érgicas inducidas por V57, pero no las eliminó por completo (Fig. 5). Además, aunque los factores V57 elevaron la densidad de las postsinapsis GABAérgicas, un nivel sustancial de grupos de gefirina y GABAAR ya estaban presentes incluso en las neuronas de solo Ngn2, que carecen de liberación presináptica de GABA. Por lo tanto, mecanismos celulares adicionales también podrían contribuir al desarrollo de sinapsis GABAérgicas. Por ejemplo, los GABAAR interactúan directamente con las neurexinas presinápticas y también pueden ensamblarse potencialmente en complejos moleculares con neuroliginas postsinápticas, gefirina o colibistina para establecer una alineación pre y postsináptica con o sin liberación de GABA34,51,52. Alternativamente, las moléculas de GABA pueden unirse a elementos transinápticos aún desconocidos para permitir la sinaptogénesis inhibidora. Es de destacar que, de manera similar a las sinapsis GABAérgicas, la activación de los receptores de glicina (GlyR) también puede promover su agrupación sináptica en las neuronas espinales, lo que podría estar mediado a través de vías de señalización celular comunes aguas abajo de la activación del receptor53.

Previamente, se demostró que las interrupciones de los mecanismos de liberación presináptica tienen efectos menores o nulos sobre la sinaptogénesis, así como sobre la formación de espinas dendríticas y su mantenimiento54,55,56,57. Vale la pena reconocer que, aunque estos elegantes enfoques genéticos eliminaron la gran mayoría de las actividades sinápticas, sigue siendo plausible que un nivel mínimo de señal de transmisor basal, por ejemplo, liberación espontánea residual, sea suficiente para instituir la identidad sináptica. Incluso en ausencia de una liberación neuronal, la secreción difusa del transmisor de las células locales de la astroglía también puede desencadenar la activación del receptor sináptico58. Alternativamente, las proteínas presinápticas asociadas con la producción enzimática y/o el empaquetamiento vesicular de diferentes neurotransmisores podrían interactuar directa o indirectamente con otras moléculas sinápticas y participar en procesos sinaptogénicos, incluso en ausencia de una liberación activa del transmisor. Las contribuciones de la activación de los receptores sinápticos en la formación de sinapsis glutamatérgicas también siguen siendo controvertidas. Aunque se demostró que la activación persistente de los receptores ionotrópicos de glutamato facilita el crecimiento de la columna59,60,61, la eliminación de todas las subunidades AMPAR y NMDAR no afectó la distribución de vesículas presinápticas ni la morfología postsináptica62. Por lo tanto, múltiples vías paralelas podrían modular el desarrollo de la sinapsis glutamatérgica, y estos mecanismos podrían diferir significativamente de la sinaptogénesis GABAérgica. Se necesitan estudios futuros para investigar estas diversas posibilidades.

Utilizando glutamato y GABA uncaging, estudios anteriores informaron que la liberación aguda de neurotransmisores en sí misma puede facilitar la formación de sinapsis naciente, de una manera espacialmente delimitada26,27. Aquí demostramos que, en el contexto fisiológicamente relevante de la liberación vesicular presináptica, tales sinapsis inducidas por transmisores pueden lograr una maduración morfológica y funcional mucho mayor. En comparación con los métodos de fotoestimulación, las estructuras sinápticas GABAérgicas inducidas por V57 lograron un crecimiento sustancial en su densidad y tamaño, y mostraron IPSC confiables con alta reproducibilidad, lo que lo hace apto para una modificación estable, eficiente y extensa de la identidad de la sinapsis. Nuestro protocolo también tuvo éxito tanto en el modelo in vitro de cultivos neuronales humanos como en el cerebro de ratón in vivo y, por lo tanto, podría adoptarse potencialmente para manipular circuitos afectados por adicciones o trastornos mentales.

