Derivación robusta de neuronas de dopamina trasplantables a partir de células madre pluripotentes humanas mediante la administración programada de ácido retinoico

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3046 (2022) Citar este artículo

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Las terapias con células madre para la enfermedad de Parkinson (EP) han ingresado por primera vez en ensayos clínicos en humanos utilizando un conjunto de métodos técnicamente relacionados para producir neuronas de dopamina mesencefálicas (mDA) a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC). Aquí, describimos un enfoque para la derivación de alto rendimiento de las neuronas mDA que difiere principalmente de las tecnologías alternativas al utilizar la señalización del ácido retinoico (RA), en lugar de la señalización de WNT y FGF8, para especificar el destino mesencefálico. A diferencia de la mayoría de las señales de morfógenos, donde la concentración precisa determina el destino celular, la duración de la exposición a la AR es el parámetro clave para la especificación mesencefálica. Este enfoque de patrones insensibles a la concentración proporciona robustez y reduce la necesidad de ajustes de protocolo entre líneas hPSC. Los progenitores especificados por RA se diferencian rápidamente en neuronas mDA funcionales in vitro y se injertan y alivian con éxito los déficits motores después del trasplante en un modelo de enfermedad de Parkinson en ratas. Nuestro estudio proporciona una ruta alternativa potencial para la terapia celular y el modelado de enfermedades que, debido a su solidez, podría ser particularmente conveniente cuando se considera el uso de células autólogas o inmunológicamente compatibles.

Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) en forma de células madre embrionarias (hESC) o células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) proporcionan una fuente celular escalable para la producción de subtipos específicos de neuronas que se pueden utilizar para el descubrimiento de fármacos de alto rendimiento, enfermedades modelado, o terapia de reemplazo celular en enfermedades neurodegenerativas1,2. Las neuronas de dopamina mesencefálicas (mDA) en el mesencéfalo ventral (vMB) son de particular interés debido a su degeneración relativamente selectiva en la enfermedad de Parkinson (EP), y como experimentos clínicos pioneros que utilizan tejido del mesencéfalo fetal humano han proporcionado una prueba de concepto de que la dopamina injertada las neuronas pueden restaurar la neurotransmisión de dopamina y brindar alivio a largo plazo en algunos pacientes con EP3.

Los métodos para la derivación in vitro de neuronas mDA humanas para uso clínico se han mejorado progresivamente, y la terapia basada en células madre para la enfermedad de Parkinson, después de una evaluación exhaustiva de la seguridad y la eficacia funcional en modelos animales preclínicos, ha entrado en la emocionante etapa de ensayos clínicos con hESC alogénicas. o hiPSCs como material de partida2,4,5,6. El uso de células alogénicas permite la producción de grandes lotes de preparaciones "listas para usar" congeladas que se pueden usar para tratar a muchos pacientes con el mismo producto celular después de la validación de seguridad y eficacia en modelos animales, pero una desventaja es la necesidad. durante un año de inmunosupresión para evitar el rechazo tras el trasplante2. Las hiPSC específicas del paciente son óptimas desde una perspectiva inmunológica, pero agregan el desafío significativo de establecer hiPSC de grado clínico para cada paciente individual y dirigir de manera efectiva estas células para que adopten un destino de neurona mDA antes del injerto. Por lo tanto, es probable que las células específicas del paciente no se conviertan en una terapia de rutina en esta etapa de desarrollo, aunque un informe de caso reciente proporcionó una prueba de concepto de que es factible un enfoque autólogo para la terapia celular7. El uso de líneas hiPSC compatibles con el antígeno leucocitario humano (HLA) es una estrategia alternativa para reducir la inmunosupresión, pero exige un gran número de líneas hiPSC de tipo HLA seleccionadas para cubrir a la mayoría de la población de un país8. Otro enfoque interesante es establecer líneas hPSC universales "únicas para todos" que podrían proporcionar tolerancia inmunológica sin necesidad de inmunosupresión9, pero no está claro cuándo, y si, dichas líneas estarán disponibles y aprobadas para uso clínico. Por lo tanto, si se demuestra que la terapia celular restauradora es segura y eficaz en los ensayos clínicos, un desarrollo probable es que se exploren las líneas hiPSC autólogas y HLA compatibles para el uso clínico de rutina. Aparte de un establecimiento estandarizado de líneas hiPSC compatibles con buenas prácticas de fabricación (GMP), esto exigirá protocolos de neuronas mDA robustos que muestren una baja variabilidad de línea celular y lote en respuesta a los agentes de modelado para minimizar los ajustes laboriosos para líneas celulares individuales.

Los protocolos de neuronas mDA basados ​​en hPSC de última generación utilizan conjuntos similares de señales de patrones de desarrollo para dirigir la diferenciación de hPSC hacia un destino de neurona mDA. La inhibición dual de SMAD (dSMADi) se aplica para promover la selección del destino neuronal al evitar que las hPSC adopten opciones alternativas de destino somático o extraembrionario a través de la inhibición de la señalización de TGF-beta y BMP en las primeras etapas de diferenciación10. Los progenitores neurales derivados de hPSC adoptan un destino en el cerebro anterior (FB) en ausencia de señales de patrones de desarrollo. La activación de la señalización canónica de WNT por el inhibidor de glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK3β) CHIR90021 (CHIR), a menudo aplicado junto con FGF8, se usa para imponer una identidad regional del mesencéfalo (MB), al imitar la señalización de WNT1 y FGF8 que emana del organizador ístmico en el límite MB-rombencéfalo (HB)11. La activación de la vía SHH se utiliza a su vez para ventralizar las células e inducir progenitores de la placa base del mesencéfalo ventral (vMB) LMX1A+/FOXA2+/OTX2+, que pueden diferenciarse en neuronas mDA funcionales después del cultivo in vitro a largo plazo o después del injerto en modelos animales de EP12, 13 Aunque la tarea de restaurar la neurotransmisión de dopamina y revertir los déficits motores en modelos preclínicos se puede lograr claramente usando estos métodos, la respuesta del patrón anterior-posterior (AP) de diferenciar hPSCs a CHIR es altamente sensible a la concentración y requiere ajustes de protocolo cuidadosos entre líneas celulares12, 14,15,16. La evaluación de un gran conjunto de experimentos de injertos ha relacionado aún más la variabilidad interexperimental con la especificación imprecisa de vMB y la contaminación de los progenitores diencefálicos a pesar de la titulación CHIR optimizada, que podría ajustarse mediante la actividad caudalizante complementaria de FGF817 o con el tratamiento CHIR bifásico (CHIR-boost)18 que redujo la contaminación diencefálica e indujo una identidad de células EN1+ vMB más caudal. Sin embargo, un estudio reciente establece que la ablación de 4 genes de patrón de caudalización en hESC que promueven los destinos de HB y de la médula espinal dan como resultado una especificación más consistente e insensible a la concentración de los progenitores de vMB por CHIR, lo que brinda respaldo genético de que el patrón basado en CHIR es inherentemente sensible a la concentración (preimpresión en bioRxiv)19. Por lo tanto, el desarrollo de métodos que no se basen en CHIR para especificar la identidad mesencefálica podría dar como resultado paradigmas de diferenciación más sólidos con una menor variabilidad de lote a lote y de línea celular a línea celular. Además, se predice que las altas concentraciones de CHIR utilizadas para imponer la identidad del mesencéfalo inhiben una amplia gama de quinasas además de GSK3β20, lo que proporciona un incentivo adicional para considerar estrategias de diferenciación que no se basen en CHIR21.

El organizador ístmico es un centro de señalización secundario establecido después de que se haya iniciado la regionalización de la placa neural rostral en territorios cerebrales22. En consecuencia, el patrón cerebral temprano involucra señales que operan aguas arriba de WNT1 y FGF8, y ciertas observaciones implican que el ácido retinoico (AR) derivado de la vitamina A puede contribuir a este proceso. La fuerte actividad caudalizante de la AR está bien establecida11. Por lo tanto, comúnmente se supone que la exposición temprana a la AR es incompatible con la derivación de neuronas con un origen más rostral en el sistema nervioso central, y la AR o la vitamina A a menudo se evitan activamente en los protocolos de neuronas mDA basados ​​en hPSC15,23,24. Sin embargo, los estudios han informado una extensión caudal de los marcadores FB y MB en embriones de codorniz con deficiencia de vitamina A25 y hay una expansión rostral de HB en ratones que carecen de las enzimas degradantes RA CYP26A1 y CYP26C126. Además, los estudios en ratones han definido una ventana de tiempo transitoria temprana en la que RA27 puede volver a especificar el tejido FB en una identidad similar a MB. Esto implica un potencial para aplicar RA para imponer el carácter del cerebro medio a las NSC derivadas de hPSC. También se sabe que la AR induce la disolución de la pluripotencia28 y promueve la maduración de las NSC ingenuas en las etapas iniciales del desarrollo neural29 y, por lo tanto, posiblemente podría promover una conversión rápida de hPSC en NSC. En este estudio, mostramos que un pulso de AR de 48 horas en combinación con la activación de la vía SHH promueve una especificación rápida de progenitores de vMB LMX1A+/FOXA2+/OTX2+ que se diferencian en neuronas mDA funcionales con un alto rendimiento in vitro, y que injertan y restauran los déficits motores después del trasplante en un modelo de rata de PD. Finalmente, simplemente ajustando la duración de la exposición a la AR, pudimos generar efectivamente neuronas serotoninérgicas, lo que demuestra que el patrón basado en la AR se basa principalmente en la duración de la exposición a la señal y proporciona una prueba de concepto de que esta propiedad tiene una amplia aplicabilidad y puede usarse para producir distintos subtipos neuronales clínicamente relevantes de hPSCs.

