Verificación de la realidad de los organoides en neurociencia

Nature Methods volumen 17, páginas 961–964 (2020)Citar este artículo

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Para estudiar mejor el neurodesarrollo humano, los investigadores proponen organoides como modelos cerebrales.

Los organoides, que son modelos experimentales tridimensionales derivados de células madre, están incursionando en muchos campos, incluida la neurociencia, donde existe una gran necesidad de modelos de procesos complejos como el neurodesarrollo intrauterino y los trastornos neuropsiquiátricos1,2,3,4. Pero los organoides cerebrales no están teniendo exactamente un camino tranquilo hacia la neurociencia. "Desde mi punto de vista, los organoides cerebrales son modelos geniales de sí mismos", dice la neurocientífica de la Universidad de Stanford, Carla Shatz. Al igual que con todos los estudios in vitro, dice, "incluso en las condiciones más realistas de las tres dimensiones en lugar de las planas, todo lo que aprendes te dice lo que puede suceder, no lo que sucede in vivo". Estos modelos pueden enseñar mucho sobre la biología celular de las neuronas humanas, "lo cual es maravilloso", dice. "Entonces la pregunta es, ¿cómo probar los hallazgos con la realidad usando muestras de cerebro humano?"

Sin duda, dicen los desarrolladores de métodos de organoides cerebrales, estos no son 'cerebros en un plato' ni ventanas a todas las facetas del neurodesarrollo en el útero, ni revelan cada detalle de cómo el cerebro de un recién nacido se convierte en el cerebro de una personita con un caso de la 'terribles dos' y un dominio decidido de la palabra "no". Como dice Madeline Lancaster del Laboratorio de Biología Molecular de MRC, "hasta ahora todos los organoides cerebrales in vitro carecen de muchas de las características importantes del cerebro in vivo", como un sistema vascular funcional y un sistema inmunológico. Los organoides carecen de la anatomía del cerebro humano real, dice Giorgia Quadrato de la Escuela de Medicina Keck de la Universidad del Sur de California. Pero, dice, son modelos que nos permiten caracterizar el desarrollo y la enfermedad del cerebro humano de formas que han eludido a la comunidad neurocientífica durante décadas. Para hacer crecer su comunidad de investigación y abordar las preocupaciones de aquellos en neurociencia que podrían ver los organoides y las conclusiones extraídas de ellos con el ceño fruncido, Lancaster, Quadrato y otros se están duplicando en el avance de los métodos de organoides.

Los organoides cerebrales son cada vez más complejos y dinámicos. El laboratorio de Lancaster ha generado organoides a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) que pueden secretar un líquido similar al líquido cefalorraquídeo (LCR)5. Es un modelo del plexo coroideo (ChP) del cerebro, que se encuentra en cada ventrículo del cerebro y secreta LCR. Las células epiteliales coroideas regulan lo que pasa de la sangre al LCR. Como señalan Violeta Silva-Vargas y Fiona Doetsch de la Universidad de Basilea6, "la falta de herramientas ha limitado la exploración de la ChP, especialmente en humanos". Desde una perspectiva proteómica, dice Lancaster, es difícil distinguir la diferencia entre el fluido que producen estos organoides y el líquido cefalorraquídeo real del cerebro. "Pero realmente no podemos llamarlo LCR real porque se produce in vitro y hay cosas que provienen de los medios, como proteínas derivadas de ratones o vacas, que por supuesto no estarían presentes in vivo en el LCR humano", dice. . La albúmina de vaca, y no la albúmina humana, está en este sistema porque la albúmina de suero bovino está presente como un aditivo del medio celular. Desde la publicación, ella ha tenido noticias de laboratorios que planean usar el sistema para pruebas de neurotoxicología para verificar cruces no deseados al cerebro. Otros equipos planean explorar mejores formas de introducir medicamentos en el cerebro o cómo podría cambiar el LCR en condiciones de enfermedad. El laboratorio de Lancaster está utilizando los organoides para estudiar el desarrollo y la evolución del plexo coroideo, también en relación con el resto del cerebro. "También estamos descubriendo que estos organoides brindan una ventana interesante a la biología de esta región cerebral poco estudiada, y que también se pueden usar junto con otros organoides cerebrales para comprender la biología de la enfermedad, incluidos los efectos del SARS-CoV-2". ella dice.