Usando la diferenciación celular mediada por moléculas pequeñas y la detección de factores de transcripción, nosotros y otros hemos derivado previamente neuronas GABAérgicas directamente de células ES63,64,65,66,67. Estas neuronas diferenciadas o reprogramadas expresan varios marcadores y exhiben propiedades AP que imitan los subtipos de neuronas GABAérgicas autóctonas del cerebro humano. Aunque nuestro enfoque actual no genera linajes neurales específicos, las sinapsis GABAérgicas producidas por factores V57 manifiestan de manera similar IPSC en miniatura y evocados robustos con amplitud y frecuencia comparables, que maduran con el tiempo y pueden utilizarse para ensayos in vitro. La transducción viral de enzimas GABAérgicas también ofrece ciertas ventajas sobre las neuronas GABAérgicas inducidas por factores de transcripción, especialmente para sus aplicaciones in vivo. Cuando se trasplantan al cerebro, las neuronas reprogramadas a veces luchan contra la supervivencia a largo plazo, la falta de maduración funcional, la migración restringida y la integración sináptica limitada en los circuitos neuronales preexistentes63,64,65. La entrega viral de factores V57 puede eludir algunos de estos problemas técnicos al formar nuevas sinapsis GABAérgicas en poblaciones neuronales ya disponibles.

Todos los métodos de cultivo celular, así como los procedimientos de producción de lentivirus, fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad (protocolo IRB n.º 19-059B) de la Universidad Estatal de Colorado. Todos los experimentos en ratones (incluidos machos y hembras, cepa JAX CBA/CaJ) fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (protocolo IACUC n.° 201800101) de la Universidad de Buffalo y se realizaron de acuerdo con las pautas éticas.

Se adquirieron células ES humanas (línea H1, nº de catálogo WA01) del WiCell Research Institute en virtud de un acuerdo de transferencia de material (MTA nº 19-W0439). La línea celular iPS humana (WTC-11) fue generosamente donada por el Dr. Michael E. Ward, Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS). Las células 293T de riñón embrionario humano (HEK) para la producción de virus estaban disponibles comercialmente de Takara Bio USA (catálogo # 632180).

Las construcciones lentivirales utilizadas para la reprogramación neuronal de células ES humanas incluyeron Ngn2-t2A-PuromycinResistance (promotor Tet-on) y rtTA (promotor de ubiquitina), con un virus opcional que codifica EGFP (promotor Tet-on) para análisis morfológicos31. Los ADNc que codifican vGAT, GAD65 y GAD67 humanos (factores V57) se clonaron en un vector lentiviral impulsado por el promotor Synapsin-1 humano (consulte la Fig. S8b complementaria), seguido de un elemento regulador de marmota (WRE) y flanqueado por 5 'y Repeticiones terminales largas (LTR) de 3'.

Tres plásmidos auxiliares (es decir, pRSV-REV, pMDLg/pRRE y VSV-G; 7–8 µg cada uno) y los vectores de expresión correspondientes (15–20 µg) se cotransfectaron con polietilenimina (PEI) en 70–80 % de confluencia. Células HEK 293T (que contienen antígeno T SV40 para facilitar la producción de virus) sembradas en placas de 10 cm. A las 8-10 h después de la transfección, el medio de cultivo se cambió por completo y el sobrenadante que contenía partículas de lentivirus se recogió después de 36 h y 60 h. Luego, el sobrenadante se reunió y se centrifugó a ~ 800 × g durante 6 a 8 minutos para eliminar los restos de células HEK. Luego, el sobrenadante se centrifugó a ~ 120 000 × g durante 2 h a 4 ° C (ultracentrífuga Beckman L8–70M equipada con rotor SW41Ti). Los sedimentos virales se resuspendieron en ~50-100 µl de medio DMEM, se almacenaron durante la noche a 4 °C, posteriormente se dividieron en alícuotas y se congelaron a -80 °C antes del uso experimental.