Para explorar las actividades de RA en hESC dirigidas a adoptar un destino neuronal en respuesta a dSMADi10, tratamos cultivos de la línea hESC HS980 compatible con GMP cultivados en condiciones dSMADi con 200 nM all-trans RA durante los primeros 1, 2, 3 , o 4 días de diferenciación (RA1D, RA2D, RA3D, RA4D) (Fig. 1a) y controló el destino y la identidad de las células en diferentes etapas mediante inmunotransferencia, inmunocitoquímica cuantitativa, qPCR o secuenciación de ARN (RNA-seq). De acuerdo con estudios previos10, las células cultivadas en condiciones de dSMADi solamente experimentaron una transición progresiva de un estado de pluripotencialidad (OCT4+) a un estado NSC ingenuo (SOX1+ PAX6+) entre 0 y 7 días en condición de diferenciación (DDC) (Fig. 1b-d) . OCT4 se reguló gradualmente a la baja y se acercó a niveles indetectables en ~ 5 DDC, como lo reveló la inmunocitoquímica cuantitativa (Fig. 1c). La regulación positiva de SOX1 y PAX6 a niveles bajos ocurrió en ~ 3 DDC (Fig. 1b). OCT4 y SOX1 fueron coexpresados ​​por células entre 3 y 4 DDC (Fig. 1b, c y Fig. 1a complementaria) que muestran que la conversión de hPSC en NSC en respuesta a dSMADi abarca una ventana de tiempo notable durante la cual la expresión de pluripotencia- y los genes neurales específicos se superponen. Por el contrario, en cultivos tratados con dSMADi y 200 nM RA durante dos días o más (dSMADi + RA2D, 3D), se observó inducción de SOX1 y PAX6 en 2 DDC (Fig. 1e y Fig. 1a complementaria) y la expresión de OCT4 había esencialmente se ha extinguido por 3 DDC (Fig. 1b, c, f). Los niveles de expresión de SOX1 y PAX6 en 3–4 DDC fueron notablemente más altos en cultivos dSMADi + RA2D en relación con cultivos solo dSMADi (Fig. 1b, c, f y Fig. 1a complementaria). Por 7 DDC, la expresión de SOX1 y el marcador de células madre neurales NESTIN fue similar en cultivos de dSMADi solo y en cultivos de dSMADi + RA2D (Fig. 1d). El análisis de ARN-seq de cultivos dSMADi + RA2D sugirió una regulación negativa general de los genes de pluripotencia y una regulación positiva de los genes específicos del linaje neuronal en 2 DDC (Fig. 1e y Tabla complementaria 1). Los marcadores de linaje endodérmico o mesodérmico no estaban regulados al alza (Fig. 1b complementaria). Se logró una pronta supresión de OCT4 y una rápida regulación ascendente de SOX1 dentro de un rango de concentración de RA entre 50 y 500 nM cuando las células se cultivaron en condiciones dSMADi + RA2D (Fig. 1g). El tratamiento de las células con RA 200 nM durante un día (dSMADi + RA1D) no fue suficiente para promover la supresión rápida de OCT4 o la regulación ascendente rápida de SOX1 (Fig. 1f), ni el tratamiento de las células solo con RA (sin dSMADi) (Fig. 1c). En consecuencia, la combinación de dSMADi con el tratamiento de AR durante 48 h o más promueve una transición rápida y similar a un cambio de un estado de pluripotencia a un estado NSC.

un esquema de diferenciación de hPSC con línea de tiempo de tratamiento con dSMADi y RA. b Inmunocitoquímica para el marcador de pluripotencia OCT4 y los marcadores neuroectodérmicos SOX1 y PAX6 en ESC y cultivos de 3 días diferenciados en inhibidores duales de SMAD (dSMADi) o en dSMADi con un pulso RA de dos días (dSMADi + RA2D). c Gráfica de densidad de la expresión de células individuales de SOX1 y OCT4 en cultivos diferenciados en dSMADi o dSMADi+RA2D en los días indicados en condiciones de diferenciación (DDC). Se cuantificaron 670-760 células por condición y punto de tiempo en una diferenciación representativa. d Inmunocitoquímica para marcadores de progenitores neurales NES y SOX1, e imágenes de campo claro (BF) de cultivos a 7 DDC diferenciados en las condiciones indicadas. e Valores de cambio de pliegue log10 basados ​​en RNAseq de la expresión de genes asociados con pluripotencia o destino neuroectodérmico en cultivos dSMADi+RA2D a 2 DDC en relación con ESC. Valor de P y FDR en la Tabla complementaria 1, n = 2 experimentos independientes. f Western blot representativo para OCT4 y SOX1 de cultivos ESC y 3 DDC diferenciados en las condiciones indicadas. g Western blot representativo para OCT4 y SOX1 de cultivos ESC y 3 DDC cultivados en condiciones dSMADi y tratados con las concentraciones indicadas de RA durante dos días. h Inmunocitoquímica para marcadores que identifican las regiones del prosencéfalo (FOXG1), prosencéfalo y mesencéfalo (OTX2), rombencéfalo (HOXA2) y rombencéfalo caudal (HOXB4) en nueve cultivos DDC diferenciados en dSMADi y tratados con AR como se indica. i Resumen de los efectos de la duración del pulso RA en la identidad regional del NSC. Barras de escala, 100 µm. Arb.units unidades arbitrarias, cerebro anterior FB, cerebro medio MB, cerebro posterior HB.

Para determinar la identidad regional de las NSC derivadas de hPSC expuestas a AR durante diferentes períodos de tiempo, analizamos la expresión de factores de transcripción cuya expresión sola o en combinación distingue entre identidades regionales FB, MB o HB en cultivos en 9 DDC. El tratamiento con dSMADi se incluyó en todos los experimentos siguientes y no se destacará más al describir las configuraciones experimentales. Como era de esperar, en cultivos de hPSC no tratados con RA (RA0D), las NSC adquirieron una identidad similar a FOXG1+/OTX2+/HOXA2-FB (Fig. 1h). Se observó un carácter similar a FB en cultivos RA1D, aunque el nivel de expresión de FOXG1 + se redujo algo (Fig. 1h y Fig. 1d complementaria). Curiosamente, en cultivos RA2D, se suprimieron los marcadores FB y, en cambio, las NSC expresaron un carácter similar a FOXG1-/OTX2+/HOXA2- MB (Fig. 1h y Fig. 1d complementaria). En cultivos RA3D y RA4D, las NSC adquirieron identidades FOXG1-/OTX2-/HOXA2+/HOXB4- rostral HB y FOXG1-/OTX2-/HOXA2+/HOXB4+ caudal HB, respectivamente (Fig. 1h). Estos datos muestran que un pulso de RA de 48 horas suprime el destino de FB e impone una identidad similar a MB a las NSC derivadas de hPSC, mientras que una exposición más prolongada da como resultado una identidad de HB (Fig. 1i).

A continuación, activamos la señalización de SHH para imponer una identidad ventral a las NSC mediante el tratamiento de cultivos con el agonista Smoothened SAG30 entre 0 y 9 DDC, y analizamos el destino de las células expuestas a RA durante diferentes períodos de tiempo mediante inmunocitoquímica o RNA-seq (Fig. 2a). En 9 DDC, las NSC generadas en condiciones SAG-solo o RA1D + SAG expresaron los marcadores específicos de FB FOXG1, SIX3, SIX6 y LHX2 (Fig. 2b) y el marcador ventral NKX2.1 (Fig. 2a, b) que es un marcador selectivo para el telencéfalo ventral y el diencéfalo31,32. En cultivos RA2D + SAG, se suprimieron los marcadores FB y las NSC adoptaron una característica de identidad LMX1A+/LMX1B+/FOXA2+/OTX2+ de los progenitores de neuronas vMB mDA (Fig. 2a, b, d). En cultivos RA4D + SAG, las células expresaron genes HOX y los marcadores ventrales NKX2.2, PHOX2B, NKX6.1 y NKX6.2 típicos de los progenitores de neuronas motoras craneales (MN) de HB33 (Fig. 2a, b, d). Los análisis de componentes principales y de agrupamiento jerárquico de los datos de RNA-seq mostraron una clara segregación y amplios cambios transcripcionales entre las células expuestas a RA durante diferentes períodos de tiempo (Fig. 2c y Fig. 2a complementaria). En conjunto, estos datos establecen primero que los aumentos graduales en la duración de la exposición a la AR imponen identidades cerebrales regionales progresivamente más caudales (FB-> MB-> HB) a las NSC derivadas de hPSC (Fig. 1i). En segundo lugar, cuando se combina con la activación de la vía SHH, un pulso RA de 48 h parece suficiente para imponer una identidad similar a LMX1A+/FOXA2+/OTX2+ vMB a las NSC. La especificación efectiva de una identidad similar a LMX1A+/FOXA2+ vMB se logró cuando el pulso RA de 48 horas se inició entre 0 y 2 DDC (Figura 2b complementaria) y cuando el tratamiento SAG se inició en 0 o 1 DDC (Figura 2c complementaria) a una concentración ≥ 50 nM (Fig. 2d complementaria).

un esquema de la diferenciación de hPSC con la cronología del tratamiento con el activador de señalización de RA y SHH (SAG) (arriba). Todos los cultivos se diferenciaron en condiciones dSMADi como se indica en la Fig. 1a. Inmunocitoquímica para los marcadores indicados en 9 DDC en cultivos diferenciados en condición +SAG y pulsados ​​con RA durante 1, 2 o 4 días (abajo). b Expresión génica normalizada de los genes indicados en 9 cultivos DDC diferenciados en +SAG y tratados con RA durante el tiempo indicado (n = 2 experimentos independientes por condición). c Mapa de calor y agrupamiento jerárquico de genes expresados ​​diferencialmente de 9 cultivos DDC diferenciados en +SAG y tratados con RA durante el tiempo indicado (n = 2 experimentos independientes por condición). d Esquema de perfiles de expresión génica que definen distintos progenitores ventrales en el diencéfalo (Di), el mesencéfalo (MB) y el rombencéfalo (HB). e Expresión de genes asociados con progenitores regionales indicados a 14 DDC en cultivos diferenciados en +SAG + RA2D en dos experimentos independientes. f Inmunocitoquímica representativa para β-CATENINA (izquierda) y diagramas de caja de niveles nucleares de β-CATENINA (derecha) en 2 cultivos DDC diferenciados en +SAG (control) y tratados con RA o CHIR99021. Datos de la gráfica de caja: la línea central define la mediana, la caja indica el cuartil 1 al cuartil 3 y los bigotes indican el rango intercuartílico de ±1.5x. n = 227 (control), 247 (RA), 232 (CHIR99021) células examinadas en 3 diferenciaciones independientes, valores de p derivados de la prueba t de dos colas no apareada. g Inmunocitoquímica para los marcadores indicados en cultivos a 14 DDC diferenciados en dSMADi+SAG + RA2D. h Análisis qPCR de un panel de 17 genes para seis diferenciaciones independientes de mDA en 14 DDC (columna RA2D + SAG; diferenciaciones n.º 1-n.º 6). Las muestras de mDA se compararon con cultivos diferenciados a una identidad progenitora del prosencéfalo (RA0D + SAG, n = 2) o del rombencéfalo (RA4D + SAG, n = 2). i Cuantificación del porcentaje de células que expresan FOXA2, LMX1A o NKX2.1 en 14 cultivos DDC diferenciados en +RA2D + SAG en cuatro líneas hPSC diferentes (valores, media ± DE, n = 3–4). Barras de escala: 100 µm en paneles (a, g), panel de 25 µm (f).

