La haploinsuficiencia de MYT1L en neuronas humanas y ratones causa autismo

Psiquiatría molecular (2023)Citar este artículo

44k Accesos

1 Citas

375 Altmetric

Detalles de métricas

MYT1L es un factor de transcripción asociado al trastorno del espectro autista (TEA) que se expresa en prácticamente todas las neuronas a lo largo de la vida. Cómo las mutaciones de MYT1L causan fenotipos neurológicos y si pueden ser atacados sigue siendo un misterio. Aquí, examinamos los efectos de la deficiencia de MYT1L en neuronas humanas y ratones. Los ratones mutantes exhiben retrasos en el desarrollo neurológico con cortezas más delgadas, fenotipos conductuales y cambios en la expresión génica que se asemejan a los de los pacientes con TEA. Los genes diana de MYT1L, incluidos WNT y NOTCH, se activan con el agotamiento de MYT1L y su inhibición química puede rescatar la neurogénesis retardada in vitro. La deficiencia de MYT1L también provoca una regulación positiva del principal canal de sodio cardíaco, SCN5A, e hiperactividad neuronal, que podría restaurarse mediante la eliminación mediada por shRNA de la sobreexpresión de SCN5A o MYT1L en neuronas posmitóticas. La aplicación aguda del bloqueador de los canales de sodio, lamotrigina, también rescató defectos electrofisiológicos in vitro y fenotipos de comportamiento in vivo. Por lo tanto, la mutación MYT1L causa defectos neurológicos posmitóticos y del desarrollo. Sin embargo, la intervención aguda puede normalizar los fenotipos electrofisiológicos y conductuales resultantes en la edad adulta.

El trastorno del espectro autista (TEA) es un trastorno del neurodesarrollo (NDD) común que se caracteriza por cambios de comportamiento, que incluyen patrones sociales alterados [1]. ASD a menudo se asocia con condiciones coexistentes, que incluyen epilepsia, discapacidad intelectual e hiperactividad. Las mutaciones genéticas que afectan la comunicación neuronal confieren un mayor riesgo de TEA y ofrecen posibles dianas terapéuticas [2]. Sin embargo, la heterogeneidad genética de los TEA es enorme y recientemente se han asociado múltiples reguladores transcripcionales con este grupo de trastornos. De hecho, los modelos de ratón muestran que las mutaciones de los remodeladores de la cromatina, como Chd8 y los miembros del complejo BAF como Smarcc2, pueden inducir fenotipos conductuales [3,4,5,6], lo que sugiere un papel causal potencial en el TEA. Sin embargo, su contribución a la enfermedad y su relevancia clínica a menudo siguen siendo esquivas [7], lo que limita el desarrollo de tratamientos dirigidos para los trastornos mentales asociados con los reguladores de genes en el momento del diagnóstico [8, 9].

De los 91 reguladores de cromatina o genes más fuertemente asociados con los TEA (categoría 1; [10]), MYT1L se expresa de forma específica y continua en prácticamente todas las neuronas a lo largo de la vida [10,11,12]. MYT1L es un factor de transcripción de dedo de zinc conservado y se han informado mutaciones en pacientes diagnosticados con discapacidad intelectual, esquizofrenia, epilepsia y TEA [13,14,15,16,17,18], lo que sugiere que la regulación génica mediada por MYT1L puede ser importante en la prevención de NDD, incluido ASD. De hecho, el 98% (50 de 51) de los casos notificados actualmente con deleción heterocigótica de MYT1L o mutaciones con pérdida de función fueron diagnosticados con TEA y/o discapacidad intelectual [19]. Además de las características conductuales, varios pacientes con mutaciones en MYT1L también muestran retrasos en el desarrollo, obesidad, convulsiones y malformaciones cerebrales [19]. MYT1L fue uno de los tres factores originales capaces de reprogramar directamente los fibroblastos en neuronas funcionales tras la sobreexpresión [20]. MYT1L es un represor transcripcional que puede mejorar la identidad neuronal in vitro mediante la represión activa de varias vías de desarrollo, incluidas WNT y NOTCH. Esto se logra en parte mediante el reclutamiento de silenciadores epigenéticos como SIN3/HDAC [21,22,23]. Inesperadamente, los experimentos de reprogramación también han revelado que MYT1L se une y reprime varios programas genéticos no neuronales, como los genes musculares y de fibroblastos, lo que sugiere un papel como protección panneuronal que silencia otros genes específicos del linaje [21, 24, 25]. De hecho, estudios recientes describieron que la haploinsuficiencia de Myt1l, causada por la mutación del marco de lectura del exón 15 de Myt1l o la eliminación del exón 9, indujo un desarrollo cerebral alterado y fenotipos de comportamiento en ratones [26, 27]. Sin embargo, una serie de preguntas importantes siguen sin respuesta. Por ejemplo, no está claro si distintas mutaciones de MYT1L causan fenotipos superpuestos, como se sugiere en base a informes de pacientes. Además, ningún estudio presenta los efectos del agotamiento de MYT1L en neuronas humanas. Finalmente, se desconocen los mecanismos moleculares que causan los fenotipos neurológicos y si son susceptibles de intervención.

Aquí, utilizamos ratones modificados genéticamente y neuronas inducidas por humanos para investigar el papel de MYT1L durante el desarrollo y como una nueva plataforma preclínica para estudiar los NDD asociados con MYT1L. Usando estos modelos de traducción, mostramos que la deficiencia de MYT1L es suficiente para inducir fenotipos asociados con el autismo, que van desde la desregulación de la expresión génica y la neurogénesis retrasada hasta el adelgazamiento cortical y la alteración del comportamiento. Los genes diana de MYT1L, incluidos los reguladores WNT y NOTCH, se activaron pronto tras el agotamiento de MYT1L en las neuronas humanas y la inhibición de la vía química podría rescatar los defectos de diferenciación asociados. Descubrimos que la pérdida de MYT1L también provocó la regulación positiva de genes no neuronales, incluido el canal de sodio cardíaco SCN5A, y desencadenó una hiperactividad inesperada de la red neuronal que puede ser rescatada por la sobreexpresión de MYT1L o la caída de SCN5A. Además, la aplicación aguda del fármaco aprobado lamotrigina rescató los fenotipos electrofisiológicos en neuronas posmitóticas de ratones y humanos, así como los fenotipos de comportamiento en ratones adultos, lo que proporciona una vía terapéutica potencial para los pacientes con síndrome MYT1L.

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Todos los valores, incluidas las réplicas y el análisis estadístico, están disponibles en las tablas complementarias S2–8, 13. Las células para el análisis in vitro se seleccionaron al azar y los ratones se asignaron al azar a los grupos de tratamiento. Los investigadores estaban cegados para las grabaciones de pinzamiento de parche, otros experimentos no fueron aleatorios.

Para modelar la pérdida de MYT1L, generamos una mutación de línea germinal en ratones que albergaban un cambio de marco de 7 pb en el exón 6 de Myt1l. Además, diseñamos un alelo MYT1L heterocigoto condicional en ESC humanos, lo que permite la eliminación mediada por cre del exón 7 en neuronas humanas. Observamos la reducción esperada de la proteína MYT1L de longitud completa en neuronas humanas y de ratón. En ratones mutantes, encontramos una isoforma de proteína MYT1L truncada que carecía de localización y función nuclear, lo que confirma la validez de nuestros modelos de pérdida de función.

Un hemisferio de los ratones P0 se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se usó para cada inmunoprecipitación de MYT1L como se describió anteriormente [21]. Las proteínas unidas se digirieron enzimáticamente y los péptidos se analizaron mediante análisis espectrométrico de masas (Fusion Orbitrap; Thermo Fisher Scientific).

Células gliales de ratón se aislaron de prosencéfalos de CD1 de tipo salvaje (Jackson Laboratories) en P0 como se describe aquí [21]. Para cultivos neuronales primarios, se aisló el hipocampo o la corteza de crías de ratones mutantes P0 Myt1l o de control como se publicó anteriormente [28]. Para la sobreexpresión o silenciamiento, las células se transdujeron con lentivirus que codifican las construcciones indicadas el día in vitro 3 (DIV3).

La generación de neuronas humanas se ha descrito anteriormente [29]. La inhibición de WNT y NOTCH se realizó complementando los medios desde el día 1 hasta el día 4 con N-[N-(3,5-difluorofenacetil)-1-alanil]-S-fenilglicina t-butil éster (DAPT; Sigma) 10 µM , tetrahidro-2-[4-(trifluorometil)fenil]-4H-tiopirano[4,3-d]pirimidina 15 µM (XAV939; Santa Cruz), o ambos. Para la maduración funcional, las células neuronales se sembraron en cubreobjetos recubiertos con Matrigel o placas MEA recubiertas con laminina PEI (Axion) junto con glía primaria de ratón con cambios de medio cada 2 días durante una semana. Los siguientes cambios de medios se realizaron cada 3 o 4 días durante la duración del experimento.

Se inyectaron por vía intraperitoneal E14,5 a hembras preñadas a tiempo con EdU (30 mg/kg de peso corporal) (Life Technologies). Después de 20 h se recogieron los cerebros embrionarios. El análisis de la fracción Q siguió prácticas previamente establecidas [6]. El número de células TBR2+ y SOX2+ se determinó en segmentos corticales medios de 265 µm de ancho utilizando una macro de Fiji desarrollada internamente. Todas las cuantificaciones se realizaron en posiciones anteroposteriores equivalentes entre genotipos.

Para el análisis del grosor cortical, las secciones cerebrales P0 se alinearon entre genotipos utilizando puntos de referencia anatómicos subcorticales para la orientación, y el grosor se midió en un ángulo de 45° desde la línea media dorsal. El análisis morfológico de las neuronas cultivadas se realizó con Fiji utilizando el complemento SNT [30, 31]. La localización de FLAG-MYT1L nuclear se realizó en neuronas primarias de ratón en DIV 11 tras la sobreexpresión de las construcciones indicadas en DIV 3.

Los ratones se alojaron en un vivero con control de temperatura mantenido en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y se realizaron pruebas durante el ciclo de luz. Los procedimientos se realizaron en el Núcleo Neuroconductual Interdisciplinario de la Universidad de Heidelberg y fueron aprobados por el Regierungspräsidium en Karlsruhe (G-287/20, G-105/16).

Las bibliotecas de secuenciación de ARN se prepararon siguiendo el protocolo dUTP [32] y las lecturas se asignaron a hg38 o mm10 usando STAR [33] y la expresión diferencial se determinó usando DESeq2 [34] (paquete R versión 1.28.1) con normalización del factor de tamaño y Wald pruebas de significancia Para los experimentos de RNA-Seq de una sola célula, se extrajeron las cortezas prefrontales de ratones P0, se disociaron en células individuales y se codificaron siguiendo el esquema ECCITE-Seq [35] siguiendo un protocolo publicado previamente [36]. Se empleó el kit de reactivos Chromium Single Cell 5' v1 para la preparación de bibliotecas. Las bibliotecas se secuenciaron usando un NovaSeq 6000 (Illumina). Los datos se analizaron con 10x Genomics Cell Ranger (versión 4.0.0) [37], Seurat (versión 4.0) [38] y Scanpy (versión 1.6.0) [39]. Las subpoblaciones de cada tipo de célula más afectadas por la mutación de Myt1l se identificaron mediante MELD (versión 1.0) [40] con parámetros Beta = 31 y KNN = 5. Se identificaron cambios significativos en las proporciones de tipos de células mediante un método de arranque [41] basado en células normalizadas. números (FDR < 0.01 y abs (Log2FC) > 1). La expresión diferencial se realizó en estas subpoblaciones usando MAST (versión 1.16.0) [42] dentro de la función FindMarkers de Seurat (logfc.threshold = 0, min.pct = 0.05, todos los demás parámetros predeterminados). Las lecturas de secuenciación están disponibles en NCBI GEO GSE171327.