Tanto las células H1-ES humanas (véanse las Figs. 1–5) como una línea celular iPS isogénica con transgén Ngn2 inducible por doxiciclina (WTC-11; véase la Fig. 6)33 se mantuvieron en medios mTeSR™1/mTeSR™ Plus ( StemCell Technologies) en condiciones sin alimentador. Los medios se cambiaron todos los días. Cuando la densidad celular alcanzó ~70 %, se disociaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) + EDTA 0,5 mM y se colocaron en placa a una dilución 1:6 en pocillos recubiertos con Matrigel (BD Bioscience). Durante el pase, los cultivos se complementaron adicionalmente con el inhibidor de ROCK Y-27632 (2,5 μM, MedChem Express) durante la noche, pero se excluyeron para cambios de medios posteriores.

Para las células H1-ES, la conversión neuronal directa mediada por Ngn2 se logró como se describió antes31,32. En resumen, las células ES se coinfectaron con lentivirus que codifican rtTA y Ngn2-t2A-PuromycinResistance, se indujeron con doxiciclina (2 μg/ml), se seleccionaron con puromicina (1 μg/ml), se disociaron suavemente con PBS + EDTA o accutase (Innovative Cell Technologies) y se volvió a sembrar con glía primaria de ratón (pasaje 1–2, derivado de ratones CD-1 ® IGS) en cubreobjetos recubiertos con Matrigel (ver Fig. 1a). Se adoptó una estrategia similar para las neuronas derivadas de células iPS, que se reprogramaron directamente mediante la exposición a la doxiciclina (consulte la Fig. S8a complementaria)33. Las neuronas se infectaron adicionalmente con lentivirus que expresaban los factores V57 durante o inmediatamente después de la diferenciación, como se muestra en los cronogramas del protocolo, y se usó un virus hecho a partir del vector pFSW-67 vacío como control de la infección.

Del día 0 al 14, las neuronas se cultivaron en medio N3 (DMEM/F12 [Thermo Fisher] + N2 [Thermo Fisher] + B27 [Thermo Fisher]), suplementado con insulina [20 μg/ml, Sigma], penicilina/estreptomicina [ Thermo Fisher]). Durante el cocultivo de glía, se incluyó suero bovino fetal al 2-2,5 % (FBS, Atlas Biologicals). Los medios se cambiaron a la mitad cada 3 o 4 días y, además, se complementaron con 5-fluorodesoxiuridina (FdU, 10 µM) para inhibir el crecimiento glial después de alcanzar una confluencia del 70 al 80 %. Desde el día 15 en adelante, el medio N3 fue reemplazado gradualmente por medio Neurobasal Plus [Thermo Fisher] + B27 + penicilina/estreptomicina, también complementado con FBS + FdU.