Una identidad LMX1A+/LMX1B+/FOXA2+/OTX2+ se consideró durante mucho tiempo como un sello molecular para los progenitores vMB que generan neuronas mDA, pero se demostró que esta identidad también la comparten los progenitores ventrales del diencéfalo caudal que dan lugar a las neuronas del núcleo subtalámico (STN)17,32 (Figura 2d). BARHL1, BARHL2, PITX2 y NKX2.1 se expresan selectivamente por el linaje STN y, por lo tanto, se pueden usar para distinguir entre progenitores STN diencefálicos y progenitores vMB32. Los análisis de cultivos RA2D + SAG después de 14 días mostraron que la gran mayoría de las células LMX1A+ coexpresaron FOXA2, OTX2 y LMX1B, así como el marcador vMB CORIN34 (Fig. 2g; LMX1A+FOXA2+: 92,5 % ± 3,3, OTX2+: 97,3 % ± 1,7, media ± DE, n = 4). En esta etapa, un subconjunto menor de células había iniciado la expresión de NURR1 (Fig. 2g), un marcador temprano de neuronas mDA posmitóticas35. Los datos de RNA-seq mostraron una expresión insignificante de BARHL1, BARHL2, PITX2 y NKX2.1 (Fig. 2e) y NSC LMX1A + o LMX1B + raros coexpresaron NKX2.1, PITX2 o BARHL1 (Fig. 2g; NKX2.1 +: 2,1 % ± 2 (n = 3), PITX2+: 1,4 ± 0,8 (n = 2), media ± DE) en 14 cultivos DDC. La expresión de NKX2.2, PHOX2B, PHOX2A y NKX6.1 solos o en combinación definen progenitores que dan lugar a neuronas motoras craneales (MN) y neuronas serotoninérgicas (5HTN) en el HB ventral33,36, o neuronas oculomotoras37 y neuronas GABAérgicas38 derivadas lateral a las neuronas mDA en el MB (Fig. 2d). Los datos de RNA-seq revelaron una baja expresión de estos marcadores en cultivos RA2D + SAG (Fig. 2e) y pocas células expresaron NKX2.2, PHOX2A, PHOX2B y NKX6.1 en 14 DDC según lo determinado por inmunocitoquímica (Fig. 2g). Los análisis de qPCR de seis réplicas biológicas de cultivos RA2D + SAG aislados en 14 DDC indicaron una especificación constante de vMB y una baja expresión de marcadores regionales inapropiados (Fig. 2h).

La señalización de WNT1 y FGF8 que emana del organizador ístmico impone un gradiente caudal-alto a rostral-bajo de expresión de EN1 y EN2 en el MB39,40. EN1, EN2, WNT1, FGF8 y los marcadores ístmicos PAX2, PAX5 y PAX8 se expresaron a niveles muy bajos o indetectables a los 14 DDC (Fig. 2e). La activación de la señalización WNT canónica por CHIR99021 está asociada con la translocación de β-catenina en los núcleos12,21 (Fig. 2f). No hubo acumulación nuclear de β-catenina en respuesta al tratamiento de AR (Fig. 2f) y no hubo inducción de WNT1 o el gen de respuesta WNT AXIN2, ni FGF8 en respuesta a RA en cultivos ESC en 2 DDC a 14 DDC (Fig. 2e y Fig. 2e complementaria) En conjunto, esto sugiere que las células LMX1A+/FOXA2+/OTX2+ inducidas por RA y SAG adquieren una identidad de vMB similar a EN1-/LOW rostral y que la especificación del destino de vMB puede ocurrir independientemente de WNT1, FGF8 o inducción de células similares a organizadores ístmicos en cultivos de hPSC.

A continuación, comparamos la respuesta del patrón al tratamiento RA2D + SAG para una línea hESC adicional HS401, así como dos líneas hiPSC SM55 y SM56. Para cada línea celular analizada en 14 DDC, observamos una inducción constante de progenitores LMX1A+/FOXA2+/OTX2+/NKX2.1− vMB con alto rendimiento sin necesidad de ajustar la concentración o el tiempo de exposición a la AR (Fig. 2i y Fig. 3 complementaria), lo que normalmente requeriría volver a titular los agentes de patrón usando otros protocolos de neuronas mDA donde se usa CHIR para la caudalización15. En conjunto, estos datos sugieren que la diferenciación basada en RA promueve una especificación de vMB robusta y reproducible con una alta coherencia interexperimental y una baja variabilidad de líneas celulares.

Para comprender la sólida actividad de modelado de RA, examinamos la salida de patrones en respuesta a concentraciones alteradas de RA. En estos experimentos, las células cultivadas en condiciones RA2D + SAG se expusieron a RA en el rango de 100 a 800 nM, y la identidad regional de las células se analizó en 9 DDC. En cultivos expuestos a 200-400 nM RA, la gran mayoría de NSC expresaron una identidad LMX1A+/NKX2.1− vMB y pocas células expresaron una identidad diencefálica LMX1A+/NKX2.1+ o NKX2.2+/LMX1A− similar a HB. identidad (Fig. 3a, c). Es notable que algunos LMX1A+ en 9 DDC coexpresaron NKX2.2 a niveles muy bajos (Fig. 2c complementaria), lo que es consistente con los datos que muestran que NKX2.2 se expresa transitoriamente en progenitores de vMB en etapas tempranas de desarrollo in vivo37. También se generaron progenitores de vMB LMX1A+/NKX2.1− cuando la concentración de AR se redujo a 100 nM o aumentó a 800 nM de AR, pero con un rendimiento menor (Fig. 3c). Cuando usamos CHIR para especificar la identidad de vMB, las células alcanzaron una identidad de vMB LMX1A+/NKX2.1− en respuesta a CHIR de 1 µM, pero la identidad regional de las NSC cambió a un carácter diencefálico anterior LMX1A+/NKX2.1+ cuando se redujo la concentración. a 0,8 y 0,6 µM (Fig. 3b, c) o en una presunta identidad HB posterior de NKX2.2+/LMX1A− cuando la concentración se elevó a 1,2 y 1,4 µM (Fig. 3b, c). Estos datos demuestran que la especificación de la identidad regional de vMB es relativamente tolerante a las concentraciones alteradas de RA y que, en cambio, es la duración de la exposición a RA lo que es central para un patrón robusto de vMB.

a–c Efecto de los cambios en la concentración de RA (a) o CHIR99021 (b) sobre la expresión de marcadores que definen el prosencéfalo ventral (NKX2.1+LMX1A+), el mesencéfalo (NKX2.1−LMX1A+) o el rombencéfalo (NKX2.2+) en 9 cultivos DDC diferenciados en dSMADi+SAG, y correspondiente cuantificación de poblaciones NKX2.1+LMX1A+ y NKX2.1−LMX1A+ (n = 3 diferenciaciones independientes por condición). valores, media ± DE (c). d Efecto de la concentración de RA (50, 100, 300, 500 y 1000 nM de RA) sobre la expresión de CYP26A1 en cultivos de 1 DDC diferenciados en dSMADi (datos de dos diferenciaciones independientes). e Perfil de expresión temporal de CYP26A1 en cultivos diferenciados en dSMADi y pulsados ​​sin RA o 300, 500 o 1000 nM de RA durante 2 días (datos de dos diferenciaciones independientes). f Efecto de la inhibición de la actividad de CYP26 con inhibidor R115866 500 nM sobre la expresión de NKX2.1, LMX1A y PHOX2B a 9 DDC en cultivos diferenciados en SAG y condiciones de AR indicadas. g Expresión génica relativa de los genes indicados en 9 cultivos de DDC diferenciados en condición RA1D + SAG y en presencia de diferentes concentraciones del inhibidor de CYP26 R115866 (datos de dos diferenciaciones independientes). h, i Inmunocitoquímica de NKX2.1, LMX1A y PHOX2B a 9 DDC en cultivos diferenciados en dSMADi más las condiciones indicadas (500 nM 9-cis-RA, 13-cis-RA y TA; 200 nM EC23) y en presencia o ausencia de R115866 500 nM. j Resumen esquemático de las interacciones reguladoras entre RA y CYP26A1. Barras de escala 100 µm.