Como estudiante de medicina en Rumania, el investigador de la Universidad de Stanford, Sergiu Pașca, quería una mejoría para sus pacientes que padecían trastornos neuropsiquiátricos, ciertamente no mediante el uso de trepanación, en la que se perfora un agujero en el cráneo de una persona, para extraer una 'piedra de la locura', como se realizó. en la Edad Media y representado por Hieronymus Bosch, uno de los pintores favoritos de Pașca. En los veranos, Pașca trabajaba en los laboratorios del Instituto Max Planck para la Investigación del Cerebro en Frankfurt y registraba datos de la corteza visual de los gatos. "Me sorprendió lo que realmente significa tener acceso a una neurona", dice. Soñaba con estudiar directamente las neuronas humanas. Cuando surgieron formas de generar iPSC, saltó a una carrera de investigación como becario postdoctoral en el laboratorio de Ricardo Dolmetsch en Stanford. Modeló una mutación vinculada al autismo que afecta los canales de calcio en las neuronas eléctricamente activas derivadas de las iPSC. Sembrar neuronas en monocapas y mantenerlas vivas para observar el tiempo suficiente para modelar el desarrollo cortical fue "una pesadilla", dice. La frustración lo llevó a probar una placa de baja adherencia donde las células se convirtieron en estructuras esféricas flotantes. Ahora, en su propio laboratorio de Stanford, dirige un equipo que ha avanzado en estas técnicas de guía de organoides que viven hasta 800 días. Los organoides son una forma de ampliar los experimentos. Se pueden evaluar a alta resolución con análisis unicelulares. La aplicación de técnicas de biología molecular a los organoides es una forma de llegar a la naturaleza específica de los humanos de los trastornos neuropsiquiátricos y el desarrollo del cerebro. El laboratorio de Pașca e investigadores de otros lugares han vinculado organoides en assembloids. Uno de estos ensambloide implica un organoide enriquecido para neuronas excitatorias y otro enriquecido para inhibidoras7. El modelo captura aspectos de la búsqueda de rutas axonales y también de la migración, como la forma en que algunas poblaciones de neuronas migran desde el cerebro anterior ventral al dorsal. Esta migración ocurre en el cerebro de un feto y continúa después del nacimiento, dice Pașca, y parece estar desordenada en una serie de condiciones del neurodesarrollo, incluidos algunos tipos de epilepsia y autismo. El laboratorio está desarrollando un ensamblaje corticomotor de tres vías. Es un organoide cortical, un organoide de la médula espinal y un músculo desarrollado in vitro en una estructura tridimensional. En el cuerpo, las neuronas corticales se proyectan a la médula espinal y se conectan a las neuronas motoras espinales, que se proyectan al músculo y forman uniones neuromusculares que pueden desencadenar la actividad muscular. En este modelo de circuito, la estimulación optogenética del organoide cortical hace que el organoide muscular se contraiga.

Al hacer organoides cerebrales, los investigadores eligen entre muchos protocolos y los modifican. Para su último proyecto, Lancaster modificó el protocolo existente del laboratorio para fabricar organoides cerebrales. "De hecho, descubrimos que varios enfoques para generar una identidad del cerebro anterior funcionan bien como punto de partida", dice ella. Eso podría implicar un kit de organoide cerebral como el comercial de Stemcell Technologies, dice, o medios caseros y un andamio de fibras hecho de polilactida-co-glicolida como lo ha hecho su laboratorio anteriormente8. Para promover una identidad subregional del plexo coroideo, dice Lancaster, fue clave usar activadores de la vía Wnt y Bmp para ayudar a dirigir el tejido a una identidad más dorsal, reflejando el área donde se desarrolla el plexo coroideo. Aunque es un ajuste simple, "la parte difícil fue determinar la concentración y el momento correctos, pero una vez que lo descubrimos, descubrimos que este pequeño empujón es altamente eficiente".