Los registros de pinzamiento de parche de células completas de neuronas humanas se realizaron de manera similar a la descrita antes67,68. En resumen, las neuronas se parchearon usando una solución interna que contenía (para sujeción de voltaje, en mM) 135 CsCl2, 1 EGTA, 1 NaGTP, 2 QX-314 y 10 HEPES-CsOH (pH 7,4, 310 mOsm); o (para pinza amperimétrica, en mM) 130 KCl, 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,5 EGTA, 0,16 CaCl2, 4 Na2ATP, 0,4 NaGTP, 14 Tris-creatina fosfato y 10 HEPES-KOH (pH 7,3, 310 mOsm). La solución de baño extracelular contenía (en mM) 140 NaCl, 5 KCl, 3 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glucosa y 10 HEPES-NaOH (pH 7,4, 300 mOsm). Todas las grabaciones se realizaron a temperatura ambiente, utilizando un amplificador de abrazadera de parche integrado (IPA, Sutter Instruments) controlado por el sistema personalizado de adquisición de datos Igor Pro 8 (WaveMetrics). Para todas las células, la calidad del parche se controló utilizando valores de resistencia en serie (Rs < 15 MOhm), que no se alteraron significativamente entre los grupos experimentales. Los registros de abrazadera de voltaje para AMPAR EPSC y GABAAR IPSC se realizaron a un Vhold de −70 mV, a menos que se indique lo contrario (Fig. 6). Las PSC evocadas se activaron mediante estimulaciones de campo utilizando un electrodo de matriz (FHC, MX21AEW-RT2) conectado a un estimulador de pulso aislado A365RC (World Precision Instruments). Las PSC mediadas por AMPAR o GABAAR se aislaron usando PTX (100 μM; bloqueador GABAAR/GlycineR, Tocris Bioscience) o CNQX (25 μM; bloqueador AMPAR; Tocris Bioscience), respectivamente. Aunque todos los registros de fijación de voltaje en Vhold = −70 mV contenían Mg2+ extracelular para bloquear los NMDAR, algunos experimentos en Vhold = +10 mV (ver Fig. 6) también incluyeron CPP (50 μM; inhibidor de NMDAR; Tocris Bioscience). Se agregó tetrodotoxina (TTX; 2 μM; Ascent Scientific) a la solución externa durante todas las grabaciones mEPSC y mIPSC en miniatura, para evitar la liberación presináptica causada por AP espontáneos. Se realizó una perfusión a presión de AMPA 1 mM (bromhidrato RS-AMPA, Tocris Bioscience) o GABA 1 mM (Tocris Bioscience) durante 100 ms, con bocanadas de 20 psi usando Picospritzer III (Parker Instrumentation), y las transferencias de carga totales se calcularon dentro de los 30 s de la aplicación de soplo.

Para la Fig. 5b-f, las células se incubaron con antagonista de GABAAR PTX (100 μM) o antagonista de GABABR CGP55845 (10 μM, Tocris Bioscience) o DMSO (control) inmediatamente después de co-placar con glía, en el día posterior a la inducción 4–5. Los medios se intercambiaron a la mitad cada dos días con dosis equivalentes de medicamentos, y las células se analizaron en los días 56 a 60 (Fig. 5a). Para la inmunotinción, los cultivos se lavaron 3 o 4 veces con PBS, se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4 % a temperatura ambiente y se procesaron para la incubación de anticuerpos (ver más abajo). Para el parcheo de células enteras, las neuronas se lavaron a fondo 3 × 2 min con solución de baño antes de la grabación.

El método de inyección lentiviral in vivo en la ventana redonda del ratón se adoptó de protocolos anteriores utilizando modificaciones menores69,70. En resumen, se hicieron pequeñas incisiones ~ 1 cm caudal al pabellón auricular de ratones neonatales (P2-P4), y se expuso la bulla timpánica para revelar la ventana redonda debajo (ver la Fig. S9a complementaria). La bulla timpánica se puncionó con una aguja de calibre 34 y se dejó drenar durante al menos 10 min. Aproximadamente 0,3 µl de lentivirus (un cóctel de 0,1 µl de GAD65, 0,1 µl de GAD67 y 0,1 µl de vGAT) o AAV-crimson/RFP (control) se inyectaron lentamente en la ventana redonda utilizando una jeringa Hamilton de 5 µl con una jeringa extraíble de calibre 34. Aguja, bisel de 12° de 0,375". Tenga en cuenta que un volumen de inyección más alto podría provocar un derrame de líquido, una interrupción del acueducto coclear y una fuga en el líquido cefalorraquídeo. Después de retraer la aguja, se suturó el área quirúrgica y se devolvieron las crías a su lugar. jaulas caseras. Los animales adultos se sacrificaron después de 2 a 4 semanas de infección viral, y se prepararon cortes de cerebro para experimentos electrofisiológicos o de imágenes. Las sinapsis del bulbo terminal se desarrollan rápidamente después del nacimiento, alcanzan la maduración morfológica y funcional en ~ 3 semanas71,72,73,74 .