La familia de genes CYP26 (CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1) codifica enzimas de la familia del citocromo p450 que metabolizan la AR por oxidación41. CYP26A1 se expresa en el neuroectodermo más rostral y contribuye a prevenir una extensión rostral de la identidad HB en las primeras etapas del desarrollo neural26. Además, en el patrón anteroposterior de la HB, la regulación por retroalimentación negativa de la señalización de la AR mediante la degradación automejorada a través de la inducción de proteínas CYP26 es central para dar forma a los gradientes de AR y amortiguar las fluctuaciones de los niveles de AR42,43. Observamos una activación dependiente de la concentración de AR y un perfil de expresión temporal adaptativo de CYP26A1 en cultivos de hPSC (Fig. 3d, e). Esto proporciona una justificación mecanicista plausible para la respuesta de patrón sólido de hPSCs a RA, ya que la entrada alterada de RA puede amortiguarse mediante un cambio coincidente de la tasa de rotación de RA por CYP26A1. Para explorar esto, examinamos la salida del patrón en respuesta a la exposición cronometrada de AR después de inhibir la actividad de CYP26 con el antagonista selectivo R11586644 entre 0 y 3 DDC. En cultivos RA1D + SAG o RA2D + SAG tratados con R115866 500 nM, las células adquirieron una identidad PHOX2B+ HB en lugar de una identidad NKX2.1+ FB o una identidad LMX1A+/NKX2.1− vMB en 9 DDC, respectivamente (Fig. 3f). En estos experimentos se indujeron HOXA2 y HOXB4, lo que sugiere una identidad de HB caudal (Fig. 3g), que corresponde a una identidad regional adquirida después de cuatro días de exposición a RA si la función CYP26 se deja intacta (Fig. 1h). Cuando la concentración de R115866 se redujo a 100 nM, se suprimió el destino de FB pero los cultivos contenían una mezcla de células LMX1A+/NKX2.1− vMB y células PHOX2B+ HB (Fig. 3g y Fig. 4a complementaria), lo que presumiblemente refleja que una inhibición parcial de CYP26A1 produce un efecto caudalizante intermedio. Es importante destacar que el tratamiento de las células solo con R115866 y SAG no suprimió el destino NKX2.1+ FB (Fig. 3f), lo que establece que el fuerte efecto de caudalización de R115866 depende de la AR.

Al igual que el AR todo trans, el AR 9-cis, el AR 13-cis y el ácido tazaroténico (TA) análogo del AR xenobiótico son sustratos para la oxidación mediada por CYP2645,46. La exposición de las células a 500 nM de estos análogos durante 48 horas imitó la actividad de modelado de la AR todo trans al imponer una identidad LMX1A+/NKX2.1− vMB (Fig. 3h y Fig. 4b complementaria), y resultó la inhibición de la actividad de CYP26 en un cambio hacia una identidad PHOX2B+ HB (Fig. 3h). Se predice que el análogo de RA sintético EC23 será resistente a la oxidación mediada por CYP2647 y cuando todo-trans-RA se reemplazó con 200 nM de EC23, las células cultivadas en condiciones EC231D + SAG o EC232D + SAG adoptaron una identidad PHOX2B+ HB con o sin inhibición de CYP26 (Fig. 3i y Fig. 4a complementaria). Los experimentos de titulación mostraron que EC23 podía inducir células LMX1A+/NKX2.1− vMB, pero esto era impreciso y requería una reducción de 20 veces en la concentración y el tratamiento de las células solo durante 24 h (Fig. 4c complementaria). Juntos, estos datos establecen que la salida del patrón AP en respuesta a la exposición RA cronometrada depende de manera crítica de la activación dependiente de la concentración de RA de CYP26A1 en las hPSC que responden, y proporciona una justificación mecánica para explicar la solidez y la tolerancia a la entrada alterada de RA en RA- especificación vMB mediada (Fig. 3j).

Una característica única de las neuronas mDA es que se originan inicialmente a partir de células de la placa del piso (FP) no neuronales y, por lo tanto, los progenitores deben adquirir potencial neuronal antes de la diferenciación en neuronas34,48. Pocos marcadores distinguen entre estas etapas de maduración de vMB, pero la regulación a la baja de SHH y la regulación al alza de las proteínas bHLH proneurales a lo largo del tiempo se correlacionan con esta transición48. Los análisis de RNA-seq de células tratadas con RA2D + SAG aisladas en 9, 12, 14 y 21 DDC mostraron que la expresión de los marcadores pan-FP SHH, CORIN, ARX, VTN, FERD3L, NTN1, SLIT2, SULF2 y ALCAM alcanzó su punto máximo en alrededor de 12-14 DDC y posteriormente disminuyó (Fig. 4a, Fig. 5a complementaria y Tabla complementaria 2). Por el contrario, NEUROG2, NEUROG1, NEUROD4 y ASCL1 que codifican proteínas bHLH proneurales se regularon al alza en 21 DDC (Fig. 4a), así como los marcadores de neuronas mDA NR4A2 (NURR1) y TH, y los marcadores panneuronales DCX, TUBB3, y STMN2 (Fig. 4a y Tabla complementaria 2). Los análisis inmunocitoquímicos confirmaron que la expresión de SHH fue mayor en 14 DDC en comparación con 21 DDC y que la cantidad de progenitores NEUROG2+ aumentó durante este período (Fig. 4b). Hubo una acumulación progresiva de neuronas HuC/D+ entre 14 y 21 DDC (Fig. 4c, d), y para 21 DDC, ~30% de las células DAPI+ representaron neuronas HuC/D+ en cultivos RA2D + SAG (Fig. 4d) . Muchos de estos también habían iniciado la expresión de TH (Fig. 4c). Cuando aplicamos CHIR + SAG para especificar los progenitores LMX1A+/NKX2.1− vMB (Fig. 3b), las células iniciaron la neurogénesis alrededor de 17 DDC (Fig. 4c, d), lo cual es consistente con estudios previos13,15. En 21 DDC, las neuronas HuC/D+ constituían ~10% del total de células y pocas neuronas expresaban TH (Fig. 4c, d). Se observaron resultados similares cuando los cultivos tratados con CHIR + SAG se complementaron con el tratamiento con FGF8b entre 9 y 16 DDC15,17 (Fig. 4c). Esto indica que los progenitores de vMB especificados por RA inician la neurogénesis temprano y que las células a nivel de población experimentan una conversión relativamente coordinada de un estado de FP inmaduro a un estado de progenitor de neurona mDA neurogénica.

a–r Análisis de cultivos diferenciados en dSMADi+RA2D + SAG (a, b, e–r) o dSMADi+SAG e indicó RA, CHIR99021 o CHIR99021 + condición FGF8 (c, d). valores de cambio de pliegue log2 basados ​​en RNAseq de la expresión de genes asociados con la identidad de la placa base y la neurogénesis en 21 DDC en relación con 14 DDC. Valores P y FDR en la Tabla complementaria 2, datos de dos experimentos independientes (n = 2). b Inmunocitoquímica de SHH, LMX1A y NEUROG2 a los 14 y 21 DDC. c Inmunocitoquímica del marcador neuronal HuC/D a 17 DDC y marcador de neurona dopaminérgica TH a 21 DDC en las condiciones indicadas. d Cuantificación de neuronas HuC/D+ en 14, 17 y 21 DDC en las condiciones indicadas (n = 2). e–i Inmunocitoquímica de los marcadores indicados (e, f, h) y cuantificaciones de células TH+ que expresan FOXA2 o LMX1B (n = 4 y n = 5, respectivamente) (g), y de células dopaminérgicas (TH+, n = 7), GABAérgicas (GABA+, n = 6), motoras (PRPH+, n = 7) y serotoninérgicas (5-HT+, n = 7) neuronas en 33–35 DDC. i Valores, media ± imágenes SDTH/Tuj y 5-HT/Tuj en (h) corresponden a una inmunocitoquímica triple 5-HT/TH/Tuj. j, l Inmunocitoquímica de los marcadores indicados en 40–45 cultivos DDC. k Gráficos de violín de longitud de neurita (línea central, media; valor p de la prueba de Wilcoxon por pares) y de cuantificación de ramificación de neurita (línea central, media) en 30 y 40 neuronas DDC TH+, n = 40 neuronas por punto de tiempo. m qPCR de marcadores de mDA durante la diferenciación de mDA (n = 3, excepto para 21 DDC donde n = 2). n Cuantificación de células TH+ que expresan EN1 en 35–40 DDC (n = 3). Datos en (m,n) como media ± DE o Detección por HPLC de noradrenalina (NA), dopamina (DA) y serotonina (5-HT) en el sobrenadante de 42 cultivos DDC. p Cuantificación de los niveles de dopamina en medios a 42 DDC en el control (n = 12) o después de la liberación de dopamina inducida por KCL (n = 12) y en el lisado celular total (n = 6). Valores presentados como media ± SEM, valor p de la prueba t no pareada de dos colas. q Registro de células adjuntas, que muestra potenciales de acción espontáneos (izquierda) y potenciales de acción espontáneos aislados (derecha) de células a 40–45 DDC. Las puntas de flecha grises denotan picos espontáneos. r Inmunocitoquímica para TH en neurona marcada con biocitina (izquierda) y tren de pico evocado (derecha) en 40 neuronas DDC. Resumen esquemático de la línea de tiempo de diferenciación. Barras de escala: 100 µm en (b, c, e, h, j) y 50 µm (f, l, r).

Las neuronas TH + específicas de RA adquirieron una morfología neuronal progresivamente más avanzada con crecimiento progresivo y ramificación de procesos axonales entre 30 y 45 DDC (Fig. 4e, j, k). Las neuronas TH+ expresaron los marcadores de neuronas mDA LMX1B, LMX1A, FOXA2, NURR1 y OTX2 en 30-35 DDC (Fig. 4 e-g). Solo células raras expresaron Ki67 o fosfohistona H3 en 35–40 DDC (Fig. 5b complementaria), lo que indica una baja actividad mitótica en cultivos a largo plazo. ~ 80% de todas las neuronas expresaron TH + en 35 DDC (Fig. 4h, i). ~ 10% de las neuronas expresaron GABA (Fig. 4h, i), y algunas de estas coexpresaron TH (Fig. 5b complementaria). Solo se detectaron neuronas raras que expresaban 5-HT o el marcador MN PRPH (Fig. 4h, i). Se confirmó que las cuatro líneas hPSC examinadas en este estudio dan lugar a un alto contenido de neuronas TH+ (~60–80% del total de neuronas) en cultivos a largo plazo (Fig. 5c complementaria).