Se preparó la corteza prefrontal de ratones E18.5, P0 y de 3 meses de edad y se prepararon células individuales siguiendo el protocolo para la preparación de cultivos primarios. Se utilizaron 300 000 células por animal para CUT&RUN utilizando protocolos publicados [43]. Las bibliotecas se prepararon con el NEBNext DNA Library Prep Kit y se secuenciaron en NextSeq 2000 (Illumina). Los datos se analizaron utilizando la canalización nf-core/cutandrun v1.0 (https://doi.org/10.5281/zenodo.5653535). Homer findMotifsGenome.pl se ejecutó en los archivos pico con los parámetros -size −75,75 -mask -mknown y el motivo MYT1L AAAGTTW (http://homer.ucsd.edu/homer/).

Se usaron ratones de 4 a 6 semanas de edad para generar cortes hipocampales transversales que se parchearon como se describió anteriormente [44]. Para las mediciones de EPSC espontáneas, las células piramidales se sujetaron con voltaje a −70 mV con una solución interna basada en K+ que contenía lo siguiente (en mM): 130 K-gluconato, 10 Na-gluconato, 10 HEPES, 10 fosfocreatina, 4 NaCl, 4 MgATP, 0,3 GTP y 0,5% biocitina. Para las mediciones espontáneas de IPSC, se fijó el voltaje de las células piramidales putativas a 0 mV con una solución interna basada en Cs+ que contenía lo siguiente (en mM): 126 Cs-gluconato, 4 Cs-Cl, 10 HEPES, 10 fosfocreatina, 4 MgATP, 0,3 GTP y 2.5 QX-314 en presencia de CNQX (10 μM) y D-APV (50 μM). Las grabaciones de corrientes sinápticas excitatorias en cultivos primarios de hipocampo en DIV11 se realizaron como se describe aquí [21] en presencia o ausencia de tetrodotoxina (TTX) 0,5 µM.

Las mediciones de MEA se realizaron utilizando el dispositivo multipocillo Maestro Pro con el software Axis Navigator y placas de 48 pocillos (todos de Axion Biosystems). Para los tratamientos agudos, se añadió lamotrigina 10 µM (Targetmol) por pocillo y se midió la placa antes y 2 h después del tratamiento. Los datos se analizaron utilizando meaRtools [45].

Para abordar si las mutaciones de MYT1L pueden causar defectos complejos del desarrollo neurológico, generamos un modelo de ratón con una eliminación de 7 pb en el exón 6 de Myt1l (Fig. S1A-F complementaria). Esta mutación de cambio de marco induce un codón STOP prematuro en el aminoácido (aa) 78, similar a un paciente con una mutación sin sentido en aa 75 en MYT1L humano [15]. La descendencia resultante exhibió la reducción esperada en la proteína MYT1L de longitud completa en comparación con los controles (+/+) (Fig. 1A y Fig. Suplementaria S1G, H). Sin embargo, detectamos una isoforma MYT1L truncada, muy probablemente expresada a partir de una metionina interna en aa 99 (Figura complementaria S1G, I) (Tabla complementaria S1). Esta isoforma no se translocó al núcleo debido a la falta de la señal de localización nuclear y, por lo tanto, se espera que no sea funcional (Figura complementaria S1J, K). Los ratones Myt1l (+/-) son viables y fértiles, pero la eliminación homocigótica de Myt1l (-/-) resultó en letalidad posnatal (Fig. 1B). Esto demuestra que MYT1L es esencial para la supervivencia y validó nuestro modelo de pérdida de función.

Los niveles de proteína de longitud completa de MYT1L en lisados ​​cerebrales de ratones que albergan una mutación de la línea germinal de cambio de marco de 7 pb inducida por CRISPR en el exón 6 (primer exón que codifica la proteína) de Myt1l después del nacimiento se normalizaron con respecto al control. Se muestran imágenes de Western blot representativas utilizando los anticuerpos indicados; n ≥ 6. B Gráfico circular de supervivencia de (+/−) x (+/−) descendencia al nacer (8 camadas P0; n = 12 (+/+, negro), 31 (+/−, verde azulado), 15 ( −/−, amarillo)) y después del destete (7 camadas P21; n = 15 (+/+), 17 (+/−), 0 (−/−)) indicaron que los mutantes homocigóticos de Myt1l mueren después del nacimiento. C RNA-Seq de una sola célula de la corteza prefrontal al nacer y probabilidad de observar el enriquecimiento de células deficientes (+/-) y de control (+/+) de MYT1L en poblaciones de tipos de células específicos usando MELD. D Proporción de células deficientes en MYT1L (+/-) y de control (+/+) en los tipos de células indicados anotados según los datos de referencia de [77]. * FDR < 0.01 & abs(Log2FC) > 1. E Número de genes desregulados por mutación Myt1l (+/-) y (-/-) en los tipos de células indicados y grupos MELD. Se muestran los genes que están regulados hacia abajo (azul) o hacia arriba (rojo) tras la deficiencia de MYT1L con un cambio de pliegue log2 absoluto > 0,1 y p-adj < 0,05. F Perfiles de ocupación de todo el genoma de MYT1L endógeno en la corteza prefrontal de ratones de tipo salvaje determinados por CUT&RUN en P0 (n = 3). G Los gráficos circulares indican la distribución de sitios unidos a MYT1L detectados en regiones genómicas anotadas. H El motivo de unión al ADN de MYT1L (AAAGTT) está significativamente enriquecido en los sitios de unión. I Gráficos de caja de los cambios de expresión génica en el genoma (todos) y en los genes diana de MYT1L (pico de CUT&RUN ± 5 kb desde el sitio de inicio de la transcripción) para las poblaciones de células individuales indicadas tras la eliminación de Myt1l en comparación con el control. Para scRNA-Seq n = 2 para Myt1l (-/-; 10503 células), (+/-; 13688 células) y (+/+; 12072 células), respectivamente. El gráfico de barras muestra valores medios, se muestran puntos de datos de animales individuales, barras de error = SEM, prueba t no pareada en el panel A, prueba de Mann-Whitney en el panel I, ****p < 0,0001.

Para investigar los cambios en la composición celular y la expresión génica, realizamos la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-Seq) de la corteza prefrontal al nacer (Fig. 1C-E y Fig. S2 complementaria) (Tabla complementaria S2). No observamos la pérdida o la aparición de nuevos grupos de células, pero identificamos subpoblaciones específicas de mutantes de Myt1l calculando la probabilidad de que cada célula esté en un vecindario enriquecido en células de control o mutantes usando MELD [40] (Fig. 1C y Suplementario Fig. S2C, D). Solo se produjeron cambios menores en las proporciones de tipos de células entre ratones mutantes y de control (Fig. 1D y Fig. S2E complementaria), pero encontramos menos poblaciones de células Tbr2 y Sema3c, que marcan las neuronas migratorias recién formadas en la zona subventricular (SVZ) . Además, las interneuronas Cdca7+ se redujeron en (-/-) ratones, mientras que las neuronas de la capa cortical I (Reln+) aumentaron. El análisis de los genes expresados ​​​​diferencialmente mostró que el agotamiento de MYT1L resultó en una regulación positiva global de genes que fue más pronunciada en mutantes homocigotos (Fig. 1E). Observamos una mayor expresión de muchos programas de genes no neuronales tras el agotamiento de MYT1L, incluso en las neuronas de la capa cortical (Fig. S2F complementaria). Para identificar los genes diana de MYT1L, realizamos CUT&RUN [43] en ratones de tipo salvaje en el día embrionario (E) E18.5, postnatal (P) día 0 (P0) y 3 meses (adulto) (Fig. 1F, G y Fig. Suplementaria . S2G, H) (Tabla complementaria S3). Encontramos una gran superposición de sitios unidos y un enriquecimiento del motivo de unión al ADN MYT1L (AAAGTT) en diferentes etapas de desarrollo (Fig. 1H y Fig. S2I, J suplementarias). La intersección de genes objetivo de MYT1L con genes desregulados en P0 reveló una regulación positiva significativa dentro de diferentes poblaciones neuronales, como las poblaciones de células corticales Satb2 o Fezf2 (Fig. 1I y Fig. S2K complementaria). Esto subraya el papel de MYT1L como represor transcripcional y sugiere que, a pesar de la inducción de la identidad neuronal, las células mutantes de Myt1l no pudieron silenciar los programas de expresión génica inapropiados, lo que provocó una identidad transcripcional confusa en las neuronas in vivo.

MYT1L puede mejorar la identidad neuronal in vitro al reprimir los reguladores negativos de la neurogénesis [21], como Notch y Wnt, que tras la desregulación podrían afectar la dinámica de diferenciación neuronal y la estructura cerebral. Por lo tanto, realizamos una persecución de pulso EdU junto con la tinción conjunta para el marcador de proliferación, Ki67, para determinar la fracción de abandono (Q) de las células corticales que salen del ciclo celular durante un período de 20 h. De hecho, las células Ki67-EdU+ disminuyeron significativamente, lo que corresponde a una disminución en la fracción Q de ~37 % en embriones Myt1l (-/-) en E15.5 (Fig. 2A). Las células madre neurales SOX2+ y los progenitores neurales TBR2+ no cambiaron en E15.5 (Fig. 3A complementaria). Al nacer, las células madre SOX2+ aumentaron en ratones Myt1l (+/-) y (-/-) (Fig. 2B), mientras que los progenitores TBR2+ no cambiaron. Esto imita la sobreexpresión del efector NOTCH Hes1 que aumenta el conjunto de células madre después del nacimiento y da como resultado una corteza más delgada [46]. Por lo tanto, estudiamos la anatomía del cerebro de ratones mutantes Myt1l y descubrimos que el tamaño general del cerebro no cambió al nacer, mientras que el peso del cerebro fue menor, lo que resultó en una mayor relación entre longitud y peso (Fig. 2C y Fig. Suplementaria S3B, C). Además, las cortezas eran ~ 10% (+/-) o ~ 15% (-/-) más delgadas que los controles, respectivamente (Fig. 2C y Fig. S3C complementaria). Estos resultados sugieren que la falta de represión de los programas anti-neurogénicos dañó la neurogénesis, lo que a su vez podría causar anomalías cerebrales estructurales y podría explicar las malformaciones cerebrales encontradas en algunos pacientes [19].