Los ratones se anestesiaron con 200 mg/kg de ketamina más 10 mg/kg de xilazina, luego se sacrificaron, se extrajeron los cerebros y se colocaron en una solución de sacarosa helada (en mM: 76 NaCl, 75 sacarosa, 25 NaHCO3, 25 glucosa, 2,5 KCl , 1,25 NaH2PO4, 7 MgCl2, 0,5 CaCl2). Las secciones sagitales (142 μm) se cortaron con un vibratomo (Leica VT1200) y luego se incubaron en una solución de registro estándar (en mM: 125 NaCl, 26 NaHCO3, 20 glucosa, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,5 MgCl2, 1,5 CaCl2, 4 Na L-lactato, 2 Na-piruvato, 0,4 Na L-ascorbato, burbujeado con 95 % O2 - 5 % CO2) a 34 °C durante 20 min. Posteriormente, los cortes se mantuvieron a temperatura ambiente hasta el momento del registro. Durante el registro, se añadió estricnina 1 µM para inhibir las IPSC glicinérgicas espontáneas, NBQX 10 µM y CPP 5 µM para bloquear respectivamente las EPSC mediadas por AMPAR y NMDAR, y bicuculina 20 µM para bloquear las IPSC GABAérgicas. Se realizaron grabaciones de abrazadera de voltaje de celda completa a partir de BC en rebanadas de AVCN utilizando pipetas de parche de borosilicato de resistencia 1.3–2.3 MΩ. Las pipetas se llenaron con una solución interna que contenía (en mM): 35 CsF, 100 CsCl, 10 EGTA, 10 HEPES y 1 QX-314, pH 7,3, 300 mOsm. Los BC se parchearon bajo un microscopio Olympus BX51WI con un Multiclamp 700B (Molecular Devices) controlado por una interfaz ITC-18 (Instrutech), impulsado por un software personalizado (mafPC) que se ejecuta en Igor (WaveMetrics). El baño se perfundió a 3–4 ml/min usando una bomba (403U/VM2; Watson-Marlow), con solución salina corriendo a través de un calentador en línea para mantener la temperatura a 34 °C (SH-27B con controlador TC-324B; Warner instrumentos). Los BC se mantuvieron a -70 mV con una resistencia de acceso de 5 a 15 MΩ compensada al 70 %. Los terminales presinápticos individuales del bulbo final se estimularon con un microelectrodo de vidrio colocado a una distancia de 30 a 50 µm del soma BC con corrientes de 4 a 20 µA a través de un aislador de estímulo (WPI, A360). Se aplicó estimulación presináptica cada 8 s. Para la condición V57, todos los resultados de sEPSC y sIPSC se analizaron a partir de neuronas solo con IPSC evocadas detectables.

Los cultivos neuronales humanos con o sin factores V57 se fijaron en PFA al 4 % durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, las células se bloquearon en suero cósmico de ternero (CCS) al 5–10 % durante 1 h a 37 °C, se incubaron con anticuerpos primarios (consulte la figura complementaria S3) durante 1–2 h a 37 °C mientras se balanceaban, se lavaron 4 veces con tampón de bloqueo, seguido de 1 h de incubación a 37 °C con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor (Invitrogen) 488/555/647 [488 cabra anti-ratón (A11029), 546 cabra anti-ratón (A11030), 647 cabra anti- ratón (A32728), 488 cabra anti-conejo (A11034), 546 cabra anti-conejo (A11035), 647 burro anti-conejo (A31573), 488 cabra anti-pollo (A11039), 546 cabra anti-pollo (A11040), 647 cabra anti-pollo (A21449), 488 cabra anti-cobaya (A11073), 555 cabra anti-cobaya (A21435) o 647 cabra anti-cobaya (A21450)] en diluciones 1:1000–2000. A continuación, los cultivos se lavaron 4 veces con tampón de bloqueo y PBS, y los cubreobjetos se montaron boca abajo sobre portaobjetos de vidrio utilizando Fluoromount-G (Southern Biotech). Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (1:50000; Thermo Fisher, catálogo n.º D1306) durante 5 a 10 min, cuando correspondía. La mayoría de los ensayos de inmunotinción se realizaron en un entorno permeabilizado en el que se aplicó Triton X-100 (0,1 %) al tampón de bloqueo y para todos los pasos posteriores, incluidos los lavados o las diluciones de anticuerpos. Sin embargo, para visualizar la localización de la superficie celular de los GABAAR (consulte la Fig. 5f y la Fig. S6d complementaria) y sus distribuciones en las ramas dendríticas, utilizamos un anticuerpo primario contra el epítopo extracelular de la subunidad α3 de GABAAR en condiciones no permeabilizadas (sin Triton X-100), posteriormente permeabilizada con Triton X-100 e inmunomarcada para MAP2 dendrítica.