Como dice Quadrato de la USC, las condiciones molestas como el trastorno del espectro autista, el trastorno bipolar o la esquizofrenia tienen una variedad de síntomas que pueden variar considerablemente entre individuos. Las condiciones son principalmente poligénicas, con combinaciones heterogéneas de muchos alelos que actúan juntos, y varios cambios anatómicos y de circuitos también pueden desempeñar un papel. Cada paciente puede tener un fondo genético diferente. Para modelar los mecanismos subyacentes a estos trastornos, se puede comenzar con las células de un paciente, inducirlas para que se conviertan en células madre pluripotentes, generar organoides a partir de ellas y realizar una caracterización integral, incluida la secuenciación de ARN de una sola célula. Los organoides corticales se han vuelto más robustos y reproducibles, dice Quadrato, gracias al trabajo de varios equipos, incluido el laboratorio de Paola Arlotta en la Universidad de Harvard9,10. (Quadrato completó su beca postdoctoral en el laboratorio de Arlotta pero no dirigió el trabajo en cuestión). El equipo de Arlotta y sus colegas de otras instituciones aplicaron secuenciación de ARN de una sola célula para caracterizar células de 21 organoides recolectados a los tres y seis meses. Los organoides corticales de diferentes líneas de células madre humanas, tanto masculinas como femeninas, generaron compendios casi idénticos de tipos de células corticales. "Siempre obtienes la misma proporción de diferentes tipos de células corticales en cada organoide individual", dice Quadrato. La identidad es importante desde el comienzo de los experimentos con organoides cerebrales. Las células madre se convierten en bolas de células llamadas cuerpos embrioides, que potencialmente pueden diferenciarse en las tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo) que dan lugar a todos los tejidos del cuerpo humano. Los investigadores de organoides cerebrales impulsan este desarrollo. Pueden usar moléculas de señalización como morfógenos para generar ectodermo, la capa a partir de la cual se desarrolla el cerebro. "La elección predeterminada del organoide es convertirse en corteza", dice Quadrato. Las trayectorias de linaje entre la corteza humana y los organoides corticales son similares. Algunos subtipos celulares pueden faltar en un organoide, que no tendrá todas las regiones cerebrales o información sensorial de un "cuerpo". Aunque los organoides corticales se han vuelto bastante reproducibles, "si quieres hacer otras regiones del cerebro, entonces se vuelve más difícil", dice Quadrato. El cerebelo mantiene su fascinación como la estructura cerebral con la mayor cantidad de neuronas en el cerebro. Se ha expandido más a lo largo de la evolución y parece haber jugado un papel importante en la adquisición de rasgos cognitivos específicos de los humanos. Cada vez hay más evidencia sobre su papel en condiciones como el autismo. Uno de los proyectos de su laboratorio es garantizar que los organoides del cerebelo se puedan producir de manera reproducible. Un organoide cerebral siempre tendrá una tendencia a hacer algo de prosencéfalo, dice ella. Eso significa que los organoides de otras regiones del cerebro pueden variar de un lote a otro y entre diferentes líneas celulares. Esta heterogeneidad y variabilidad puede dificultar que los científicos saquen conclusiones de sus organoides sobre los mecanismos subyacentes a los trastornos. Se necesitan técnicas de alto rendimiento y alta resolución para revelar la identidad de las células en un organoide dado; "De lo contrario, es muy difícil entender lo que está pasando y caracterizarlos", dice. Le preocupa que algunos laboratorios comiencen a trabajar con organoides pero subestimen cuánto tiempo, esfuerzo y, en última instancia, dinero, se necesita para caracterizar completamente los organoides. Los costos disminuirán a medida que las tecnologías maduren, pero al usar las técnicas incorrectas o aplicarlas a un modelo in vitro de manera incorrecta, "se pueden sacar conclusiones que son completamente erróneas", dice. Entre las técnicas que está estableciendo en su laboratorio se encuentra Patch-seq, que consiste en registrar la actividad eléctrica de una neurona o grupos de neuronas a través de patch-clamping seguido de secuenciación de ARN. Cuando se trabaja con ratones, la ubicación sugiere los tipos de células desde las que se está grabando. Un organoide carece de tales puntos de referencia anatómicos, y la grabación "a ciegas" desde cualquier lugar de un organoide es una mala idea, dice ella. Con Patch-seq, uno puede aspirar el ARN de las células sujetas con parches y "luego mira ese perfil; es muy útil".