Los análisis de expresión de ARNm temporal revelaron una regulación ascendente notable de EN1 en cultivos ESC a 40 DDC (Fig. 4m) y una pequeña fracción de neuronas TH + (~ 15%) expresaron EN1 detectable según la inmunocitoquímica (Fig. 4l, n). En consecuencia, mientras que los progenitores de vMB de tipo rostral especificados por RA inmaduros muestran una expresión de EN1 insignificante (Fig. 4m), esto indica que EN1 se regula al alza en la diferenciación de las neuronas mDA con el tiempo (ver también a continuación). Las células también expresaron los marcadores de maduración de neuronas mDA DAT, GIRK2, SYNAPTOPHYSIN, CALB1, SOX6, VMAT2 y ALDH1A1 a 40 DDC, según lo determinado por inmunocitoquímica (Fig. 4l y Fig. 5b, d complementaria) o expresión de ARNm (Fig. 4m). Los análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en 42 DDC establecieron que las neuronas producían y liberaban dopamina (Fig. 4o, p), pero no serotonina (5-HT) o noradrenalina (NA) (Fig. 4o). El tiempo en que las células derivadas de hPSC adquieren potenciales de acción espontáneos, potenciales de acción evocados y corrientes de Na+ y K+ dependientes de voltaje proporcionan otra medida para evaluar el estado de maduración de las neuronas mDA in vitro49. En cultivos RA2D + SAG, el número de células parcheadas que mostraban corrientes de Na+ y K+ dependientes de voltaje fue bajo a los 35 DDC, pero aumentó notablemente a los 38 DDC y permaneció en un nivel en gran medida constante a partir de entonces (Fig. 6 complementaria), y las neuronas exhibieron espontáneamente (Fig. 4q) o potenciales de acción evocados (Fig. 4r) se registraron en 40–45 DDC. En conjunto, estos datos establecen que los progenitores de vMB especificados por AR se diferencian en neuronas mDA funcionales con un alto rendimiento in vitro (Fig. 4s), con poca contaminación de los subtipos neuronales generados en las proximidades de las neuronas mDA en el tronco encefálico en desarrollo.

Para determinar el rendimiento in vivo de los progenitores de vMB especificados en respuesta a RA2D + SAG, trasplantamos preparaciones de vMB en un modelo preclínico de PD50 en ratas. Los progenitores de vMB se aislaron en 14 DDC (Fig. 4s) y se injertaron en el cuerpo estriado de ratas atímicas (desnudas) con lesión previa unilateral de 6-OHDA en el haz del prosencéfalo medial como se describió previamente17 (Fig. 7a complementaria). Siete meses después del trasplante, el análisis de inmunohistoquímica mostró que las nueve ratas tenían injertos ricos en neuronas sobrevivientes con inervación extensa de las regiones objetivo de DA, incluido el cuerpo estriado dorsolateral y la corteza prefrontal (Fig. 5a). Los injertos contenían una gran cantidad de neuronas TH+ (4300 ± 47 neuronas TH+ por injerto, Fig. 5b) que comarcaron con el marcador humano HuNu (Fig. 5c, d y Fig. 7b complementaria). Las neuronas TH+ derivadas de injertos también coexpresaron FOXA2, LMX1A/B, PITX3, NURR1 y EN1 (Fig. 5e-j), lo que indica que también adoptaron un fenotipo mDA después del trasplante. ~70 % de las neuronas TH+ expresaron EN1 detectable después del injerto, lo que demuestra que la mayoría de las neuronas mDA especificadas para RA expresaron EN1 después de la diferenciación y maduración in vivo (Fig. 5n). ≥70% de las neuronas TH+ también coexpresaron PITX3, así como GIRK2 y SOX6, que son marcadores enriquecidos en el subtipo A9 terapéutico de neuronas mDA51 (Fig. 5i–l, n). La identidad A9 fue respaldada aún más por las fibras TH + que inervan el cuerpo estriado dorsolateral circundante (Fig. 5a y Fig. 7c complementaria). También se detectó inervación en la corteza prefrontal y una pequeña fracción de neuronas TH+ expresaron CALB1 (20,5% ± 4,7, media ± SD) (Fig. 5m, n), un marcador enriquecido en subtipos A10 de neuronas mDA51. La funcionalidad de las neuronas TH+ se evaluó mediante pruebas motoras inducidas por fármacos y espontáneas; prueba de rotación y escalonamiento inducida por anfetaminas, que demostró recuperación funcional 7 meses después del trasplante (Fig. 5o-q). Juntos, estos resultados muestran que los progenitores de vMB derivados de hPSC especificados por RA y SAG se injertan con éxito, extienden las proyecciones a áreas objetivo relevantes y se diferencian en neuronas mDA funcionales que restauran los déficits motores en un modelo animal de EP en un grado comparable al que se ha observado. informado a partir de células generadas utilizando protocolos de patrones basados ​​en CHIR13,17,52,53.

a–m Análisis inmunohistológico de ratas lesionadas unilateralmente con 6-OHDA siete meses después del injerto de preparaciones de vMB en el cuerpo estriado. a Descripción general de la inervación derivada del injerto en el cerebro huésped marcada con tinción de hNCAM desarrollada por DAB y aumento del crecimiento de fibras neuronales humanas hacia la corteza prefrontal (PFC) y el cuerpo estriado dorsolateral (DLstr). b Expresión de TH en cuerpo estriado y sustancia negra (SN). Obsérvese la inmunorreactividad de TH en todo el cuerpo estriado y la falta de expresión de TH en el SN del lado lesionado (derecha). c–m Inmunohistoquímica de marcadores indicados en injertos. n Cuantificación del porcentaje de células TH+ en injertos que expresan EN1, SOX6, GIRK2 (n = 6 ratas), PITX3 o CALB1 (n = 4 ratas). Datos presentados como media ± DE o Cuantificación de las rotaciones netas por minuto en ratas con puntuaciones de rotación inducidas por anfetamina al inicio ≥5 vueltas ipsilaterales por minuto (n = 5 ratas) después de la lesión y siete meses después del trasplante. Datos presentados como media ± SEM, valor p de la prueba t de dos colas de varianza desigual de Welch. p Comportamiento rotacional a lo largo del tiempo después de la administración de anfetamina antes (líneas continuas) y siete meses después (líneas discontinuas) del injerto de todos los animales injertados (n = 9 ratas). q Preferencia por el uso de la pata contralateral después de la lesión y siete meses después del trasplante. Datos presentados como media ± SEM (n = 9 ratas). o–q las mismas ratas analizadas después de la lesión se analizaron siete meses después del trasplante. Barras de escala: 1000 μm en (a). izquierda y (b), 100 µm en (a). bien; 25 µm en (d, e, f, I, j, k); 10 µm en (c, g, h, l, m).

Si bien nuestro estudio se centra en la especificación basada en RA de las neuronas mDA, la exposición cronometrada de RA debería ser ampliamente aplicable para la especificación de varios tipos de neuronas clínicamente relevantes de hPSC. Por ejemplo, la exposición prolongada a RA (≥ 3 días) junto con la activación de la vía SHH induce progenitores similares a NKX2.2+ HB (Fig. 2a, b) que se sabe que generan secuencialmente neuronas motoras (MN) PHOX2B+ craneales y neuronas serotoninérgicas (5HTN). ) durante el desarrollo humano y del ratón36,54. Dado que los 5HTN modulan una amplia gama de procesos y comportamientos fisiológicos, y están implicados en la fisiopatología de un espectro de afecciones psiquiátricas55,56, examinamos si el tratamiento cronometrado de la AR podría proporcionar una estrategia también para la producción de 5HTN humanos16,55 (Fig. 6a ). La ventana de tiempo durante la cual se producen los MN está definida por la coexpresión de NKX2.2 y el determinante de MN PHOX2B en los progenitores57. En cultivos RA4D + SAG, NKX2.2 y PHOX2B se coexpresaron entre ~9–16 DDC (Fig. 6b) y hubo una acumulación progresiva de MN diferenciados durante este período, según lo determinado por la presencia de PHOX2B+/NKX2. 2- células en 17 DDC, y neuronas PHOX2B+/PRPH+/ISL1+/ISL2+ y PHOX2B+/TuJ1+ en 19 DDC (Fig. 6b). En 17 DDC, PHOX2B se reguló a la baja en la mayoría de los progenitores NKX2.2 + y las células que expresaban el marcador de linaje 5HTN GATA3 habían comenzado a emerger (Fig. 6b), lo que indica que los progenitores experimentaron un cambio de destino de MN a 5HTN en este momento. Para reducir la cantidad de MN prematuros en cultivo, introdujimos un paso de disociación en 24 DCC ya que las neuronas diferenciadas mostraron una menor capacidad para volver a unirse a la placa de cultivo en relación con los precursores inmaduros (Fig. 6a). Con este método, pudimos reducir la cantidad de MN PHOX2B+ en cultivo a 34 DDC a ~6 % (Fig. 6c, d) y obtuvimos cultivos en los que ~60–65 % del total de neuronas HuC/D+ expresaron 5-HT y moléculas marcadores característicos de 5HTN como GATA3, LMX1B, triptófano hidroxilasa 2 (TPH2), transportador de serotonina (SERT) y el autorreceptor 5-HT1A (5-HT1AR) (Fig. 6c-e). Juntos, estos datos proporcionan una prueba de concepto de que la duración cronometrada de la exposición a la AR se puede aplicar para la derivación in vitro efectiva de 5HTN humanos.

un resumen esquemático de las condiciones de diferenciación y la línea de tiempo de los procesos durante la generación de MN y 5HTN. b Inmunocitoquímica de NKX2.2, PHOX2B y GATA3 a los 9 y 17 DDC, y de Tuj1, PRPH, PHOX2B e ISL1/2 a los 19 DDC en cultivos tratados con RA4D + SAG. c Inmunocitoquímica para serotonina (5-HT) junto con MAP2, GATA3 o PHOX2B a los 34 DDC. d Cuantificación de células HuC/D+ que expresan PHOX2B, GATA3 o GATA3 y 5-HT, a 34 DDC (n = 3 diferenciaciones independientes). Datos representados como media ± SD e Inmunocitoquímica de los marcadores indicados en 5HTN a 35-45 DDC. Barras de escala: 100 μm en los paneles (b, c) y 50 μm en el panel (e).