A Imágenes representativas y cuantificaciones de células EdU+ después de un pulso de 20 h en E14.5 y fracción Q (proporción de EdU+Ki67− sobre todas las células EdU+) en la zona cortical ventricular (VZ) y la zona subventricular (SVZ) de Myt1l (+ /+, negro), (+/-, verde azulado) y (-/-, amarillo) ratones E15.5. Zona intermedia IZ, n ≥ 5, barra de escala 100 µm. B Cuantificación de células SOX2+ o TBR2+ en la corteza de ratones Myt1l (+/-) y (-/-) en comparación con el control (+/+) en P0 en la misma área de toda la corteza. Se muestran imágenes representativas de un aumento de la zona ventricular y subventricular teñidas con los anticuerpos indicados. n ≥ 4, barra de escala 50 µm. C Estructura de los cerebros Myt1l (+/+), (+/-) y (+/-) en P0. Se muestran secciones representativas teñidas con NeuN y cuantificación del grosor cortical absoluto y la longitud de la corteza normalizada por el peso del cerebro. n ≥ 5 para longitud cortical; secciones de n = 3 para espesor cortical, barra de escala 500 µm. Los gráficos de barras muestran valores medios, se muestran puntos de datos de réplicas biológicas individuales, barras de error = SEM, ANOVA unidireccional *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

A continuación, examinamos los efectos de la deficiencia de MYT1L a nivel molecular a lo largo del desarrollo del cerebro utilizando RNA-Seq a granel de cortezas de ratón en E18.5 (coincidiendo con la expresión máxima de Myt1L en el cerebro del ratón (Figura complementaria S1A [11])), P0 (nacimiento), P22 (juvenil) y 3 meses (adulto). Encontramos varios cientos de genes expresados ​​​​diferencialmente, con distintos grupos de genes desregulados temprano (E18.5 y P0) y tardío (P22 y adulto) en el desarrollo (Fig. 3A y Fig. S4A complementaria) (Tabla complementaria S4). Muchos de los genes desregulados no se superpusieron con los objetivos MYT1L anotados previamente [21] o los objetivos MYT1L CUT&RUN (Fig. 1F y Fig. S2G complementaria), lo que implica que muchos cambios en las muestras a granel son indirectos. En muestras de cerebro heterocigoto, los genes diana de MYT1L se regularon tanto al alza como a la baja; sin embargo, ~ 60% de los genes diana de MYT1L directos se regularon al alza con la mutación homocigótica de Myt1l (Fig. S4B complementaria). Esto está en línea con la regulación positiva de los genes diana de MYT1L en neuronas corticales (+/-) y (-/-) según el análisis de células individuales (Fig. 1E), lo que sugiere que MYT1L actúa predominantemente como un represor durante el desarrollo neuronal. De acuerdo con la fracción Q disminuida en E15.5, la expresión génica en E18.5 reveló una regulación negativa de los términos GO asociados con la neurogénesis y una regulación positiva de la división celular (Fig. 3B). Además, observamos una regulación positiva de las firmas de expresión génica fetal temprana y una disminución concomitante de las firmas fetales tardías en E18.5 [47] (Fig. 3C y Fig. S4D complementaria). Esto sugiere que la deficiencia de MYT1L, como se observa en otros modelos de TEA en ratones [5], causa retrasos en el desarrollo del cerebro. Observamos una regulación a la baja continua de los términos GO neuronales y un aumento en la señalización y los términos no neuronales tras la mutación Myt1l en ratones adultos (Fig. 3B y Fig. S4C complementaria). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) destacó varias firmas de destino de células no neuronales entre los genes regulados al alza e indicó un enriquecimiento general de genes implicados en la epilepsia, la esquizofrenia y los TEA entre los genes desregulados en cerebros mutantes Myt1l [48, 49] ( Figura complementaria S4D, E). Curiosamente, los ratones que albergaban nuestra mutación en el exón 6 de Myt1l mostraron una regulación al alza y a la baja del gen que se superponía con los ratones haploinsuficientes de Chd8 [6], pero solo en parte con el exón 15 [26] y el exón 9 [27] recientemente publicados. . S4F). Finalmente, descubrimos que los genes regulados al alza en pacientes con TEA también están regulados al alza en nuestros ratones con deficiencia de MYT1L, mientras que los genes regulados a la baja en ratones mutantes en Myt1l también están regulados a la baja en pacientes con TEA [5, 50] (Fig. 3D y Fig. S4G complementaria). En general, nuestros datos muestran que la deficiencia de MYT1L en ratones conduce a retrasos en el neurodesarrollo y la desregulación de la expresión génica como se observa en pacientes con TEA.

Un mapa de calor de genes desregulados tras la mutación de Myt1l en todas las réplicas y etapas, escalado por gen (filas). B Términos seleccionados de ontología génica superior (GO) y valores p de genes que se regularon hacia abajo (azul) o hacia arriba (rojo) tras la mutación de Myt1l en la corteza de ratones en comparación con el control en los puntos de tiempo indicados durante el desarrollo. C Los gráficos de GSEA muestran el agotamiento de los conjuntos de genes relacionados con el desarrollo neuronal fetal medio (azul) y el enriquecimiento de los genes relacionados con el desarrollo neural temprano entre los genes desregulados en cerebros mutantes Myt1l en E18.5. NES: puntuación de enriquecimiento normalizado; FDR, tasa de descubrimiento falso. D Superposición de genes regulados al alza o a la baja con la mutación de Myt1l en la corteza del ratón en E18.5 y P22 y genes que están regulados al alza o a la baja en cerebros de pacientes con TEA determinados por GeneOverlap. Para análisis de RNA-Seq n ≥ 5 E18.5, n ≥ 4 P0 para (+/+, negro), (+/−, verde azulado) y (−/−, amarillo), respectivamente; n = 6 P22, n ≥ 3 adultos para (+/+) y (+/−), respectivamente. E La prueba de campo abierto mostró que los mutantes Myt1l (+/-) cubrieron más distancia y pasaron más tiempo en las regiones centrales en comparación con los animales de control en P23; n = 25 para (+/+) y n = 29 para (+/-) de tres cohortes independientes. F Los experimentos de la cámara social mostraron una disminución específica de los machos en el tiempo que los mutantes Myt1l (+/-) dedicaron a explorar un ratón nuevo en comparación con los ratones de control a la edad de un mes; n = 10 para (+/+) y (+/−) de tres cohortes independientes. Los gráficos de barras muestran valores medios, se muestran puntos de datos de animales individuales, barras de error = SEM, prueba de Mann-Whitney **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, NS no significativo.

A continuación, realizamos análisis de comportamiento utilizando nuestro modelo de ratón Myt1l. Observamos una tendencia hacia una mayor vocalización en ratones deficientes en MYT1L posnatal temprano, pero la cantidad y el tipo de llamadas analizadas no cambiaron significativamente (Fig. S5A complementaria). En línea con los fenotipos de hiperactividad informados en varios pacientes con MYT1L [13,14,15,16, 51, 52], observamos un aumento de la locomoción en ratones adultos en sus jaulas domésticas, así como en ratones juveniles en campo abierto y laberinto en cruz elevado. pruebas (Fig. 3E y Fig. S5B-D complementaria). Los ratones mutantes pasaron un 70 % más de tiempo en las regiones centrales y con los brazos abiertos en las dos últimas pruebas, respectivamente. Además, el comportamiento de crianza exploratoria aumentó significativamente en ratones mutantes (Fig. S5D complementaria). Esto indica que los ratones con deficiencia de MYT1L están menos ansiosos, un fenotipo informado en otros modelos de ratones con TEA [53, 54]. También observamos una disminución significativa en los eventos de enterramiento y preparación de canicas, que se utilizan para evaluar comportamientos repetitivos pero también representan una disminución de los comportamientos similares a la ansiedad (Figura complementaria S5D, F). Finalmente, se realizaron experimentos en cámaras sociales para investigar el comportamiento social de nuestros ratones mutantes Myt1l. Todos los animales mostraron la preferencia esperada por investigar cámaras con un compañero de camada familiar en lugar de cámaras vacías. Sin embargo, mientras que tanto los ratones mutantes Myt1l de tipo salvaje como los hembras pasaron más tiempo explorando la cámara con un ratón desconocido recién agregado, los machos deficientes en MYT1L no exhibieron esta preferencia esperada por la novedad social (Fig. 3F y Fig. Suplementaria S5E). En resumen, el agotamiento de Myt1l provoca varios cambios de comportamiento sorprendentes en las pruebas utilizadas para modelar el comportamiento relacionado con los TEA, incluida la hiperactividad que se encontró en ratones machos y hembras y los déficits sociales específicos de los machos.

Para diseccionar el papel de MYT1L en las neuronas humanas, diseñamos células madre embrionarias humanas (hESC) con un alelo knockout condicional heterocigoto del exón 7 de MYT1L (+/fl) (Fig. 4A y Fig. S6 complementaria). Las hESC MYT1L (+/fl) se dirigieron hacia neuronas humanas eléctricamente maduras utilizando la diferenciación mediada por el factor de transcripción NGN2 [29]. Esto permite estudiar procesos sinápticos y de desarrollo vinculados a trastornos neurológicos de manera condicional [55,56,57]. La eliminación de MYT1L (+/-) mediada por Cre dio como resultado una reducción de proteínas de ~50 %, lo que imita la haploinsuficiencia de MYT1L que se encuentra en los pacientes (Fig. 4B, Fig. S6G complementaria). Primero, evaluamos los efectos transcripcionales del agotamiento de MYT1L en comparación con los controles isogénicos transducidos con Δcre en los puntos de tiempo de maduración temprana y tardía (Tabla complementaria S5). Las neuronas mutantes en MYT1L exhibieron una disminución en los términos GO neuronales y un enriquecimiento de genes implicados en la epilepsia, la esquizofrenia y el TEA entre los genes desregulados [48, 49] (Fig. 4C y Fig. S7A complementaria). Los términos GO asociados con genes regulados diferencialmente se superpusieron fuertemente entre nuestros modelos de ratón y humanos (Fig. 7B complementaria) (Tabla complementaria S6), lo que indica efectos conservados. En general, el agotamiento de MYT1L dio como resultado una activación génica más fuerte temprana (semana 1) y tardía (semana 6) después de la inducción neuronal (Fig. 4D y Fig. S7C complementaria). El motivo de unión al ADN de MYT1L (AAAGTT) se enriqueció en genes regulados al alza tras el agotamiento de MYT1L (Fig. 4E y Fig. Suplementaria S7D, E). Varios factores de transcripción que regulan el destino de las células no neuronales, como el PRRX1 específico del mesodermo o el regulador del interruptor de la glía SOX9 [58, 59], albergan motivos MYT1L y se regularon al alza en las neuronas deficientes en MYT1L (Fig. 4F). GSEA reveló una regulación positiva de los programas de expresión génica no neuronal, como el destino de las células musculares, tras el agotamiento de MYT1L (Fig. S7F complementaria). Ingenuity Pathway Analysis (IPA) confirmó que los programas de desarrollo inapropiados, como la miogénesis y la cardiogénesis, se activaron después de la mutación MYT1L, lo que sugiere que MYT1L los reprime continuamente (Fig. 4G y Fig. S7G complementaria). Por otro lado, los factores de transcripción neuronal como VAX2 o EN1 que no contienen motivos MYT1L en su promotor mostraron una expresión disminuida después de una semana, pero en comparación con los controles exhibieron una expresión aumentada inesperada en la semana seis (Fig. 4F). Este patrón de expresión se reflejó en las vías involucradas en la diferenciación y función neuronal, incluida la sinaptogénesis y la señalización de calcio, que inicialmente se reprimieron pero luego aumentaron en las neuronas deficientes en MYT1L (Fig. 4G y Fig. S7G complementaria). Es importante destacar que nuestros hallazgos con respecto a la desregulación de genes neuronales se recapitularon en neuronas derivadas de un clon adicional de hESC MYT1L (+/fl) diseñado de forma independiente (Figuras complementarias S6 y S7). Sorprendentemente, el retraso en la expresión de genes neuronales no afectó la complejidad de las neuronas después de diez días o seis semanas de neurogénesis inducida (Figura complementaria S8). Durante la reprogramación neuronal de fibroblastos de ratón, MYT1L promovió el destino neuronal al reprimir genes anti-neurogénicos como Id3, así como miembros de la vía WNT y NOTCH [21]. Aquí, observamos una mayor expresión de estos genes en neuronas humanas deficientes en MYT1L durante la inducción neuronal (Fig. 4F). La aplicación combinada de inhibidores químicos dirigidos a las vías WNT y NOTCH restauró la proteína TUJ1 para controlar los niveles y normalizó parcialmente los cambios de expresión génica en mutantes de MYT1L según las mediciones de RNA-Seq, particularmente al disminuir la expresión de genes que se regulan al alza con el agotamiento de MYT1L (Fig. 4H y Figura complementaria S9A, B) (Tabla complementaria S7). Además, identificamos varios factores de transcripción proneuronales que normalmente alcanzan su punto máximo temprano durante la neurogénesis inducida y que se regularon a la baja en las neuronas mutantes MYT1L en la semana uno, pero se regularon al alza en la semana seis (Fig. S9C complementaria). La expresión de estos factores podría normalizarse en las neuronas deficientes en MYT1L mediante la inhibición de WNT y NOTCH en la semana uno (Fig. S9D complementaria). En general, esto indica que la eliminación heterocigota de MYT1L durante la neurogénesis inducida por humanos provoca la desregulación de los genes asociados con el autismo y la activación de genes diana no neuronales que dan como resultado retrasos en la neurogénesis, al menos en parte mediados por un aumento de la señalización de WNT y NOTCH.