"Realmente se puede resolver a nivel de tipo de célula lo que está pasando", dice Michael Fernando sobre Patch-seq. Es estudiante de doctorado en la Escuela de Medicina Icahn en Mt. Sinai en el laboratorio de Kristen Brennand, que modela enfermedades neuropsiquiátricas al fusionar la biología de células madre y la neurociencia y que ha comenzado a usar organoides. Está co-asesorado por el neurocientífico y electrofisiólogo de Mt. Sinai Paul Slesinger. Fernando quiere aprender y aplicar Patch-seq con organoides para evaluar cómo los experimentos de perturbación o edición de genes pueden afectar la expresión génica o las lecturas de electrofisiología. Fernando participó en un curso práctico sobre protocolos y diseño experimental realizado por el laboratorio de Pașca en Stanford para llegar a la "próxima generación" de investigadores de organoides cerebrales. "Fue una experiencia realmente genial", dice Fernando. "Estuve enviando correos electrónicos a mis IP durante toda esa semana con nuevas ideas". Después de las conferencias, los participantes se instalaron en las estaciones de trabajo. Lleva semanas diferenciar las células madre en neuronas y convertirlas en organoides, por lo que el laboratorio de Pașca había preparado organoides para ellas. Más allá de las técnicas de cultivo de células madre, dice Fernando, aprendieron cómo sacar células madre de los pozos para convertirlas en bolas "hermosas y esféricas". "Deberían estar felices", dice. Los protocolos difieren, como en el uso de tipos de medios de cultivo, y cada componente marca la diferencia. Después del curso, cuando Fernando y su compañera Aleta Murphy generaron organoides, algunos comenzaron a morir. Le pidió consejo al laboratorio de Pașca a través del canal de Slack del curso, que ahora se ha abierto a todo el laboratorio de Brennand, y "responden muy bien", dice. "Cuando vuelvan a hacer esto, nuestra familia crecerá", dice. "Seguiremos interactuando entre nosotros a lo largo de nuestras carreras".

El proyecto de doctorado de Fernando trata sobre el uso de líneas de células madre, genómica y electrofisiología para estudiar la función de las muchas variantes de empalme del gen neurexin-1. Se han detectado deleciones en este gen en neuronas diferenciadas de células donadas por personas con diversas afecciones neuropsiquiátricas, como esquizofrenia, autismo y discapacidad intelectual. En 2011, Brennand y otros compararon neuronas derivadas de pacientes con esquizofrenia con células de personas sin esta afección y encontraron una conectividad neuronal disminuida11. Algunas variantes son raras, otras comunes; es probable que se combinen para conferir riesgo de enfermedad. Sobre la base de dicho trabajo y el uso de organoides, Fernando quiere explorar los efectos específicos del tipo de célula de las isoformas de empalme de neurexina y efectos más amplios, ya que las neurexinas son esenciales para la neurotransmisión y los neurocircuitos. Algunos laboratorios han evaluado neuronas de ratón con deleciones de neurexina-1 y encontraron que las neuronas se ven sin cambios, dice, pero las mismas deleciones en las neuronas humanas generan fenotipos distintos. Con los organoides del cerebro humano, "nos estamos acercando a un mejor sistema modelo", dice. Como joven neurocientífico, ya aprendió lo importante que es prestar atención a las diferencias entre especies. Con organoides "podemos usar una plataforma específica para humanos para evaluar estas preguntas".