Un objetivo central en la investigación con células madre es el desarrollo de técnicas de diferenciación simples y robustas que den como resultado una producción reproducible del producto celular deseado con alto rendimiento y pureza58. En este estudio, presentamos un enfoque alternativo para la derivación de neuronas mDA humanas trasplantables que es principalmente diferente de los protocolos de neuronas mDA basados ​​en hPSC de última generación, ya que utiliza señalización RA en lugar de CHIR99021 o CHIR99021 y FGF8 para imponer Identidad MB a progenitores neurales derivados de hPSC. Cuando se combina con la activación de la vía SHH, un pulso de AR de 48 horas da como resultado progenitores vMB de especificación constante con una contaminación insignificante de células que expresan identidades diencefálicas o rombencéfalas. Los progenitores de vMB especificados para AR se someten a pasos de diferenciación y maduración progresivos consistentes con el desarrollo normal de neuronas mDA, lo que da como resultado un alto rendimiento de neuronas mDA que expresan características funcionales en cultivos a largo plazo.

Mostramos que RA es suficiente para imponer identidades cerebrales progresivamente más caudales de una manera comparable a la activación progresiva de la señalización WNT canónica por CHIR99021. Sin embargo, una característica distintiva del patrón basado en RA es que la especificación regional se establece por la duración de la exposición a la señal y que la respuesta del patrón es relativamente insensible a las concentraciones alteradas de RA. RA difiere en este aspecto de la mayoría de las señales de morfógenos de desarrollo que especifican diferentes destinos a diferentes concentraciones, incluido WNT12,16. Podríamos asignar la tolerancia a niveles variables de entrada de RA a un ciclo de retroalimentación negativa mediante el cual las fluctuaciones de la entrada de RA se contrarrestan al igualar los cambios en la tasa de rotación de RA por CYP26A143. Este circuito regulador es crucial para una especificación regional confiable, ya que la respuesta del patrón se interrumpió después de la inhibición farmacológica de CYP26A1. En consecuencia, estas características regulatorias brindan robustez y reproducibilidad al procedimiento de diferenciación y deberían contribuir a reducir la necesidad de ajustes de lote a lote y de línea a línea. Esto podría facilitar las diferenciaciones en las que se consideran varias líneas hiPSC para uso clínico o el modelado de enfermedades in vitro2,8, así como los esfuerzos de ampliación cuando se necesita una gran cantidad de células. Además, además de promover el destino de las neuronas mDA, mostramos que la duración prolongada de la exposición a la AR podría usarse para producir MN craneales y 5HTN, lo que indica una amplia aplicabilidad del paradigma de diferenciación. Si bien nuestro estudio establece firmemente que la AR es suficiente para especificar el destino mesencefálico independientemente de la señalización de WNT y FGF8, un estudio anterior ha explotado una combinación de AR, WNT1, FGF8a y SHH para la derivación basada en hPSC de neuronas mDA59. En este estudio, se observó un rendimiento de ~1 % de neuronas FOXA2+/TH+ en cultivos a largo plazo, pero las neuronas FOXA2+/TH+ se perdieron cuando se omitió selectivamente WNT1 del procedimiento de diferenciación. En consecuencia, el uso de RA en este entorno particular no fue suficiente para especificar el destino de las neuronas mDA y, en cambio, esto podría asignarse a la señalización WNT.

Descubrimos que la exposición temprana a la AR, en el contexto del tratamiento con dSMADi, también promueve una conversión rápida y similar a un interruptor de OCT4+/SOX1− hPSC en OCT4−/SOX1+ NSC. Esta actividad tiene un efecto de sincronización en las células a nivel de la población y presumiblemente explica por qué los progenitores de vMB especificados para AR experimentan una transición relativamente coordinada de un estado de FP a un estado neurogénico ~ 2 a 3 semanas después de que finaliza el tratamiento de AR. La disolución de pluripotencia impulsada por RA también es deseable desde una perspectiva de seguridad, ya que minimiza el riesgo potencial de reactivación de genes de pluripotencia o que las células esporádicas mantengan rasgos de pluripotencia durante períodos de tiempo más prolongados. Sin embargo, dicho esto, es importante recalcar que no hay informes de efectos secundarios adversos, como el sobrecrecimiento celular, después de extensas evaluaciones preclínicas o de experimentos clínicos iniciados utilizando protocolos de neuronas mDA anteriores60,61.

Cuando se injertan en el cuerpo estriado de ratas lesionadas con 6-OHDA, los progenitores de vMB especificados para AR se injertan, se diferencian en neuronas mDA maduras que sobreviven a largo plazo y restauran la función motora. La mayoría de las neuronas TH+ presentes en los injertos expresaron EN1, lo que se debe en particular a que EN1 es necesaria para la supervivencia a largo plazo de las neuronas mDA en ratones62,63. Dado que nuestros análisis in vitro establecen una expresión insignificante de EN1 en progenitores de vMB especificados por AR (Figs. 2e, 4m), no examinamos EN1 en la preparación utilizada para el injerto. Por lo tanto, no podemos concluir formalmente que este lote careciera de expresión de EN1, lo que potencialmente podría influir en el número de neuronas EN1+/TH+ generadas. Sin embargo, como se observa una regulación al alza de EN1 en un subconjunto de neuronas mDA relativamente jóvenes in vitro, parece más plausible que la alta proporción de neuronas EN1+/TH+ en los injertos refleje una activación progresiva de EN1 en la maduración de neuronas mDA específicas de RA con el tiempo. La cuantificación de SOX6, PITX3 y GIRK2 en injertos indica además que la mayor proporción de neuronas mDA especificadas por RA expresan una identidad de subtipo similar a A9. Por lo tanto, la especificación de vMB basada en RA ofrece una ruta alternativa potencial para generar células para la terapia celular en la EP. En este estudio de trasplante inicial, aislamos progenitores de vMB para injertar en un estado FP joven que proporcionó una importante prueba de concepto de que las neuronas mDA generadas mediante el protocolo basado en RA funcionan a la par con las neuronas mDA generadas mediante protocolos basados ​​en CHIR13,17,52 ,53.

Dado que las células específicas de AR experimentan una diferenciación relativamente sincronizada, en futuros experimentos será emocionante explorar si el injerto de progenitores de vMB aislados en otras etapas de maduración podría mejorar potencialmente el rendimiento, la función y la inervación de las neuronas mDA, o la composición de los injertos64. La identificación de RA como un agente de patrón MB proporciona además una herramienta adicional para explorar si el uso combinatorio de señales de patrón puede mejorar la calidad de las preparaciones, como se mostró anteriormente para el desarrollo progresivo de protocolos de neuronas mDA basados ​​en CHIR99021/FGF813,17,65. Por ejemplo, los protocolos CHIR- recientes utilizaron FGF817 o un segundo CHIR-boost18 para reducir los progenitores diencefálicos no deseados en las preparaciones mediante la promoción de una identidad de progenitor vMB EN1+ caudal, lo que mejoró el resultado del injerto. Los progenitores especificados por RA adquieren una identidad de vMB de tipo EN1- más rostral sin ninguna contaminación significativa de las células diencefálicas, lo que también dio como resultado un buen resultado del injerto. En relación con esto, llama la atención que existe una distribución topológica desigual de los subtipos de neuronas mDA a lo largo del eje rostro-caudal de la MB adulta, y con una concentración de subtipos A9 rostralmente51,66. Hasta qué punto esto se relaciona con el origen posicional del nacimiento de las neuronas sigue siendo incierto, pero dado que RA impone una identidad de vMB de tipo rostral mientras que CHIR y FGF8 promueven identidades de vMB de tipo caudal17,18, será interesante explorar si el subpatrón de progenitores de vMB mediante el uso combinatorio de estas señales puede usarse para modular la composición de subtipos de neuronas mDA en injertos. Además, dado que RA actúa aguas arriba de las señales que emanan del organizador ístmico, es concebible que la activación secuencial de la señalización de RA y WNT en cultivos de hPSC imite más de cerca el desarrollo embrionario normal, lo que podría ser beneficioso tanto con respecto al rendimiento como a la eficiencia funcional de mDA derivado de hPSC. neuronas después del injerto.

Las líneas ESC humanas (HS980 y HS401)67 fueron proporcionadas por los Dres. Outi Hovatta y Fredrik Lanner (Instituto Karolinska). Las líneas iPSC humanas (SM55 y SM56) fueron proporcionadas por los Drs. Pamela J. McLean y Simon Moussaud (Laboratorio de Neuroregeneración dentro del Centro de Medicina Regenerativa, Clínica Mayo). El aislamiento de fibroblastos primarios de piel humana (obtenidos con el consentimiento del paciente) y la generación de iPSC fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de Mayo Clinic según los protocolos del IRB (IRB 09-003803). Las células se mantuvieron en placas recubiertas de vitronectina humana recombinante (VTN) (Thermo Fisher Scientific) en medio iPS-Brew XF (Miltenyi Biotech). Las células se pasaron con EDTA (0,5 mM) y se añadió inhibidor de ROCK al medio a una concentración final de 10 µM durante las primeras 24 h después de la siembra. Todas las líneas celulares dieron negativo para la contaminación por micoplasma. Todas las diferenciaciones se realizaron utilizando la línea hESC HS980 a menos que se indique lo contrario.

Para la diferenciación de PSC, los cultivos de PSC confluentes del 80 al 90 % se enjuagaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se trataron con EDTA (0,5 mM en PBS) durante 5 a 7 minutos y se resuspendieron en una suspensión de células individuales en PBS. Las células se centrifugaron a 400 g y se resuspendieron en medio N2B27 (DMEM/F12: suplementos Neurobasal (1:1), 0,5 × N2 y 0,5 x B27 (más vitamina A), 1 × aminoácidos no esenciales, GlutaMAX al 1 %, 55 µM β-mercaptoetanol, todo de Thermo Fisher Scientific) que contiene 5 μM de SB431542 (Miltenyi Biotech) y 2,5 μM de DMH1 (Santa Cruz Biotech) (inhibición dual de SMAD) e inhibidor de 10 μM de ROCK (durante las primeras 48 h después de la siembra). Las células se sembraron en una superficie recubierta de VTN (2 μg/cm2) y fibronectina (FN) (2 μg/cm2) (Sigma) a una densidad de 60 000–80 000 células/cm2 para experimentos basados ​​en RA y análogos de RA, y 20 000 células /cm2 para experimentos CHIR99021. SAG1.3 (Santa Cruz Biotechnology), CHIR99021 (Miltenyi Biotech), all-trans RA, 9-cis RA, 13-cis RA, ácido tazaroténico, R115866 (todo Sigma), EC23 (Amsbio) se usaron en concentraciones y puntos de tiempo descrito en la sección de resultados. Los análogos de RA y RA todo trans se disolvieron en DMSO (solución madre 10 mM), se dividieron en alícuotas en condiciones de protección contra la luz y se usaron en el plazo de un mes. Las alícuotas se almacenaron a -20 °C y se usaron una vez.