Para las inmunotinciones del núcleo coclear, los ratones se perfundieron transcardiacamente con solución salina al 0,9 % seguida de PFA al 4 %, luego se fijaron los cerebros en PFA al 4 % durante una hora y se colocaron en sacarosa al 20 % durante la noche. La tinción de la cóclea involucró pasos adicionales, es decir, eliminarla del hueso temporal, descalcificación mediante incubación con EDTA 120 mM durante ~5 días, seguido de incrustación en gelatina 100 bloom y fijación durante la noche en PFA. Los tejidos incrustados congelados se cortaron en secciones de 50 µm usando un micrótomo, se lavaron 3 veces en PBS 0,2 M (0,9 % NaCl), se bloquearon con suero de cabra al 5 % en PBS + Triton X-100 durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. 4 ° C con anticuerpos primarios (Fig. S3 complementaria). Los cortes se lavaron 3 veces en PBS y se incubaron en una solución que contenía Alexa Fluor (Invitrogen) 568 burro anti-cabra (A11057), 594 cabra anti-conejo (A11037), 488 cabra anti-ratón (A11029) y/o 488 burro. anticuerpos secundarios anti-conejo (A21206) (1:250). A continuación, los cortes se lavaron 3 veces con PBS y se montaron en medio de montaje antidecoloración de diamante ProLong (Invitrogen, P36961).

Las imágenes confocales de neuronas humanas cultivadas se adquirieron utilizando un microscopio de barrido láser STELLARIS 5 (Leica Microsystems) invertido y se procesaron con un software Leica Application Suite versión X (LAS-X, Core_3.7.4_23463). Se obtuvieron series de proyecciones ópticas en z con un grosor óptico de ~0,5–1 µm usando un objetivo seco de 20× u objetivos de inmersión en aceite (40× o 60×). Todas las imágenes de superresolución (véanse las Figs. 3f, j, 6d y la Fig. Suplementaria S5a, b) se recopilaron (dimensión en el eje x/y/z: 0,04 × 0,04 × 0,18 μm) utilizando un microscopio Zeiss LSM 880 (Zen 2.3 black edition, software v.14.0.9.201) equipado con un objetivo plan-apocromático de inmersión en aceite de 63 aumentos (1,4 na) y un detector de fosfuro de arseniuro de galio (GaAsP) Airyscan, que informó tener una resolución espacial de 120 nm en x/y- y 350 nm en el plano z75. Las imágenes de los tejidos del cerebro del ratón, es decir, el núcleo coclear y las neuronas del ganglio espiral (consulte la Fig. 7b y la Fig. S9b complementaria), se capturaron con un microscopio confocal Olympus FV1000, con secciones en z ópticas de ~ 1,84 µm.

Todas las imágenes confocales se analizaron utilizando el software FIJI-ImageJ (NIH). Para cuantificar varios parámetros de puntos sinápticos a lo largo de los procesos neuronales, las imágenes generalmente se superpusieron como proyección z de máxima intensidad (10-20 cortes ópticos). Las señales sinápticas de las regiones de interés (ROI) se normalizaron con respecto a las áreas de neuritas correspondientes (marcadas con MAP2 o EGFP). La colocalización entre dos marcadores sinápticos se evaluó primero determinando el umbral de los canales individuales de manera adecuada para eliminar las señales de fondo de los lotes experimentales individuales y luego midiendo los coeficientes de Mander para cada sección óptica dentro del complemento JACoP. Para imágenes de súper resolución, se utilizaron módulos de procesamiento y análisis dentro del software ZEN 2.3 (edición azul) (v.2.3.69.1000) para extraer perfiles de máxima intensidad y medir las intensidades de fluorescencia.