El cerebro del ratón se parece al cerebro humano en muchos aspectos, y los ratones se utilizan para estudiar el desarrollo neurológico o las enfermedades psiquiátricas, dice Quadrato, que trabaja con ratones y organoides. Pero el cerebro humano y el del ratón también son anatómicamente muy distintos. Por ejemplo, el cerebro del ratón es lisencefálico y carece de la estructura profundamente plegada de la corteza humana. Los trastornos psiquiátricos afectan la función cerebral de orden superior, por lo que es difícil modelarlos en ratones, dice ella. No es posible estudiar el desarrollo del cerebro humano en el útero. Cuando los laboratorios estudian el tejido fetal humano, solo tienen una "instantánea" en un momento específico. Como modelo cerebral, dice Quadrato, los organoides pueden capturar procesos de desarrollo y enfermedades cerebrales de nuevas formas. Para compartir tecnología con laboratorios que tienen menos experiencia con células madre, los kits "marcarán una gran diferencia" en la estandarización y ampliación de los esfuerzos, dice Pașca. Este otoño, Stemcell Technologies lanzará los sistemas de medios organoide STEMdiff Dorsal y Ventral Forebrain, con licencia de Stanford y desarrollados en el laboratorio de Pașca, dice Jason Hamlin, quien se enfoca en productos para laboratorios de neurociencia en la compañía.

Algunos experimentadores generalmente desconfían de la teoría, dice Eve Marder, neurocientífica de la Universidad de Brandeis. Para ellos "la teoría, por definición, no es real". La teoría sugiere nuevas formas de pensar en lugar de replicar lo que se conoce. En su opinión, las reacciones a los organoides por parte de la comunidad neurocientífica comparten algunas características de esta desconfianza en la teoría. Es la diferencia entre aquellos "que estudian lo que realmente es" y las personas que intentan formas de "descubrir cómo podrían ser las cosas". Es "fabuloso" trabajar en organoides en la forma en que "una teoría realmente buena es increíblemente instructiva y reveladora en neurociencia", dice Marder. Los experimentos son posibles con organoides que no son factibles en un cerebro en desarrollo normal. Pero usar organoides es "construir algo, que no es lo mismo que el cerebro real". Cuando ese trabajo se hace bien y se hacen las preguntas correctas, se hacen posibles los conocimientos que conducen a mejores preguntas para hacer cuando se trabaja con el "cerebro real". Marder estudia circuitos neuronales en langostas y cangrejos. Un lado de ella "encuentra los organoides extremadamente intrigantes", dice. "Y luego, el conservador y reduccionista de la neurociencia en mí todavía cree que están inventados". Algunas observaciones en organoides pueden no ser muy útiles para comprender cómo funcionan las cosas en el cerebro real, pero, dice, los organoides revelarán aspectos que "podrían abrir líneas de investigación completamente nuevas porque ves algo que nunca hubieras imaginado". Se siente cómoda ocupando posiciones aparentemente incompatibles entre sí. Los organoides revelan mucho sobre el potencial del material biológico y las células. "Pero no te van a decir cómo lo hizo el cerebro real". Estos modelos pueden brindar información sobre los mecanismos fundamentales involucrados en el desarrollo del cerebro, pero la forma en que estos mecanismos entran en juego durante el desarrollo real del cerebro "podría ser diferente en formas importantes, y posiblemente impredeciblemente importantes", dice ella. Entre los acertijos a los que se enfrentan los laboratorios de neurociencia, dice Marder, está discernir si un hallazgo es un principio general fundamental o principalmente la idiosincrasia de una especie en particular, una región del cerebro en particular o un grupo de neuronas. Algunos laboratorios navegan bien por estos acertijos, mientras que otros quedan atrapados por la idiosincrasia de sus preparativos. Los laboratorios orientados a la farmacología deben ser especialmente cuidadosos. Los compuestos actúan de manera diferente en diferentes especies, en diferentes tipos de células ya diferentes temperaturas y niveles de pH. Los organoides tienen la ventaja de que pueden fabricarse con células humanas. "No son un cerebro humano, pero son humanos", dice Marder. Aunque los circuitos se pueden modelar con organoides, para comprender profundamente un circuito es necesario trabajar en un animal, dice ella. Los organoides permiten a los investigadores estudiar el neurodesarrollo de formas que no se pueden estudiar en las personas. "¿La forma en que lo hace el organoide es la forma en que sucede en el útero? Tal vez, tal vez no", dice ella. Un laboratorio afortunado aprenderá "algo completamente nuevo", y luego necesitará formas de evaluar el hallazgo en un cerebro en desarrollo real. "El organoide no es un cerebro, no es un bebé en desarrollo", dice ella. "La verdadera clave es obligar a las personas a ser escrupulosamente honestas acerca de lo que creen que son los nuevos principios que han aprendido", dice. Los buenos laboratorios que estudian organoides van a "descubrir cosas que no sabíamos", dice ella.