Un esquema de la deleción heterocigótica condicional de MYT1L durante la neurogénesis humana inducida por factores de transcripción. B Cuantificación de transferencia Western de células 7 días (1 semana) después de la inducción de la neurogénesis normalizada al control. Se muestran imágenes de Western blot representativas utilizando los anticuerpos indicados; n = 3. C Los genes desregulados en las neuronas mutantes de MYT1L 43 días (6 semanas) después de la inducción de la neurogénesis normalizada al control exhibieron una superposición significativa con los genes relacionados con la epilepsia, la esquizofrenia y los TEA determinados por la prueba exacta de Fisher. D Gráfica de volcán de genes expresados ​​diferencialmente en neuronas humanas empobrecidas en MYT1L después de la maduración durante una semana en comparación con controles isogénicos. Se destacan los genes que se regularon hacia abajo (azul) o hacia arriba (rojo) tras el agotamiento de MYT1L con un cambio de pliegue log2 absoluto > 0,2 y p-adj < 0,1. E El motivo de unión al ADN de MYT1L AAAGTT se enriqueció significativamente en los genes regulados al alza en el panel D. F Los genes desregulados seleccionados tras el agotamiento de MYT1L se muestran como cambio de pliegue (azul) o regulado al alza (rojo) en comparación con el control isogénico y el número de motivos MYT1L en los respectivos Se muestran los promotores. BE muestra datos para el clon 1 representativo. G Ingenuity Pathway Analysis (IPA) de genes expresados ​​diferencialmente en neuronas inducidas humanas sin MYT1L. El estado de activación (rojo) o inhibición (azul) de una vía o función biológica se representa mediante una puntuación z (prueba exacta de Fisher de cola derecha). Los resultados se muestran para dos clones, 1 y 6 semanas después de la neurogénesis humana inducida mediada por factor de transcripción. n = 4 (clon 1) o n = 5 (clon 2) para (+/fl) y (+/-), respectivamente. H Los niveles reducidos de proteína TUJ1 en neuronas humanas inducidas con agotamiento de MYT1L en el día 7 pueden restaurarse mediante la inhibición de WNT y NOTCH a través de XAV939 y DAPT con n = 4 (clon 1). Los gráficos de barras muestran valores medios, se muestran puntos de datos de réplicas biológicas individuales, barras de error = SEM, prueba t no pareada en el panel B y H, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Para investigar si la haploinsuficiencia de MYT1L afecta la función neuronal en las células humanas, estudiamos las propiedades electrofisiológicas de las neuronas MYT1L (+/-) a nivel de población después de seis semanas de maduración utilizando una matriz de electrodos múltiples (MEA) [60, 61]. Inesperadamente, observamos que la activación de picos se duplicó y la actividad de activación de red simultánea se triplicó en las neuronas mutantes MYT1L humanas en comparación con los controles (Fig. 5A). La actividad electrofisiológica alterada se correlacionó directamente con el agotamiento de la proteína MYT1L, ocurrió tan pronto como tres semanas después de la inducción neuronal y se mantuvo hasta el final de un experimento a largo plazo en la semana 15 (Figura complementaria S10A-C). El fenotipo electrofisiológico podría recapitularse en un clon de hESC MYT1L (+/fl) diseñado de forma independiente (Fig. S10D complementaria). A continuación, probamos si estos cambios funcionales se conservaron en las neuronas primarias del ratón. Con ese fin, investigamos las propiedades electrofisiológicas de las neuronas del hipocampo cultivadas derivadas de ratones mutantes Myt1l y de control utilizando MEA. Recapitulando nuestros hallazgos en neuronas humanas MYT1L (+/-), observamos un aumento de la activación y la hiperactividad de la red. Estos efectos escalaron con el agotamiento de MYT1L, con un aumento promedio de activación de picos de ~ 700 % (-/-) y ~ 400 % (+/-) en comparación con el control (Fig. 5B y Fig. S11A complementaria). Es de destacar que la sobreexpresión de MYT1L99-1187 en neuronas de tipo salvaje no alteró la actividad electrofisiológica en MEA, lo que descartó un efecto negativo dominante potencial de la isoforma MYT1L truncada, lo que confirma aún más que nuestros ratones mutantes Myt1l son un modelo de pérdida de función (Fig. . S11B). También se pudo observar una mayor actividad de disparo de MEA en las neuronas primarias derivadas de la corteza de los ratones con deficiencia de MYT1L al nacer, lo que indica que los defectos no están restringidos a regiones cerebrales específicas, sino que afectan al menos dos áreas implicadas en el TEA [62] (Figura complementaria S11C ). Para correlacionar la hiperactividad de la red observada con la actividad sináptica de células individuales, realizamos grabaciones de pinzamiento de parche. De acuerdo con la hiperactividad de la red observada, la amplitud y la frecuencia de las corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas (EPSC) y de las EPSC en miniatura (mEPSC; registradas en presencia de tetrodotoxina (TTX)) aumentaron en neuronas primarias de ratón cultivadas deficientes en MYT1L (Fig. S11D, E), respectivamente. Al igual que en el modelo humano, no observamos cambios significativos en la morfología neuronal de las neuronas primarias deficientes en MYT1L cultivadas (Fig. S11F complementaria). También realizamos grabaciones electrofisiológicas de cortes de cerebro de neuronas piramidales ubicadas en la región CA1 del hipocampo de ratones de un mes de edad. De acuerdo con nuestros datos in vitro, observamos una mayor frecuencia de EPSC espontáneos en mutantes Myt1l en comparación con los controles (Fig. 5C). Las propiedades intrínsecas, como el potencial de membrana en reposo y las características del potencial de acción evocado, aparecieron sin cambios (Fig. S12A complementaria). La frecuencia de las corrientes postsinápticas inhibidoras espontáneas (sIPSC, registradas en presencia de CNQX y D-APV) aumentó en las neuronas piramidales deficientes en MYT1L, lo que indica que el aumento de la excitación no resultó de la disminución de la inhibición (Figura complementaria S12B). Nuestros experimentos muestran que el agotamiento continuo de MYT1L afecta la función neuronal y da como resultado un fenotipo de hiperactividad electrofisiológica inesperado en neuronas humanas y de ratón.