Las neuronas humanas derivadas de células iPS del control frente a la condición V57 se lavaron con PBS y se recogieron en 500 µl de reactivo TRIzol. Inmediatamente, se agregaron 250 μl de cloroformo al lisado celular, se agitó vigorosamente, se centrifugó a 12 000 × g durante 15 min, se recolectó la fase acuosa y se precipitó el ARN agregando 250 μl de isopropanol y centrifugando a 12 000 × g durante 10 min. Luego, los sedimentos de ARN se lavaron con etanol al 70 %, se secaron al aire y se disolvieron en agua nanopura. El cDNA se generó a partir de 300 a 800 ng de RNA total utilizando la SuperMix de síntesis de la primera hebra SuperScript III de Invitrogen (n.º de catálogo 11752–050, Thermo Fisher Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. La PCR cuantitativa (qPCR) se realizó en una máquina CFX-96 (Bio-Rad) utilizando SYBR Green Master Mix (n.º de catálogo RK21203, ABclonal). Todos los conjuntos de cebadores se diseñaron para abarcar entre dos exones adyacentes, y se usó GAPDH humana como control interno (consulte la Fig. S8c, d complementaria).

Los resultados de secuenciación de ARN de neuronas humanas inducidas por Ngn2 (Fig. S1c complementaria) fueron depositados previamente por nosotros en la base de datos de los NIH (repositorio GEO, número de acceso GSE129241 [https://www-ncbi-nlm-nih-gov.ezproxy.u -pec.fr/geo/query/acc.cgi?acc=GSE129241])32, y están disponibles públicamente.

Días 56–60 Las neuronas NV57 se recogieron mediante raspado y se lisaron en tampón RIPA (NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Tris 25 mM pH 7,4, sustituto de Nonidet P-40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %) complementado con cóctel inhibidor de proteasa HaltTM (PIC, Thermo Scientific, catálogo n.º 78429). Los lisados ​​se mezclaron a 3:1 con tampón de carga de dodecilsulfato de sodio (SDS) 4x, se procesaron en gel de poliacrilamida al 7,5 % (PAGE) y luego se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) al 3 % en solución salina tamponada con Tris (TBS + Tween-20 al 1 %) durante 2 a 3 h a temperatura ambiente y se inmunoteñeron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios. Posteriormente, las membranas se tiñeron con anticuerpos secundarios fluorescentes (1:2000 en TBS + Tween-20) durante 2 a 3 h a 37 °C, se tomaron imágenes con el sistema LI-COR Odyssey CLx y se analizaron con el software Image Studio Lite (versión 5.2).

Para todos los resultados experimentales, los valores promedio se presentaron como X/Y, donde 'X' representa el número total de neuronas registradas (para electrofisiología) o campos de visión analizados (para imágenes) del número 'Y' de lotes independientes ( para neuronas humanas) o animales (cortes de cerebro de ratón). Todos los datos promedio indican medias ± SEM (desviación estándar [SD] de un parámetro dividida por la raíz cuadrada del número de muestras). Todas las muestras se eligieron al azar y no se excluyó ningún dato del análisis. Se usaron al menos > = 3 réplicas biológicas y se seleccionaron tamaños de muestra para que SEM ≈ < 1/10 de sus respectivas medias para la mayoría de los conjuntos de datos. Excepto los higos. 3 y 5, los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos o las evaluaciones de resultados, porque muchos ensayos requerían un conocimiento previo de la identidad del fármaco durante las aplicaciones agudas (Figs. 1, 2, 6 y 7), combinaciones de transgenes (Figs. 1 y 7) , o recolección y procesamiento de muestras en intervalos de tiempo específicos (Fig. 4).