Los organoides siguen siendo un área de investigación tan nueva, dice Lancaster, y "ciertamente, todavía estamos aprendiendo lo que estos tejidos pueden hacer". Su experiencia es la investigación in vivo y el desarrollo temprano del cerebro. "Siempre me sorprenden las similitudes de los organoides y el cerebro en desarrollo", dice ella. Los investigadores que no son biólogos del desarrollo podrían mirar un organoide cerebral y pensar "bueno, eso realmente no parece un cerebro", dice ella. Al evaluar las células y la arquitectura del tejido, "te das cuenta, en realidad, es realmente notable lo similar que es", dice. "Además, creo que es importante recordar que, incluso a veces, lo que algunos pueden llamar 'artefactos in vitro' pueden ser muy informativos, ya que nos dicen de qué son capaces las células y revelan ciertos comportamientos celulares que ni siquiera sabías que también estaban sucediendo en vivo."

Un problema que ve Pașca es que la comunidad de neurociencias y células madre a menudo lleva vidas bastante separadas. Muchas herramientas neurocientíficas comunes, como la fijación de parches y la optogenética, se están integrando lentamente al trabajo con organoides, que son una "nueva preparación", dice. Se necesita más comunicación entre campos para usar estos modelos para aprender sobre las "fases inaccesibles del desarrollo del cerebro humano", como lo que sucede en las últimas etapas del embarazo y el desarrollo posnatal.

Como neurobiólogo del desarrollo que vigila los aspectos traslacionales, Quadrato ve una gran promesa en los organoides para modelar el cerebro humano. Los investigadores deben verificar, por ejemplo, si un fenotipo de cerebro de ratón en particular también es un fenotipo humano y comprender si cambiar el fondo genético cambia el fenotipo o no. “Creo que, por ejemplo, lo que se debe hacer es combinar diferentes modelos del cerebro”, dice. Colabora con colegas en ingeniería de tejidos y biología sintética con el objetivo de construir assembloids y controlar cómo se forman las conexiones axonales entre los organoides. Lancaster encuentra que la reproducibilidad con organoides cerebrales en estos días "de hecho ha mejorado mucho". Su sensación es que "la fusión de la biología del desarrollo y la bioingeniería será una importante dirección futura que puede impulsar una mayor evolución de estas técnicas". Por ejemplo, incorporar señales mecánicas además de factores de señalización "será clave en mi opinión".

El trabajo con organoides cerebrales puede parecer desalentador para los recién llegados, dice Quadrato, pero hay mucho espacio para que la comunidad de investigación de organoides cerebrales aumente sus filas. Este trabajo combinará muchas técnicas, incluidas técnicas unicelulares, varias disciplinas y diferentes formas de modelar el cerebro humano. Ella no ve ninguna razón para, por ejemplo, usar solo organoides y olvidarse de ratones y otros modelos. Paşca está de acuerdo. Los organoides cerebrales son otra herramienta, ninguna de las cuales es perfecta, dice. Un organoide cerebral no es un cerebro humano real, dice Quadrato, es un "modelo reduccionista". Uno necesita, dice, desentrañar las limitaciones del sistema organoide así como sus puntos fuertes: "lo que podemos modelar con alta fidelidad y lo que no".

Velasco, S., Paulsen, B. y Arlotta, P. Annu. Rev. Neurosci. 43, 375–389 (2020).

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Vivien Marx

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Marx, V. Verificación de la realidad de los organoides en neurociencia. Métodos nacionales 17, 961–964 (2020). https://doi.org/10.1038/s41592-020-0964-z

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Publicado: 09 septiembre 2020

Fecha de emisión: octubre de 2020

DOI: https://doi.org/10.1038/s41592-020-0964-z

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