A Aumento de la actividad de la red neuronal espontánea medida por matriz de electrodos múltiples (MEA) en neuronas deficientes en MYT1L (+/−; verde azulado) en comparación con el control (+/fl, negro) 6 semanas después de la neurogénesis inducida. Se muestran gráficas ráster representativas y cuantificaciones de picos y picos de red. Hiperactividad de la red B medida por MEA para el control (+/+, negro) y Myt1l mutante (+/-; verde azulado y -/-; amarillo) neuronas del hipocampo en cultivo el día in vitro 11 (DIV11). Se muestran gráficas raster y cuantificaciones representativas. C Aumento de las corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas (sEPSC) de las neuronas piramidales CA1 en cortes agudos de cerebro de ratón. Se muestran trazas representativas, cuantificación y distribuciones acumulativas, los gráficos de barras muestran los valores medios con el número de células parcheadas o pocillos MEA de las réplicas biológicas indicadas, barras de error = SEM, prueba de Mann-Whitney en el panel A y C, ANOVA unidireccional en el panel B, *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Observamos fenotipos de hiperactividad de red electrofisiológica similares basados ​​en mediciones de MEA en neuronas inducidas humanas derivadas de células madre y de ratón primarias tras la mutación MYT1L, lo que indica un mecanismo molecular subyacente conservado. Dado que se observó la activación de genes diana no neuronales tras la mutación MYT1L en modelos humanos y de ratón, esto podría contribuir a la superposición de fenotipos. Para identificar dichos objetivos, analizamos genes que: (i) estaban unidos por MYT1L in vivo según lo determinado por CUT&RUN (Fig. 1F y Fig. S2G complementaria) (Tabla complementaria S3); (ii) se desregularon en neuronas primarias inducidas por humanos o ratones tras la eliminación heterocigota de MYT1L determinada por RNA-Seq (Tabla complementaria S5 y 8); (iii) contribuyó a la regulación positiva de los términos no neuronales basados ​​​​en IPA (Fig. 4 y Fig. S4 y 7 complementarias); y (iv) se expresaron poco en el cerebro en comparación con otros tejidos, según conjuntos de datos de expresión pública [63]. Sorprendentemente, el 78 % (30 de 38) de estos objetivos no neuronales aumentaron con el agotamiento de MYT1L en neuronas humanas y de ratón (Fig. 6A y Fig. S13A complementaria). El principal objetivo regulado al alza es TFAP2B, que, tras la mutación, puede causar el síndrome de Char, caracterizado por anomalías faciales, ductales y de la mano [64]. Curiosamente, algunos pacientes con mutaciones en MYT1L presentan dismorfias faciales leves [19, 65]. Además, encontramos un aumento de casi el doble del canal de sodio dependiente de voltaje cardíaco SCN5A, que tras la mutación puede causar el síndrome de QT largo [66], entre los 10 principales genes diana regulados al alza. SCN5A mostró una expresión basal baja en neuronas humanas y de ratón, y una mayor expresión en neuronas deficientes en MYT1L podría alterar las propiedades electrofisiológicas. MYT1L permanece expresado en neuronas maduras, lo que sugiere que también funciona en neuronas posmitóticas (Fig. S1A complementaria). Por lo tanto, preguntamos si la sobreexpresión de Myt1l (OE) en neuronas postmitóticas con deficiencia de MYT1L podría restaurar la represión de genes diana, como Scn5a. Myt1l OE aumentó significativamente la expresión del marcador neuronal Tuj1 en comparación con los controles GFP OE (Fig. 6B y Fig. Suplementaria S13B, C). Es importante destacar que Myt1l OE disminuyó la expresión de los genes objetivo que estaban regulados al alza en las neuronas mutantes de MYT1L, específicamente Hes1 y Scn5a (Fig. 6C). Sorprendentemente, encontramos que Myt1l OE también restableció la actividad de la red neuronal a niveles de control (Fig. 6D). Estos resultados sugieren que la desregulación continua de la expresión génica en las neuronas postmitóticas causada por la mutación MYT1L contribuye a los fenotipos de hiperactividad electrofisiológica, y que estos podrían restaurarse incluso después de que se completa el neurodesarrollo. Para probar si la regulación positiva de SCN5A causó el fenotipo de hiperactividad electrofisiológica, realizamos una eliminación de SCN5A mediada por shRNA en neuronas inducidas tanto primarias como humanas de ratón, lo que redujo los niveles de SCN5A en un 80 % y medimos la actividad de la red neuronal usando MEA (Fig. S13D complementaria). Sorprendentemente, la caída de Scn5a redujo la hiperactividad de la red neuronal en (+/-) y (-/-) neuronas primarias de ratón a niveles de tipo salvaje (Fig. 6E). Esto podría recapitularse mediante la caída de SCN5A en neuronas inducidas por humanos MYT1L (+/-) (Fig. 6G), lo que indica que la regulación positiva de SCN5A contribuye, al menos en parte, a la hiperactividad de la red electrofisiológica en neuronas mutantes de MYT1L humanas y de ratón. Con el fin de encontrar una posible intervención terapéutica, decidimos probar si la lamotrigina, un bloqueador de los canales de sodio y un fármaco antiepiléptico aprobado por la FDA [67, 68], podría rescatar los fenotipos inducidos por la deficiencia de MYT1L. De hecho, la aplicación aguda de lamotrigina normalizó la hiperactividad de la red electrofisiológica de las neuronas deficientes en MYT1L humanas y de ratón hacia niveles de control (Fig. 6F, H). Finalmente, para estudiar si la hiperactividad de la red neuronal contribuye a los fenotipos de comportamiento observados en la mutación de Myt1l y para probar si estos también son susceptibles de intervención farmacológica in vivo, inyectamos lamotrigina en ratones. Descubrimos que el tratamiento agudo con lamotrigina en ratones mutantes Myt1l normalizó el comportamiento de ansiedad e hiperactividad en la prueba de campo abierto, así como la locomoción y la crianza en las observaciones de la jaula doméstica, hacia ratones de control no tratados (Fig. 6I y Suplementario Fig. S13E). En general, estos resultados muestran que, además de los defectos del neurodesarrollo, la mutación MYT1L provoca una regulación positiva de genes no neuronales e hiperactividad de la red neuronal en neuronas humanas y de ratón. El tratamiento agudo con lamotrigina en neuronas posmitóticas y ratones adultos rescató tanto la hiperactividad de la red electrofisiológica como los fenotipos de comportamiento probados (Fig. 6J), lo que indica que los efectos electrofisiológicos contribuyen, al menos en parte, a la alteración del comportamiento en ratones. Por lo tanto, la mutación MYT1L no solo afecta el desarrollo, sino que también afecta la función neuronal y el comportamiento en la edad adulta, lo que sugiere que los tratamientos dirigidos también pueden beneficiar a los pacientes en etapas posteriores del desarrollo.

A Los genes diana de MYT1L no neuronales desregulados en neuronas humanas con deficiencia de MYT1L (semana 6) y neuronas primarias de ratón en el día 11 in vitro (DIV11) incluyen el canal de sodio cardíaco SCN5A. La desregulación de la expresión génica basada en RNA-Seq se muestra como cambio de veces en comparación con el control, n = 4 (humano) para (+/fl) y (+/-), n = 3 (ratón) para (+/+) y (+/-), respectivamente. Los datos de expresión de tejido del portal GTEx se muestran como puntuación z. B Cronograma esquemático para los experimentos de rescate genético y farmacológico en hipocampo primario de ratón y cultivos neuronales humanos inducidos. C Disminución significativa de los genes diana de MYT1L Scn5a y Hes1 en cultivos primarios de hipocampo de ratón con deficiencia de MYT1L en DIV11 tras la sobreexpresión (OE) de Myt1l en DIV3 en comparación con GFP OE determinada por qRT-PCR. Los gráficos muestran diagramas de dispersión de columnas con la mediana mostrada; n ≥ 8. La hiperactividad de la red D en neuronas primarias de ratón deficientes en MYT1L se puede rescatar en DIV11 mediante la sobreexpresión de Myt1l en neuronas posmitóticas en DIV3. E La eliminación de Scn5a por la expresión de shRNA en neuronas posmitóticas en DIV3 redujo la frecuencia de picos de las neuronas Myt1l (+/-) y (-/-). F La hiperactividad en neuronas primarias de ratón deficientes en MYT1L también se puede rescatar mediante la aplicación aguda de lamotrigina 10 μM en DIV11. La eliminación de G SCN5A con shRNA en neuronas inducidas por humanos dio como resultado una frecuencia de picos reducida. H El aumento de la descarga de picos tras la mutación MYT1L se normalizó hacia el control mediante la aplicación aguda de 10 μM de lamotrigina en neuronas humanas inducidas en la semana 6. I Las pruebas de campo abierto mostraron que los mutantes Myt1l (+/-) cubrían más distancia en las regiones centrales en comparación con los animales de control en la semana 6. P23 y la aplicación aguda de 20 mg/kg de lamotrigina pueden normalizar estos fenotipos de hiperactividad. Vehículo: n = 23 para (+/+) y n = 29 para (+/-), lamotrigina: n = 19 para (+/+) y n = 23 para (+/-) datos de tres cohortes independientes. J Resumen esquemático de las funciones clave de MYT1L durante las etapas tempranas y posnatales del desarrollo y defectos tras la pérdida de MYT1L que pueden compensarse en parte mediante la intervención genética y farmacológica en ambas etapas. Los gráficos de barras muestran los valores medios con el número de pocillos MEA de las réplicas biológicas indicadas o puntos de datos de animales individuales, barras de error = SEM, prueba de Mann-Whitney en el panel C, ANOVA de dos vías en el panel D–I, *p < 0,05, * *p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, NS no significativo.

A diferencia de la mayoría de los reguladores de la cromatina asociados con enfermedades neuropsiquiátricas, el factor de transcripción MYT1L se expresa específicamente en prácticamente todas las neuronas y permanece expresado durante toda la vida [11, 12]. Sin embargo, aún no se sabe bien si las mutaciones de MYT1L pueden causar enfermedades neuropsiquiátricas y cómo lo hacen. En este estudio, presentamos evidencia de que la haploinsuficiencia de MYT1L es suficiente para causar fenotipos asociados con NDD y ASD en neuronas humanas, así como en modelos de ratón debido a la falla en la represión de genes objetivo que resulta en (i) retrasos durante la neurogénesis del desarrollo y (ii) sináptica mal funcionamiento de las neuronas maduras. La deficiencia de MYT1L en nuestros modelos humanos y de ratón provocó una desregulación significativa de los genes asociados con la epilepsia, la esquizofrenia y los TEA, que se han diagnosticado en pacientes portadores de mutaciones en MYT1L [13,14,15,16]. También descubrimos que los cambios en la expresión génica en cerebros de ratones mutantes Myt1l se parecían directamente a los observados en cerebros de pacientes con TEA, lo que demuestra que la deficiencia de MYT1L puede conducir a perfiles transcripcionales asociados con TEA. Los fenotipos adicionales vinculados a ASD y NDD asociados con MYT1L incluyen retrasos en el desarrollo neurológico y cambios en la anatomía del cerebro. Mediante el análisis transcriptómico, observamos una dinámica de maduración alterada en neuronas humanas deficientes en MYT1L tras la diferenciación neuronal in vitro mediada por factores de transcripción y una neurogénesis alterada en la corteza prefrontal de ratones mutantes en Myt1L in vivo. Incluso en E18.5, los ratones mutantes Myt1l mostraron la activación de los programas de expresión génica fetal temprana y la regulación a la baja de los programas fetales medios, que también se ha descrito en otros modelos ASD [5]. Estudios previos mostraron que el agotamiento agudo de Myt1l o el miembro de la familia Myt1 estrechamente relacionado por el tratamiento con shRNA perjudicó la neurogénesis en el útero al reprimir la expresión de Hes1 y la señalización de Notch [21, 69]. Aquí, ampliamos estos hallazgos al mostrar que la mutación de la línea germinal Myt1l perjudicó la salida del ciclo celular de los progenitores corticales durante el desarrollo y aumentó la cantidad de células madre neurales SOX2+ en la SVZ al nacer, lo que se asemeja a los fenotipos de sobreexpresión de Hes1 [46]. De hecho, la inhibición química combinada de WNT y NOTCH podría restaurar la inducción temprana de genes proneuronales en neuronas inducidas por humanos. Esto confirma el deterioro de la neurogénesis por deficiencia de MYT1L y podría explicar el adelgazamiento de la corteza observado en ratones mutantes en Myt1l y los retrasos en el desarrollo neurológico en modelos humanos y de ratón.