Para la diferenciación de neuronas mDA (ver esquema en la Fig. 4), los progenitores neurales se disociaron mecánicamente a 9 DDC con Stem Cell Passaging Tool (Thermo Fisher Scientific) y se sembraron en una proporción de 1:3 en medio N2B27 que contenía 10 µM de inhibidor de ROCK (durante las primeras 48 h). después de la disociación) en superficies recubiertas con VTN y FN. Para la diferenciación terminal in vitro de las neuronas dopaminérgicas, las células se disociaron a 23 o 24 DDC con accutase (Thermo Fisher Scientific) y se sembraron (600 000–800 000 células/cm2) en VTN + FN + Laminina (2 μg/cm2 cada una) (Sigma) superficie recubierta en medio B27+ (Thermo Fisher Scientific) suplementado con BDNF (10 ng/ml) y GDNF (10 ng/ml) (Miltenyi Biotech), ácido ascórbico (0,2 mM) (Sigma), inhibidor de ROCK 10 µM (Miltenyi Biotech) (durante las primeras 48 h después de la disociación). Para electrofisiología y análisis del contenido de neurotransmisores, las células se cultivaron en medio de electrofisiología B27 (Thermo Fisher Scientific) suplementado con BDNF (10 ng/ml) y GDNF (10 ng/ml) (Miltenyi Biotech), ácido ascórbico (0,2 mM) (Sigma) y Inhibidor de ROCK 10 µM (durante las primeras 48 h después de la disociación) durante al menos 5 días antes del experimento. El medio se cambió de forma rutinaria cada 2-3 días.

Para la diferenciación de MN y 5HTN (ver dibujo esquemático en la Fig. 6), las células se resuspendieron en medio N2B27 que contenía 5 μM de SB431542 y 2,5 μM de DMH1, y 10 μM de inhibidor de ROCK (durante las primeras 48 h después de la siembra) y se sembraron en VTN + FN ( 2 μg/cm2 cada una) superficie recubierta a una densidad de 60 000–80 000 células/cm2. Las células se trataron con 200 nM de RA o EC23 durante los primeros cuatro días. Se añadió SAG1.3 200 nM a los medios de diferenciación de 2–9 DDC. Los cultivos se disociaron mecánicamente a 9 DDC con Stem Cell Passaging Tool, se resuspendieron en medio N2B27 que contenía inhibidor de ROCK 10 µM (durante las primeras 48 horas después de la disociación) y se sembraron en una proporción de 1:3 en superficies recubiertas con VTN + FN. Para la diferenciación terminal in vitro de 5HTN, las células se disociaron a 23 o 24 DDC con accutase y se sembraron (600 000–800 000 células/cm2) en VTN + FN + Laminin (2 μg/cm2 cada uno) superficie recubierta en medio B27+ suplementado con 10 ng /ml de BDNF, 10 ng/ml de GDNF, ácido ascórbico 0,2 mM, inhibidor de ROCK 10 µM (durante las primeras 48 h después de la disociación) y DAPT 10 µM. El medio se cambió de forma rutinaria cada 2-3 días.

Las células se fijaron durante 12 min. a temperatura ambiente (TA) en paraformaldehído al 4 % en PBS, se enjuagó tres veces en PBST (PBS con Triton-X100 al 0,1 %) y se bloqueó durante 1 h a TA con solución de bloqueo (FCS al 3 %/Triton-X100 al 0,1 % en PBS ). Luego, las células se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C, seguido de una incubación con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo durante 1 hora a temperatura ambiente. Tanto los anticuerpos primarios como los secundarios conjugados con fluoróforo se diluyeron en una solución de bloqueo. Se usaron anticuerpos secundarios conjugados con Alexa (488, 555, 647) apropiados (Molecular Probes). La inmunohistoquímica se realizó como se describe antes 17. Los anticuerpos primarios y secundarios utilizados se enumeran en la Tabla complementaria 4.

Las imágenes de inmunofluorescencia se adquirieron con un microscopio confocal Zeiss LSM 700 con software ZEN 2011, un microscopio fluorescente Zeiss AxioImager M2 con software ZEN2 y Molecular Devices ImageXpress Micro (software versión 6.0), y se analizaron con ImageJ/Fiji (v1.53) de código abierto. , CellProfiler (v3.1.5) o MetaXpress (v 5.0).

El ARN total se aisló utilizando el kit Quick-RNA Mini Prep Plus (Zymo Research). El ADNc se preparó usando el kit de síntesis de ADNc Maxima First Strand (Thermo Fisher Scientific). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó en un termociclador del sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 utilizando Fast SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). El análisis de la expresión génica se realizó utilizando el método 2−ΔΔCt, donde la expresión génica relativa se normalizó a los niveles de transcripción de GAPDH. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla complementaria 3.

Para la secuenciación de ARN de Illumina, la integridad del ARN se determinó en un chip Agilent RNA 6000 Pico, utilizando Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies). Para la construcción de bibliotecas se utilizó el kit Illumina TruSeq Stranded mRNA con selección Poly-A. Las muestras se secuenciaron en instrumentos NovaSeq6000 y HiSeq2500 con una configuración de 2×51. La conversión de Bcl a FastQ se realizó utilizando bcl2fastq_v2.19.1.403 del paquete de software CASAVA. Las lecturas se asignaron al ensamblaje del genoma humano, compilar GRCh37 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/] usando STAR (v 2.6.1a)68. Las abundancias a nivel de genes se estimaron como FPKM utilizando StringTie269. El resumen de lectura de cada gen (es decir, recuentos) se calculó utilizando featureCounts70. Se sumaron múltiples identificaciones del gen ENSEMBL por símbolo del gen HUGO conocido. La expresión diferencial se estimó a partir de los valores de FPKM transformados logarítmicamente. La significación estadística de la expresión diferencial se estimó con la prueba t de la función R, usando valores p y tasa de descubrimiento falso (paquete R v. 3.6.2), asumiendo una varianza desigual y aplicando la modificación de los grados de libertad galeses. Dependiendo de la configuración experimental, el diseño se consideró emparejado o no emparejado. Los valores de p resultantes de la expresión diferencial se acompañaron con los respectivos valores de cambio de pliegue. Los valores de p se ajustaron para pruebas múltiples mediante el cálculo de la tasa de descubrimiento falso (FDR) mediante el método de Benjamini y Hochberg71.

El trazado de mapas de calor y la visualización de PCA se realizaron con herramientas en línea (versión beta) en [https://www.evinet.org/]72 utilizando la configuración de parámetros estándar del paquete R heatmaply y la función princompas back-end.

Las células se lisaron en tampón RIPA (Sigma) complementado con cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa (ThermoFisher Scientific) y se incubaron en hielo con agitación durante 30 min. El lisado se aclaró mediante centrifugación (20 000 g durante 20 min a 4 °C) y la concentración de proteínas se determinó mediante el ensayo de ácido bicinconínico (BCA). El lisado de proteínas se resuspendió en tampón LDS (Thermo Fisher Scientific) que contenía 2-mercaptoetanol al 2,5 % y se desnaturalizó a 95 °C durante 5 min. Se cargaron 15–30 μg de proteína por carril de un gel de poliacrilamida SDS al 4–15 % (Bio-Rad) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (BioRad) utilizando Trans-Blot Turbo System (BioRad). Las membranas se incubaron en una solución de bloqueo (TBS con Tween-20 al 0,1 % (TBST) y leche descremada en polvo al 5 %) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de una incubación durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios. Después de 3 lavados con TBST a temperatura ambiente, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. La detección de HRP se realizó mediante sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Dura y la señal se detectó en un ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad). Los anticuerpos primarios para la inmunotransferencia se enumeran en la Tabla complementaria 4.

Las concentraciones de noradrenalina (NA), dopamina (DA) y serotonina (5-HT) en 42 cultivos DDC se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección electroquímica.

Los cultivos a 42 DDC diferenciados en dSMADi+RA2D se incubaron en solución fisiológica (NaCl 140 mM; KCl 2,5 mM; MgCl2 1 mM; CaCl2 1,8 mM; tamponados con HEPES (20 mM) a pH 7,4) o en solución alta en K+ (solución fisiológica con K+ 56 mM, y la concentración de iones Na+ se redujo proporcionalmente para mantener la misma osmolaridad total). Después de 20 min (min.), las soluciones de incubación se recogieron y se usaron para el análisis del contenido de neurotransmisores. Para determinar el contenido de neurotransmisores celulares, las células se lisaron en H2O. Las soluciones de incubación y los lisados ​​celulares se desproteinizaron con ácido perclórico 0,1 M y después de 15 min. incubación en hielo, las muestras se centrifugaron dos veces a 20.000 g durante 15 min. como se describió antes73. La concentración de proteína se determinó por el método BCA. A continuación, las muestras se analizaron en un sistema de HPLC compuesto por HTEC500 (Eicom, Kyoto, Japón) y un micromuestreador refrigerado CMA/200 (CMA Microdiálisis, Estocolmo, Suecia) equipado con un circuito de 20 μl y funcionando a +4 °C. El potencial del electrodo de trabajo de carbón vítreo fue de +450 mV frente al electrodo de referencia Ag/AgCl. La separación se logró en una columna Eicompak CAX de 200 × 2,0 mm (Eicom). La fase móvil fue una mezcla de metanol y tampón de fosfato 0,1 M (pH 6,0) (30:70, v/v) que contenía cloruro de potasio 40 mM y EDTA-2Na 0,13 mM. Los cromatogramas se registraron e integraron usando el sistema de adquisición de datos computarizado Clarity (DataApex).