Los valores numéricos de todos los paneles de figuras (tanto principales como complementarios) se proporcionan como un archivo de datos de origen. Para conjuntos de datos con una distribución casi normal (es decir, con valores de asimetría y curtosis −2 > ≈ y ≈ < 2), las evaluaciones estadísticas entre condiciones se realizaron utilizando la prueba t de Student no pareada (pareada para comparaciones por lotes), de dos colas (** *P < 0,005, **P < 0,01, *P < 0,05, ns = no significativo, P > 0,05); de lo contrario, se realizó la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica de dos caras como se menciona en las leyendas de las figuras correspondientes. Para todas las evaluaciones grupales, se informaron los valores P de ANOVA de un solo factor (para una distribución de datos casi normal) o la prueba de Kruskal-Wallis (para desviaciones considerables de la distribución normal).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de origen se proporcionan con este documento (consulte el archivo de Excel). Estos incluyen todos los puntos de datos individuales y los valores promedio presentados tanto en el manuscrito principal (Figs. 1–7) como en la información complementaria (Figs. S1–S10). Los datos sin procesar para los experimentos de imágenes y electrofisiología están disponibles de los autores correspondientes, previa solicitud razonable. El conjunto de datos de secuenciación de ARN de las neuronas Ngn2 se puede obtener del repositorio GEO disponible públicamente (número de acceso GSE129241), tal como lo depositó nuestro estudio anterior32. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue apoyado por un fondo inicial de la Universidad Estatal de Colorado a SC y subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01-MH126017 a SC; R37-MH052804 a TCS; y R01-DC015508 a MAX). Agradecemos a los Dres. Robert E. Cohen y Tingting Yao, Universidad Estatal de Colorado, por proporcionarnos un microscopio Zeiss LSM 880 con detector Airyscan para adquirir las imágenes de súper resolución de las sinapsis. También agradecemos al Dr. Michael E. Ward, NINDS, por proporcionarnos la línea celular WTC-11 iPS.

Estos autores contribuyeron igualmente: Scott R. Burlingham, Nicole F. Wong, Lindsay Peterkin.

Bioquímica y Biología Molecular, Universidad Estatal de Colorado, Fort Collins, CO, EE. UU.

Scott R. Burlingham, Lindsay Peterkin, Lily Lubow, Carolina Dos Santos Passos, Orion Benner, Thomas P. Cast y Soham Chanda

Ciencias Biológicas, Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo, Buffalo, NY, EE. UU.

Nicole F. Wong y Matthew A. Xu-Friedman

Ciencias Biológicas, Universidad Estatal de California Fullerton, Fullerton, CA, EE. UU.

Michael Ghebrial

Fisiología Molecular y Celular, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Thomas C. Südhof y Soham Chanda

Neurociencias moleculares, celulares e integradas, Universidad Estatal de Colorado, Fort Collins, CO, EE. UU.

Soham Chanda

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TCS y SC concibieron el proyecto; SC supervisó la investigación; MAX, TCS y SC diseñaron los experimentos; SRB, NFW, LP, LL, CDSP, OB, MG y SC realizaron los experimentos; SRB, NFW, LP, OB, TPC y SC analizaron los datos; MAX, TCS y SC escribieron el artículo; Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Matthew A. Xu-Friedman, Thomas C. Südhof o Soham Chanda.

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos, ya sean financieros o no financieros, en relación con el trabajo descrito en este estudio. Todas las solicitudes de reactivos experimentales deben dirigirse a SC ([email protected]).

Nature Communications agradece a los demás revisores anónimos su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Burlingham, SR, Wong, NF, Peterkin, L. et al. Inducción de la formación de sinapsis por síntesis de neurotransmisores de novo. Nat Comun 13, 3060 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30756-z

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Recibido: 23 de septiembre de 2021

Aceptado: 17 de mayo de 2022

Publicado: 01 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30756-z

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