Una limitación de nuestro estudio es que modelamos solo mutaciones de cambio de marco predichas para dar lugar a codones STOP prematuros de MYT1L humano y de ratón, similar a un paciente informado con una mutación sin sentido en aa 75 [15]. Nuestro modelo de ratón presentó un cambio de marco en el exón 6 [70] que generó isoformas de proteína MYT1L no funcionales a las que les faltaban dominios esenciales como la señal de localización nuclear, mientras que la eliminación condicional del exón 7 en nuestro modelo humano resultó en una descomposición del ARN mediada por tonterías. Es de destacar que ambos modelos exhibieron desregulación genética y fenotipos electrofisiológicos similares, lo que sugiere que la pérdida de función da como resultado defectos superpuestos independientemente del tipo de mutación. En particular, dos estudios recientes describen modelos de ratón Myt1l adicionales; Chen et al. generó una mutación de cambio de marco en el exón 15 [26], y Kim et al. utilizó un mutante de escisión del exón 9 [27]. Los tres modelos tienen en común que la inactivación homocigótica de Myt1l da como resultado la letalidad posnatal y la morfología cerebral alterada, lo que enfatiza el papel crucial de MYT1L para el desarrollo. Además, los tres estudios encontraron fenotipos conductuales, incluida la hiperactividad. En línea con nuestro estudio, Kim et al. informaron disminución de la ansiedad. Chen et al. informó un comportamiento social deteriorado específico de los hombres, que también encontramos en nuestro modelo aunque usamos diferentes ensayos y etapas de desarrollo. Sin embargo, los tres modelos de ratones mutantes Myt1l exhiben una expresión génica distinta y defectos del desarrollo neurológico. A diferencia de nuestro estudio, Chen et al. informan un aumento de la fracción Q y una disminución de las células madre neurales SOX2+ en ratones deficientes en Myt1l en E14.5 y sugieren que MYT1L actúa principalmente como un activador transcripcional. Sin embargo, en una preimpresión reciente, los mismos autores encontraron que MYT1L unía y reprimía promotores y potenciadores de genes involucrados en programas de desarrollo neuronal temprano [71]. Aquí, utilizando la transcriptómica de células individuales, mostramos que los genes unidos a MYT1L se activan en las neuronas corticales tras la pérdida de MYT1L, lo que respalda su papel como represor. En línea con esto, tanto Chen et al. y nuestro estudio encontró una mayor expresión de las primeras firmas genéticas del neurodesarrollo más adelante en el desarrollo. En particular, todos los estudios informan una superposición significativa de genes desregulados con conjuntos de genes ASD. Por lo tanto, si bien las diferencias entre estos tres modelos de ratones Myt1l pueden reflejar la naturaleza distinta de las mutaciones, los antecedentes genéticos del ratón y las condiciones experimentales, su superposición enfatiza el importante papel de MYTL para el desarrollo neurológico. Además de las variantes de pérdida de función, se han informado varias variantes sin sentido de novo, indeles y duplicaciones y deleciones genómicas que abarcan MYT1L en personas con enfermedades neuropsiquiátricas [19, 65]. Dado que los pacientes con MYT1L muestran diversos fenotipos, que incluyen tanto macrocefalia como microcefalia, y se les diagnostica diferentes trastornos neuropsiquiátricos como ASD y esquizofrenia, se necesitarán estudios futuros para aclarar cómo mutaciones específicas o antecedentes genéticos afectan estos fenotipos mediante la ingeniería de células madre humanas y de ratón adicionales. modelos o generando neuronas derivadas de pacientes a partir de células madre pluripotentes inducidas.

Junto con la desestabilización de la identidad de las células neuronales, que se manifestó como cambios en la expresión génica y retrasos en la neurogénesis, observamos fenotipos electrofisiológicos sorprendentes en las neuronas deficientes en MYT1L. Inesperadamente, las neuronas primarias de ratón y humanas inducidas mostraron un aumento de tres a cuatro veces en la actividad de la red neuronal, respaldado por un aumento en la amplitud de sEPSC y la frecuencia de mEPSC. Dado que la frecuencia de sIPSC aumentó en las neuronas piramidales deficientes en MYT1L, es probable que el aumento de la actividad de la red no sea causado por una disminución de la inhibición en nuestro modelo. Sin embargo, en ratones recién nacidos Myt1l (-/-), observamos un ligero aumento en la fracción de neuronas de la capa cortical I junto con una disminución de las poblaciones de interneuronas Cdca7+ según el análisis de células individuales. Por lo tanto, el efecto de las mutaciones de MYT1L en las neuronas inhibitorias sigue siendo esquivo y requiere estudios futuros. Los fenotipos de red podrían explicarse por múltiples factores, como los cambios en la morfología neuronal o la densidad de sinapsis, así como los mecanismos generales que regulan la liberación de neurotransmisores, incluida la desregulación de los canales de sodio y calcio dependientes de voltaje [72,73,74]. Curiosamente, la regulación positiva de los canales que normalmente no se expresan específicamente en las neuronas, como SCN5A, también podría afectar la transmisión sináptica normal en las neuronas mutantes MYT1L. Por lo tanto, probamos si la sobreexpresión de MYT1L, la eliminación de SCN5A mediada por shRNA o el tratamiento con lamotrigina, que se informa que bloquea los canales de sodio y calcio [67, 68], podría rescatar la hiperactividad de la red inducida por la mutación de MYT1L. Sorprendentemente, la sobreexpresión de MYT1L disminuyó la expresión de genes diana como Scn5a y Hes1 en neuronas de ratón postmitóticas con deficiencia de MYT1L, y la sobreexpresión de MYT1L y la caída de SCN5A rescataron los fenotipos de hiperactividad de la red electrofisiológica. Además, la aplicación aguda de lamotrigina normalizó no solo los fenotipos de hiperactividad de red de las neuronas humanas y de ratón con deficiencia de MYT1L posmitótica, sino también varios fenotipos de hiperactividad conductual observados en ratones. Esto sugiere que los fenotipos específicos asociados con la haploinsuficiencia de MYT1L pueden rescatarse mediante intervención genética o fármacos de molécula pequeña incluso más adelante en el desarrollo.

En general, presentamos la primera evidencia de que las mutaciones de MYT1L desestabilizan el destino y la función de las células neuronales y son suficientes para causar fenotipos asociados con TEA en modelos humanos y de ratón. Por lo tanto, el hecho de no silenciar la expresión génica no neuronal en las neuronas representa un mecanismo novedoso que, al menos en parte, podría contribuir a la etiología del TEA. MYT1L es un factor de transcripción único asociado a enfermedades del neurodesarrollo que se expresa específicamente en prácticamente todas las neuronas a lo largo de la vida. Por lo tanto, es tentador especular que la represión activa de por vida de los programas no neuronales es una vía crítica conservada evolutivamente para la prevención de trastornos cerebrales. Curiosamente, los niveles de MYT1L disminuyen durante el envejecimiento tanto en ratones como en humanos (Figura complementaria S1A), y recientemente se sugirió que la pérdida de identidad de las células neuronales desempeña un papel en los modelos de la enfermedad de Alzheimer [75, 76], lo que sugiere que la neurodegeneración también podría ser regulado por el nuevo mecanismo mediado por MYT1L presentado aquí. Finalmente, mostramos que la hiperactividad de la red electrofisiológica inesperada tras la deficiencia de MYT1L en neuronas posmitóticas de ratones y humanos, y los fenotipos de comportamiento asociados en ratones, pueden ser atacados de manera aguda por el fármaco aprobado lamotrigina, que podría brindar una oportunidad para intervenciones terapéuticas.

Todos los datos están disponibles en el texto principal o en los materiales complementarios. GSEA se realizó como se describe anteriormente. Los datos de secuenciación de próxima generación están disponibles en NCBI GEO GSE171327. Se puede acceder a los datos de espectrometría de masas en PRIDE PXD037867.

Lord C, Elsabbagh M, Baird G, Veenstra-Vanderweele J. Trastorno del espectro autista. Lancet 2018;392:508–20.

Artículo Google Académico

Bourgeron T. De la arquitectura genética a la plasticidad sináptica en el trastorno del espectro autista. Nat Rev Neurosci. 2015;16:551–63.

Artículo CAS Google Académico

Tuoc T, Dere E, Radyushkin K, Pham L, Nguyen H, Tonchev AB, et al. La ablación de BAF170 en el giro dentado posnatal y en desarrollo afecta la proliferación, la diferenciación y el aprendizaje de las células madre neurales. Mol Neurobiol. 2017;54:4618–35.

Artículo CAS Google Académico

Tuoc TC, Boretius S, Sansom SN, Pitulescu ME, Frahm J, Livesey FJ, et al. La regulación de la cromatina por BAF170 controla el tamaño y el grosor de la corteza cerebral. Célula de desarrollo. 2013;25:256–69.

Artículo CAS Google Académico

Katayama Y, Nishiyama M, Shoji H, Ohkawa Y, Kawamura A, Sato T, et al. La haploinsuficiencia de CHD8 da como resultado fenotipos de tipo autista en ratones. Naturaleza 2016;537:675–9.

Artículo CAS Google Académico

Gompers AL, Su-Feher L, Ellegood J, Copping NA, Riyadh MA, Stradleigh TW, et al. La haploinsuficiencia de la línea germinal Chd8 altera el desarrollo cerebral en ratones. Nat Neurosci. 2017;20:1062–73.

Artículo CAS Google Académico

Schaaf CP, Betancur C, Yuen RKC, Parr JR, Skuse DH, Gallagher L, et al. Un marco para una lista de genes basada en evidencia relevante para el trastorno del espectro autista. Nat Rev. Genet. 2020;21:367–76.

Artículo CAS Google Académico

Satterstrom FK, Kosmicki JA, Wang J, Breen MS, Rubeis SD, An JY, et al. El estudio de secuenciación del exoma a gran escala implica cambios funcionales y de desarrollo en la neurobiología del autismo. Celda 2020;180:568–84.e23.

Artículo CAS Google Académico

Turner TN, Coe BP, Dickel DE, Hoekzema K, Nelson BJ, Zody MC, et al. Patrones genómicos de mutación de novo en autismo simplex. Celda 2017;171:710–22.e12.

Artículo CAS Google Académico

Iniciativa de Investigación del Autismo de la Fundación Simons SFARI. Genes de riesgo de autismo candidatos de mayor rango. Diciembre de 2019. https://www.sfari.org/resource/sfari-gene.

Cardoso-Moreira M, Halbert J, Valloton D, Velten B, Chen C, Shao Y, et al. Expresión génica en el desarrollo de órganos de mamíferos. Naturaleza 2019;571:505–9.

Artículo CAS Google Académico

Matsushita F, Kameyama T, Kadokawa Y, Marunouchi T. Patrón de expresión espaciotemporal de los factores de transcripción de dedos de zinc de la familia Myt/NZF durante el desarrollo del sistema nervioso del ratón. Dinámica de desarrollo. 2014;243:588–600.

Artículo CAS Google Académico

Lee Y, Mattai A, Long R, Rapoport JL, Gogtay N, Addington AM. Las microduplicaciones que interrumpen el gen MYT1L (2p25.3) están asociadas con la esquizofrenia. Psiquiatra Genet. 2012;22:206–9.

Artículo CAS Google Académico

Rocker ND, Vergult S, Koolen D, Jacobs E, Hoischen A, Zeesman S, et al. Refinamiento de la región crítica de deleción 2p25.3: el papel de MYT1L en la discapacidad intelectual y la obesidad. Genet Med. 2015;17:460–6.

Artículo Google Académico

Windheuser IC, Becker J, Cremer K, Hundertmark H, Yates LM, Mangold E, et al. Nueve individuos recién identificados refinan el fenotipo asociado con las mutaciones de MYT1L. Am J Med Genet Parte A 2020;182:1021–31.

Artículo CAS Google Académico

Blanchet P, Bebin M, Bruet S, Cooper GM, Thompson ML, Duban-Bedu B, et al. Las mutaciones de MYT1L causan discapacidad intelectual y obesidad variable al desregular la expresión génica y el desarrollo del hipotálamo neuroendocrino. Plós Genet. 2017;13:e1006957.