La longitud promedio de las neuritas se cuantificó utilizando el complemento NeuronJ en el paquete ImageJ74 [https://imagej.net/plugins/neuronj] en imágenes inmunofluorescentes de neuronas TH+ (ampliación 10x, 0,5 zoom). El número de ramificaciones por neurona se calculó utilizando imágenes inmunofluorescentes de neuronas TH+ a mayor aumento, 20x.

Los portaobjetos que contenían neuronas de entre 35 y 60 días se colocaron en una cámara de registro que contenía un medio de electrofisiología (Neurabasal Medium, Electro; Thermo Fisher Scientific). Para el registro, las neuronas se visualizaron utilizando un microscopio DIC (Scientifica, Uckfield, Reino Unido) con un objetivo de 60x (Olympus, Tokio, Japón). Las pipetas de parche (resistencia de 3 a 5 MΩ para registros de abrazadera de voltaje, de 5 a 10 MΩ para registros de abrazadera de corriente), tiradas de un extractor de micropipetas P-87 Flaming/Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, EE. UU.), se llenaron con 154 Solución de NaCl mM para registros de pinza de voltaje o solución de KCl 120 mM que contiene biocitina 8 mM para registros de pinza de corriente. Las señales se registraron con un amplificador Axon MultiCalmp 700B y se digitalizaron a 20 kHz con un digitalizador Axon Digidata 1550B (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.). Se compensaron la resistencia de acceso y la capacitancia de la pipeta. Los registros de pinzamiento de tensión adjuntos a la célula se filtraron con paso de banda a 2 Hz bajo/1 kHz alto y los eventos que mostraban una hiperpolarización posterior se consideraron potenciales de acción espontáneos. Para evaluar los patrones de picos, las neuronas registradas en el modo de pinza actual se mantuvieron a un potencial de membrana de -60 mV. Se aplicaron pasos de corriente cercanos al umbral para determinar la corriente de reobase, luego se aplicaron pasos de corriente de 1 s proporcionales a la corriente de reobase. La presencia de corrientes de Na+ y K+ se determinó en modo de abrazadera de voltaje aplicando un paso de voltaje con intervalos de 10 mV desde una retención de -60 mV. Las corrientes se midieron desde la línea de base (10 ms antes del inicio del paso de voltaje) hasta el pico del componente de corriente de Na+ rápido característico o el pico del componente de corriente de K+ lento. Las propiedades eléctricas se extrajeron utilizando un script personalizado de Matlab (MathWorks, Natick, MA, EE. UU.) [https://zenodo.org/record/6367837#.YjSC3DUo9PY]. Después de la grabación, los portaobjetos se fijaron, se tiñeron y se tomaron imágenes como se describe anteriormente. La biocitina se visualizó usando Streptavidin Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific).

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Directiva de la Unión Europea (2010/63/UE) y fueron aprobados por el Comité de Ética de Malmö/Lund para el uso de animales de laboratorio (Malmö/Lunds djurförsöksetiska nämnd) y el Departamento de Agricultura de Suecia (Jordbruksverket ). Se compraron ratas "desnudas" atímicas hembras adultas de Harlan/Envigo Laboratories (Hsd:RH-Foxn1rnu) y se alojaron con acceso ad libitum a comida y agua, bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales tenían un mínimo de 16 semanas al comienzo del experimento (180 g). Los procedimientos quirúrgicos y la lesión de la vía nigroestriatal mediante una única inyección unilateral de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) en el haz del prosencéfalo medial derecho (MFB) se realizaron como se describió anteriormente75. Brevemente, los procedimientos quirúrgicos se realizaron bajo anestesia general utilizando una solución de fentanilo y medetomidina (20:1) inyectada por vía intraperitoneal (1 ml/kg; Apoteksbolaget, Suecia). Se indujo la lesión de la vía nigroestriatal en ratas "desnudas" mediante inyección unilateral de 6-hidroxidopamina en el MFB derecho, con un volumen de 4 µL a una concentración de base libre de 3,5 mg/mL en las siguientes coordenadas relativas a bregma: A/P − 4; M/L −1,2; D/V (de duramadre) −7,5. La gravedad de la lesión se midió cuatro semanas después de la inyección de 6-OHDA mediante rotaciones inducidas por anfetamina registradas durante 90 min utilizando un sistema automatizado (Omnitech Electronics)17 y mediante la prueba de escalonamiento13. La rotación inducida por anfetamina se indujo mediante una inyección intraperitoneal de 2,5 mg/kg de clorhidrato de anfetamina (Sigma). Ocho semanas después de la lesión de 6-OHDA MFB, las ratas "desnudas" recibieron una dosis total de 150 000 progenitores derivados de hESC en el día 14 de diferenciación en el cuerpo estriado como se describió previamente75. Brevemente, se inyectó un volumen de 2 µL de suspensión celular (se inyectaron células a una concentración de 75 000 células/µL a una velocidad de 1 µL por minuto seguido de un tiempo de difusión de 2 minutos) en el cuerpo estriado en las siguientes coordenadas relativas a bregma : A/P + 0,5; M/L-3; D/V (de duramadre) −4,5; ajustado a cabeza plana. La prueba de rotación y escalonamiento inducida por anfetaminas se evaluó 7 meses después del injerto. Los animales se perfundieron después del análisis de comportamiento y luego se procesaron para inmunohistoquímica.

Los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de Student, la prueba t de varianza desigual de Welch o la prueba de Wilcoxon por pares y se realizaron para el análisis estadístico de dos grupos. Los métodos estadísticos utilizados se indican en las leyendas de las figuras correspondientes.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Datos de origen para las Figs. 1 a 6 y figuras complementarias. 1–7 se proporcionan con este documento. Los conjuntos de datos de RNA-seq informados en este manuscrito se han depositado en Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE147404. Ensamblaje del genoma humano, construcción GRCh37 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/].

El guión y los datos para el análisis de las propiedades eléctricas de las neuronas están disponibles en [https://zenodo.org/record/6367837#.YjSC3DUo9PY].

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Descargar referencias

Agradecemos a los Dres. Outi Hovatta y Fredrik Lanner (Karolinska Institutet) para las líneas hESC, los Dres. Pamela J. McLean y Simon Moussaud, Laboratorio de Neuroregeneración dentro del Centro de Medicina Regenerativa, Clínica Mayo (Clínica Mayo, Jacksonville) para líneas hiPSC. Agradecemos el apoyo de la Infraestructura Genómica Nacional en Producción Genómica, Estocolmo, por su asistencia con la secuenciación paralela masiva y el acceso a la infraestructura computacional UPPMAX. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Knut y Alice Wallenberg (KAW2011.0661, KAW2012.0101; JE), el Consejo Sueco de Investigación (2013-4155, 2017-02089; JE), la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica (SRL10-0030; JE), Hjärnfonden (FO2017-0037, F02019-0154, F02021-0159; JE), Parkinson Fonden (1189/19, 1257/20, 1326/21; JE), Fundación Novo Nordisk (NNF20OC0062355; JE), Instituto Karolinska ( JE).

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por el Instituto Karolinska.

Estos autores contribuyeron igualmente: José M. Dias, Andrew F. Adler, Mariya Kozhevnikova.

Departamento de Biología Celular y Molecular, Karolinska Institutet, 171 65, Estocolmo, Suecia

Zhanna Alekseenko, José M. Dias, Mariya Kozhevnikova, Ashwini Jeggari, Svitlana Vasylovska & Johan Ericson

Neurobiología del Desarrollo y Regenerativa, Departamento de Ciencias Médicas Experimentales, Centro de Neurociencia Wallenberg, Universidad de Lund, 221 84, Lund, Suecia

Andrew F. Adler, Sara Nolbrant y Malin Parmar

Centro de Células Madre de Lund, Universidad de Lund, 22184, Lund, Suecia

Andrew F. Adler, Sara Nolbrant y Malin Parmar

Departamento de Biociencias y Nutrición, Karolinska Institutet, 141 83, Huddinge, Suecia

Josina Anna van Lunteren y Marie Carlén

Departamento de Fisiología y Farmacología, Karolinska Institutet, 171 65, Estocolmo, Suecia

Takashi Yoshitake y Jan Kehr

Pronexus Analytical AB, Bromma, Suecia

Jan Kehr

Departamento de Neurociencia, Karolinska Institutet, 171 65, Estocolmo, Suecia

marie carlen

Departamento de Microbiología, Tumor y Biología Celular, Karolinska Institutet, 171 65, Estocolmo, Suecia

andréy alekseyenko

Laboratorio Science for Life, 171 21, Solna, Suecia

andréy alekseyenko

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ZA: concepción y diseño del estudio, diferenciación y caracterización de hPSC, análisis e interpretación de datos. JMD y MK: manipulación, diferenciación y caracterización de hPSC, interpretación de datos. AFA: trasplante in vivo, análisis de comportamiento, análisis de datos de trasplante con la contribución de SNJAvL y MC: electrofisiología y análisis de datos. AJ y AA: análisis de datos de RNA-seq y bioinformática. SV: diferenciación y caracterización de hPSC. JK y TY: análisis HPLC. MP diseño y supervisión de estudios de trasplante. JE: supervisión, concepción y diseño del estudio, y redacción del manuscrito junto con ZA, JMD, AFA y MP

Correspondencia a Johan Ericson.

JE y ZA presentaron una solicitud de patente (n.º 2006792.2) relativa a los resultados presentados en el documento con el apoyo de Karolinska Institute Innovations AB. MP es propietario de Parmar Cells AB y co-inventor de las siguientes patentes WO2016162747A2, WO2018206798A1 y WO2019016113A1. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Alekseenko, Z., Dias, JM, Adler, AF et al. Derivación robusta de neuronas dopaminérgicas trasplantables a partir de células madre pluripotentes humanas mediante la administración programada de ácido retinoico. Nat Comun 13, 3046 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30777-8

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Recibido: 01 febrero 2021

Aceptado: 11 de mayo de 2022

Publicado: 01 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30777-8

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