Artículo Google Académico

Kim JG, Armstrong RC, Agoston DV, Robinsky A, Wiese C, Nagle J, et al. El factor de transcripción de mielina 1 (Myt1) del linaje de oligodendrocitos, junto con un dedo de zinc CCHC estrechamente relacionado, se expresa en neuronas en desarrollo en el sistema nervioso central de los mamíferos. J Neurosci Res. 1997;50:272–90.

3.0.CO;2-A" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-4547%2819971015%2950%3A2%3C272%3A%3AAID-JNR16%3E3.0.CO%3B2-A" aria-label="Article reference 17" data-doi="10.1002/(SICI)1097-4547(19971015)50:23.0.CO;2-A">Artículo CAS Google Académico

Weiner JA, Chun J. Png‐1, un gen de dedo de zinc específico del sistema nervioso, identifica regiones que contienen neuronas posmitóticas durante el desarrollo embrionario de mamíferos. J Comp Neurol. 1997; 381: 130–42.

3.0.CO;2-4" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291096-9861%2819970505%29381%3A2%3C130%3A%3AAID-CNE2%3E3.0.CO%3B2-4" aria-label="Article reference 18" data-doi="10.1002/(SICI)1096-9861(19970505)381:23.0.CO;2-4">Artículo CAS Google Académico

Mansfield P, Constantino JN, Baldridge D. MYT1L: una revisión sistemática de la variación genética que abarca la esquizofrenia y el autismo. Am J Med Genet Parte B Neuropsychiatr Genet. 2020;183:227–33.

Artículo Google Académico

Vierbuchen T, Ostermeier A, Pang ZP, Kokubu Y, Sudhof TC, Wernig M. Conversión directa de fibroblastos en neuronas funcionales por factores definidos. Naturaleza 2010;463:1035–41.

Artículo CAS Google Académico

Mall M, Kareta MS, Chanda S, Ahlenius H, Perotti N, Zhou B, et al. Myt1l salvaguarda la identidad neuronal al reprimir activamente muchos destinos no neuronales. Naturaleza 2017;544:245–9.

Artículo CAS Google Académico

Manukyan A, Kowalczyk I, Melhuish TA, Lemiesz A, Wotton D. Análisis de la actividad transcripcional de los factores de transcripción Myt1 y Myt1l. J Cell Biochem. 2018;119:4644–55.

Artículo CAS Google Académico

Romm E, Kim JG, Kim NW, Nagle J, Hudson LD. La familia MyT1 recluta histona desacetilasa para regular la transcripción neuronal. J Neurochem. 2002;81:5–6.

Artículo Google Académico

Treutlein B, Lee QY, Camp JG, Mall M, Koh W, Shariati SAM, et al. Disección de la reprogramación directa de fibroblastos a neuronas usando RNA-seq de una sola célula. Naturaleza 2016;534:391–5.

Artículo Google Académico

Lee QY, Mall M, Chanda S, Zhou B, Sharma KS, Schaukowitch K, et al. Actividad pro-neuronal de Myod1 debido a la unión promiscua a genes neuronales. biol celular nat. 2020;22:401–11.

Artículo CAS Google Académico

Chen J, Lambo ME, Ge X, Dearborn JT, Liu Y, McCullough KB, et al. Un modelo de ratón con síndrome MYT1L recapitula los fenotipos de los pacientes y revela un desarrollo cerebral alterado debido a una maduración neuronal interrumpida. Neurona 2021;109:3775–92.e14.

Artículo CAS Google Académico

Kim S, Oh H, Choi SH, Yoo YE, Noh YW, Cho Y, et al. Déficits transcriptómicos, sinápticos y conductuales posnatales diferenciales de edad similares a ASD en ratones mutantes Myt1l. Representante celular 2022;40:111398.

Artículo CAS Google Académico

Maximov A, Pang ZP, Tervo DGR, Sudhof TC. Seguimiento de la transmisión sináptica en cultivos neuronales primarios mediante estimulación extracelular local. J. Neurosci Met. 2007; 161: 75–87.

Artículo Google Académico

Zhang Y, Pak CH, Han Y, Ahlenius H, Zhang Z, Chanda S, et al. Inducción rápida en un solo paso de neuronas funcionales a partir de células madre pluripotentes humanas. Neurona 2013;78:785–98.

Artículo CAS Google Académico

Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T, et al. Fiji: una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas. Métodos Nat. 2012;9:676–82.

Artículo CAS Google Académico

Arshadi C, Günther U, Eddison M, Harrington KIS, Ferreira TA. SNT: una caja de herramientas unificadora para la cuantificación de la anatomía neuronal. Métodos Nat. 2021;18:374–7.

Artículo CAS Google Académico

Levin JZ, Yassour M, Adiconis X, Nusbaum C, Thompson DA, Friedman N, et al. Análisis comparativo completo de métodos de secuenciación de ARN específicos de cadena. Métodos Nat. 2010;7:709–15.

Artículo CAS Google Académico

Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, et al. STAR: alineador RNA-seq universal ultrarrápido. Bioinformática 2013;29:15–21.

Artículo CAS Google Académico

Love MI, Huber W, Anders S. Estimación moderada de cambio de pliegue y dispersión para datos de RNA-seq con DESeq2. Genoma Biol. 2014;15:550.

Artículo Google Académico

Mimitou EP, Cheng A, Montalbano A, Hao S, Stoeckius M, Legut M, et al. Detección multiplexada de proteínas, transcriptomas, clonotipos y perturbaciones CRISPR en células individuales. Métodos Nat. 2019;16:409–12.

Artículo CAS Google Académico

Gehring J, Park JH, Chen S, Thomson M, Pachter L. RNA-seq de una sola célula altamente multiplexada mediante etiquetado de oligonucleótidos de ADN de proteínas celulares. Nat Biotechnol. 2020;38:35–38.

Artículo CAS Google Académico

Zheng GXY, Terry JM, Belgrader P, Ryvkin P, Bent ZW, Wilson R, et al. Perfil transcripcional digital masivamente paralelo de células individuales. Nat Comun. 2017;8:1–12.

Artículo Google Académico

Hao Y, Hao S, Andersen-Nissen E, Mauck WM, Zheng S, Butler A, et al. Análisis integrado de datos unicelulares multimodales. Celúla. 2021;183:3573–87.e29.

Wolf FA, Angerer P, Theis FJ. SCANPY: análisis de datos de expresión génica unicelular a gran escala. Genoma Biol. 2018;19:15.

Artículo Google Académico

Burkhardt DB, Stanley JS, Tong A, Perdigoto AL, Gigante SA, Herold KC, et al. Cuantificación del efecto de las perturbaciones experimentales en la resolución de una sola celda. Nat Biotechnol. 2021;39:619–29.

Miller SA, Policastro RA, Sriramkumar S, Lai T, Huntington TD, Ladaika CA, et al. LSD1 y la metilación aberrante del ADN median la persistencia de progenitores enteroendocrinos que respaldan el cáncer colorrectal mutante BRAF. Cáncer Res. 2021;81:3791–805.

Artículo CAS Google Académico

Finak G, McDavid A, Yajima M, Deng J, Gersuk V, Shalek AK, et al. MAST: un marco estadístico flexible para evaluar los cambios transcripcionales y caracterizar la heterogeneidad en los datos de secuenciación de ARN de una sola célula. Genoma Biol. 2015;16:278.

Artículo Google Académico

Skene PJ, Henikoff JG, Henikoff S. Perfiles de todo el genoma dirigidos in situ con alta eficiencia para un bajo número de células. Protocolo Nat. 2018;13:1006–19.

Artículo CAS Google Académico

Liu YC, Cheng JK, Lien CC. Cambios dinámicos rápidos de inhibición dendrítica en el giro dentado por patrones de actividad presináptica. J Neurosci. 2014;34:1344–57.

Artículo CAS Google Académico

Gelfman S, Wang Q, Lu YF, Hall D, Bostick CD, Dhindsa R, et al. MeaRtools: un paquete R para el análisis de redes neuronales registradas en matrices de microelectrodos. Plos Comput Biol. 2018;14:e1006506.

Artículo Google Académico

Ohtsuka T, Kageyama R. La sobreexpresión de Hes1 conduce a la expansión del conjunto de células madre neurales embrionarias y del reservorio de células madre en el cerebro posnatal. Desarrollo 2021;148:dev189191.

Artículo CAS Google Académico

Kang HJ, Kawasawa YI, Cheng F, Zhu Y, Xu X, Li M, et al. Transcriptoma espacio-temporal del cerebro humano. Nature 2011;478:483–9.

Artículo CAS Google Académico

Ran X, Li J, Shao Q, Chen H, Lin Z, Sun ZS, et al. EpilepsyGene: un recurso genético para genes y mutaciones relacionadas con la epilepsia. Ácidos nucleicos Res 2015;43:D893–9.

Artículo CAS Google Académico

Hormozdiari F, Penn O, Borenstein E, Eichler EE. El descubrimiento de redes integradas de genes para el autismo y trastornos relacionados. Genoma Res. 2015;25:142–54.

Artículo CAS Google Académico

Voineagu I, Wang X, Johnston P, Lowe JK, Tian Y, Horvath S, et al. El análisis transcriptómico del cerebro autista revela una patología molecular convergente. Naturaleza 2011;474:380–6.

Artículo CAS Google Académico

Tuwaijri AA, Alfadhel M. La mutación MYT1L en un paciente causa discapacidad intelectual y aparición temprana de obesidad: reporte de un caso y revisión de la literatura. J Pediatr Endocrinol Metab. 2019;32:409–13.

Artículo Google Académico

Loid P, Mäkitie R, Costantini A, Viljakainen H, Pekkinen M, Mäkitie O. Una mutación novedosa de MYT1L en un paciente con obesidad grave de inicio temprano y discapacidad intelectual. Am J Med Genet A 2018;176:1972–5.

Artículo CAS Google Académico

Eadie BD, Zhang WN, Boehme F, Gil-Mohapel J, Kainer L, Simpson JM, et al. Los ratones knockout para Fmr1 muestran una ansiedad reducida y alteraciones en la neurogénesis que son específicas de la circunvolución dentada ventral. Neurobiol Dis. 2009;36:361–73.

Artículo CAS Google Académico

Samaco RC, Fryer JD, Ren J, Fyffe S, Chao HT, Sun Y, et al. Un alelo de pérdida parcial de función de la proteína 2 de unión a metil-CpG predice un síndrome del neurodesarrollo humano. Hum Mol Genet. 2008;17:1718–27.

Artículo CAS Google Académico

Yi F, Danko T, Botelho SC, Patzke C, Pak C, Wernig M, et al. La haploinsuficiencia SHANK3 asociada al autismo causa canalopatía Ih en neuronas humanas. Ciencia 2016;352:aaf2669.

Artículo Google Académico

Chanda S, Ang CE, Lee QY, Ghebrial M, Haag D, Shibuya Y, et al. La reprogramación directa de neuronas humanas identifica a MARCKSL1 como un mediador patógeno de la teratogenicidad inducida por ácido valproico. Célula Madre Célula. 2019;25:103–19.e6.

Artículo CAS Google Académico

Pak C, Danko T, Zhang Y, Aoto J, Anderson G, Maxeiner S, et al. El modelado de enfermedades neuropsiquiátricas humanas mediante la eliminación condicional revela defectos de transmisión sináptica causados ​​por mutaciones heterocigóticas en NRXN1. Célula Madre Célula. 2015;17:316–28.

Artículo CAS Google Académico

Martin JF, Bradley A, Olson EN. El gen MHox de homeo box de tipo emparejado se requiere para eventos tempranos de esqueletogénesis en múltiples linajes. Gene Dev. 1995;9:1237–49.

Artículo CAS Google Académico

Stolt CC, Lommes P, Sock E, Chaboissier MC, Schedl A, Wegner M. El factor de transcripción Sox9 determina la elección del destino glial en la médula espinal en desarrollo. Gene Dev. 2003;17:1677–89.

Artículo CAS Google Académico

Flaherty E, Zhu S, Barretto N, Cheng E, Deans PJM, Fernando MB, et al. Impacto neuronal del empalme aberrante NRXN1α específico del paciente. Nat Genet. 2019;51:1679–90.

Artículo CAS Google Académico

Liu XS, Wu H, Krzisch M, Wu X, Graef J, Muffat J, et al. Rescate de neuronas del síndrome X frágil mediante la edición de metilación del ADN del gen FMR1. Celda 2018;172:979–92.e6.

Artículo CAS Google Académico

Amaral DG, Schumann CM, Nordahl CW. Neuroanatomía del autismo. Tendencias Neurosci. 2008;31:137–45.

Artículo CAS Google Académico

Consorcio TGte. El atlas del Consorcio GTEx de los efectos reguladores genéticos en los tejidos humanos. Ciencia 2020;369:1318–30.

Artículo Google Académico

Satoda M, Zhao F, Diaz GA, Burn J, Goodship J, Davidson HR, et al. Las mutaciones en TFAP2B causan el síndrome de Char, una forma familiar de conducto arterioso permeable. Nat Genet. 2000;25:42–6.

Artículo CAS Google Académico

Coursimault J, Guerrot AM, Morrow MM, Schramm C, Zamora FM, Shanmugham A, et al. Trastorno del neurodesarrollo asociado a MYT1L: descripción de 40 nuevos casos y revisión bibliográfica de aspectos clínicos y moleculares. Hum Genet. 2022; 141: 65–80.

Artículo CAS Google Académico

Schott JJ, Alshinawi C, Kyndt F, Probst V, Hoorntje TM, Hulsbeek M, et al.. Los defectos de conducción cardíaca se asocian con mutaciones en SCN5A. gineta mojada. 1999;23:20–1.

Artículo CAS Google Académico

Wegerer JV, Helinger B, Berger M, Walden J. Un efecto antagonista del calcio del nuevo fármaco antiepiléptico lamotrigina. Eur Neuropsychopharm. 1997;7:77–81.

Artículo Google Académico

Rogawski MA, Loscher W. La neurobiología de los fármacos antiepilépticos. Nat Rev Neurosci. 2004;5:553–64.

Artículo CAS Google Académico

Vasconcelos FF, Sessa A, Laranjeira C, Raposo AASF, Teixeira V, Hagey DW, et al. MyT1 contrarresta el programa de progenitores neurales para promover la neurogénesis en vertebrados. representante celular 2016;17:469–83.

Artículo CAS Google Académico

Wöhr M, Fong WM, Janas JA, Mall M, Thome C, Vangipuram M, et al. La haploinsuficiencia de Myt1l conduce a la obesidad y a alteraciones conductuales multifacéticas en ratones. Mol Autismo. 2022;13:19.

Artículo Google Académico

Chen J, Fuhler N, Noguchi K, Dougherty JD. Se requiere MYT1L para suprimir programas de desarrollo neuronal anteriores en el cerebro de ratón adulto. BioRxiv 2022. https://doi.org/10.1101/2022.10.17.512591.

Heyes S, Pratt WS, Rees E, Dahimene S, Ferron L, Owen MJ, et al. Alteración genética de los canales de calcio dependientes de voltaje en trastornos psiquiátricos y neurológicos. Prog. Neurobiol. 2015;134:36–54.

Artículo CAS Google Académico

Andrade A, Brennecke A, Mallat S, Brown J, Gomez-Rivadeneira J, Czepiel N, et al. Asociaciones genéticas entre los canales de calcio dependientes de voltaje y los trastornos psiquiátricos. Int J Mol Sci. 2019;20:3537.

Artículo CAS Google Académico

Avazzadeh S, McDonagh K, Reilly J, Wang Y, Boomkamp SD, McInerney V, et al. Aumento de la señalización de Ca2+ en neuronas NRXN1α+/− derivadas de células madre pluripotentes inducidas por TEA. Mol Autismo. 2019;10:52.

Artículo CAS Google Académico

Caldwell AB, Liu Q, Schroth GP, Galasko DR, Yuan SH, Wagner SL, et al. La desdiferenciación y la represión neuronal definen la enfermedad de Alzheimer familiar. ciencia avanzada 2020;6:5933–46.

Artículo Google Académico

Mertens J, Herdy JR, Traxler L, Schafer ST, Schlachetzki JCM, Böhnke L, et al. Inestabilidad dependiente de la edad del destino neuronal maduro en neuronas inducidas de pacientes con Alzheimer. Célula Madre Célula. 2021;28:1533–48.

Loo L, Simon JM, Xing L, McCoy ES, Niehaus JK, Guo J, et al. Análisis transcriptómico unicelular del desarrollo neocortical de ratón. Nat Comun. 2019;10:1–11.

Artículo CAS Google Académico

Descargar referencias

Agradecemos a L. Meng y M. Wernig por su apoyo para generar y compartir generosamente ratones deficientes en MYT1L. Agradecemos a I. Everlien por el asesoramiento técnico y a K. Oliveras Mate por el análisis inicial de la transcripción. Agradecemos a las instalaciones centrales de DKFZ, específicamente la Instalación central de genómica y proteómica (A. Schulz), el scOpenLab (P. Mallm), los cuidadores del Centro de investigación preclínica (S. So) y la instalación de microscopía óptica (M. Brom, D. Krunic). También agradecemos a B. Kurpiers y C. Pitzer del Núcleo Neuroconductual Interdisciplinario de la Universidad de Heidelberg por su excelente apoyo. Agradecemos a C. Schaaf, D. Odom, F. Winkler, L. Steinmetz, H. Ahlenius, A. Agarwal y a los miembros del laboratorio Mall, incluido T. Kanamaru, por sus ideas y debates.

Este trabajo fue financiado con fondos de Chica and Heinz Schaller Stiftung, 2019 NARSAD Young Investigator Grant, DFG SFB1158-SO2, y 2021 Fritz Thyssen Grant to CAc and CellNetworks (EXC81), 2020 NARSAD Young Investigator Grant, DFG 504019642, ERC StG No 804710 y Hector Stiftung II gGmbH a MM. DP ha sido compatible con el DFG SFB1324. Las becas fueron otorgadas por el DAAD/ANID a JC (57451854/62180003) y la Escuela Internacional de Graduados de Helmholtz a BW, JFT, BL, JT y MS. Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Ignacio L. Ibarra

Dirección actual: Instituto de Biología Computacional, Helmholtz Zentrum München, Centro Alemán de Investigación para la Salud Ambiental, 85764, Neuherberg, Alemania

Estos autores contribuyeron igualmente: Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff.

Grupo de Modelado de Enfermedades e Ingeniería del Destino Celular, Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ) y Alianza DKFZ-ZMBH, 69120, Heidelberg, Alemania

Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff, Sarah D. Grieder, Bryce Lim, Bhuvaneswari Nagarajan, Jule Truberg, Juan M. Adrian-Segarra, Laura K. Schmidt, Janina Kaspar, Eric Poisel, Elisa Heinzelmann, Manu Saraswat, Marleen Christ & Moritz Centro comercial

HITBR Hector Institute for Translational Brain Research gGmbH, 69120, Heidelberg, Alemania

Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff, Sarah D. Grieder, Bryce Lim, Bhuvaneswari Nagarajan, Jule Truberg, Juan M. Adrian-Segarra, Laura K. Schmidt, Janina Kaspar, Eric Poisel, Elisa Heinzelmann, Manu Saraswat, Marleen Christ & Moritz Centro comercial

Instituto Central de Salud Mental, Facultad de Medicina de Mannheim, Universidad de Heidelberg, 68159, Mannheim, Alemania

Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff, Sarah D. Grieder, Bryce Lim, Bhuvaneswari Nagarajan, Jule Truberg, Juan M. Adrian-Segarra, Laura K. Schmidt, Janina Kaspar, Eric Poisel, Elisa Heinzelmann, Manu Saraswat, Marleen Christ & Moritz Centro comercial

Facultad de Biociencias, Universidad de Heidelberg, 69120, Heidelberg, Alemania

Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff, Bryce Lim, Jule Truberg y Manu Saraswat

Departamento de Neurobiología Clínica, Hospital Universitario Heidelberg y DKFZ, Heidelberg, Alemania

Yu-Chao Liu y Hannah Monyer

División de Proteómica de Células Madre y Cáncer, Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ), 69120, Heidelberg, Alemania

Dimitris Papageorgiou y Jeroen Krijgsveld

Facultad de Medicina, Universidad de Heidelberg, 69120, Heidelberg, Alemania

Dimitris Papageorgiou y Jeroen Krijgsveld

Laboratorio Europeo de Biología Molecular, Unidad de Biología Estructural y Computacional, 69115, Heidelberg, Alemania

Christian Arnold, Ignacio L. Ibarra y Judith B. Zaugg

Chica y Heinz Schaller Research Group, Instituto de Anatomía y Biología Celular, Universidad de Heidelberg, 69120, Heidelberg, Alemania

Joaquin Campos & Claudio Acuna

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

BW y JFT fueron responsables del diseño de la investigación, la ejecución, el análisis y la preparación del manuscrito. BL, EP, MS, ILI y CAr diseñaron e implementaron el análisis bioinformático. SG realizó la ingeniería de células madre y los experimentos de neuronas inducidas. JT, LKS, MC y JK contribuyeron con la cultura primaria y el análisis de imágenes. BN y JK apoyaron los estudios de comportamiento. JAS realizó experimentos de células individuales. YCL, JC y CAc realizaron la electrofisiología. DP y JK realizaron la espectrometría de masas. HM, CAc y JZ asesoraron sobre el diseño de la investigación y la preparación del manuscrito. MM diseñó y supervisó la investigación, interpretó los datos y escribió el manuscrito con aportes de todos los autores.

Correspondencia al Centro Comercial Moritz.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Weigel, B., Tegethoff, JF, Grieder, SD et al. La haploinsuficiencia de MYT1L en neuronas humanas y ratones causa fenotipos asociados con el autismo que pueden revertirse mediante una intervención genética y farmacológica. Mol Psiquiatría (2023). https://doi.org/10.1038/s41380-023-01959-7

Descargar cita

Recibido: 24 de marzo de 2022

Revisado: 30 de diciembre de 2022

Aceptado: 11 de enero de 2023

Publicado: 14 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-023-01959-7

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt