Las células del hipocampo segregan engramas positivos y negativos.

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1009 (2022) Citar este artículo

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El hipocampo está involucrado en el procesamiento de una variedad de cálculos mnemotécnicos, específicamente los componentes espaciotemporales y las dimensiones emocionales de la memoria contextual. Estudios recientes han demostrado heterogeneidad celular a lo largo del eje del hipocampo. Se ha demostrado que el hipocampo ventral es importante en el procesamiento de la emoción y la valencia. Aquí, combinamos estrategias de etiquetado dependientes de la actividad transgénicas y basadas en todos los virus para visualizar múltiples engramas específicos de valencia en el vHPC y demostrar dos poblaciones de células parcialmente segregadas y proyecciones que responden a experiencias apetitivas y aversivas. A continuación, utilizando enfoques de secuenciación de ARN y secuenciación de metilación de ADN, encontramos que las células de engrama apetitivas y aversivas de vHPC muestran diferentes programas transcripcionales y paisajes de metilación de ADN en comparación con una población de engrama neutral. Además, la manipulación optogenética de los cuerpos celulares etiquetados en vHPC no es suficiente para impulsar el comportamiento apetitivo o aversivo en la preferencia de lugar en tiempo real, la estimulación de las terminales etiquetadas de vHPC que se proyectan a la amígdala y al núcleo accumbens (NAc), pero no a la corteza prefrontal (PFC) , mostró la preferencia y la evitación de la unidad de capacidad. Estos terminales también pudieron cambiar su capacidad para impulsar el comportamiento. Concluimos que el vHPC contiene poblaciones segregadas genética, celular y conductualmente de células que procesan engramas de memoria apetitivos y aversivos.

Dentro del cerebro encontramos un rico depósito de recuerdos que pueden estar imbuidos de información con valencia positiva y negativa1,2,3. Estas experiencias dejan cambios estructurales y funcionales duraderos4 que se dividen en 1, 5, 6, 7, 8, 9 conjuntos discretos de células y circuitos que componen el engrama de memoria10. Estudios recientes han visualizado y manipulado con éxito conjuntos definidos de células previamente activas durante una sola experiencia10,11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, sigue sin entenderse cómo se representan múltiples engramas de diferentes valencias (en lo sucesivo definidas como células que responden diferencialmente a eventos apetitivos o aversivos de una manera independiente del estímulo18) dentro de la misma región del cerebro. Estudios anteriores han sugerido que el hipocampo ventral (vHPC) demarca y transmite selectivamente información emocional a varios objetivos posteriores. Buscamos caracterizar las identidades moleculares y celulares y las funciones relevantes para el comportamiento de las células vHPC que procesan engramas apetitivos y aversivos, con un enfoque en CA1 ventral (vCA1). Para abordar la cuestión de cómo el vCA1 procesa múltiples experiencias emocionales, primero ideamos una estrategia que combina dos métodos de etiquetado basados ​​en cFos con inmunohistoquímica endógena de cfos para visualizar engramas en tres puntos de tiempo discretos. En primer lugar, trazamos anatómicamente los patrones de proyección de las células vCA1 etiquetadas de manera apetitiva y aversiva para medir la superposición estructural y la segregación en varios objetivos posteriores. En segundo lugar, realizamos secuenciación de ARN de todo el genoma (RNA-seq) y secuenciación de metilación de ADN para investigar las características genéticas de estos conjuntos de células. Por último, probamos conductualmente el papel causal y la flexibilidad funcional de las células vHPC tanto en el cuerpo celular como en la forma específica de proyección.

Primero, para acceder a las células a través de múltiples puntos de tiempo y de una manera dependiente de la actividad dentro del sujeto, usamos el animal transgénico basado en Fos, TRAP218, bajo el control de 4-Hydroxytamoxifeno (4-OHT) emparejado con un Fos de todos los virus -estrategia basada en el control de doxiciclina10 (Dox) (Fig. 1a). Los ratones TRAP2 + que expresan la recombinasa iCre-ERT2, cuando se les inyecta DMSO en lugar de 4-OHT, no muestran expresión de TdTomato (Fig. 1 complementaria), se inyectaron bilateralmente con un cóctel de virus: AAV9-Flex-DIO-TdTomato y AAV-cFos -tTA + AAV-TRE-EYFP. La estrategia cfos-tTA acopla el promotor c-Fos al transactivador de tetraciclina (tTA), que, en su forma de proteína, se une directamente al elemento de respuesta a tetraciclina (TRE) de forma dependiente de doxiciclina (Dox) e impulsa la expresión. de una proteína de interés (es decir, EYFP). La combinación de estos dos sistemas independientes produce dos ventanas inducibles para etiquetar células vHPC dentro del mismo tema (ver Métodos).

Se inyectó a ratones Fos-CreERT2 con un cóctel viral de proporción 1:1 de AAV9-c-Fos-tTA y AAV9-TRE-EYFP mezclados en proporción 1:1 con AAV-Flex-DIO-TdTomato en el vHPC para crear el posibilidad de abrir dos ventanas de etiquetado en el ratón. b Esquema de la línea de tiempo para TAG1 y TAG2 que son dependientes de doxiciclina y 4-hidroxitamoxifeno, respectivamente. La etiqueta aversiva consiste en choques de 4 pies y la etiqueta apetitiva consiste en exposición de hombre a mujer. c Imagen representativa de la segregación de memoria dual en una sección sagital del vHPC, específicamente vCA1. d Cuantificación (% de etiquetado) de células EYFP + (aversivas) y TdTomato + (apetitivas) sobre DAPI a lo largo del eje anterior-posterior de vCA1 que muestra la segregación de valencia. (N = 3) e Esquema para visualizar células activas durante tres experiencias conductuales diferentes. TAG1 es dependiente de doxiciclina en EYFP, TAG2 es dependiente de 4-OHT en TdTomato y, por último, TAG3 se visualiza con inmunohistoquímica mediante tinción para cfos endógenos 90 minutos después de una experiencia conductual. f Esquema de grupos para visualizar superposiciones de memoria triple (n = 4–6 por grupo). Los grupos se equilibraron para evitar posibles sesgos en la línea de tiempo g Imágenes representativas de superposiciones de memoria triple en vCA1 con un zoom de 20x que muestra las diferentes superposiciones representativas. h El número de neuronas etiquetadas en vCA1 es similar entre EYFP, TdTomato y cfos; no hay diferencia estadística entre el reclutamiento. (Comparaciones múltiples Anova unidireccional; N = 10–12) i, Porcentaje de superposición para las respectivas etiquetas de comportamiento para EYFP + Tdtomato para aversivo + apetitivo (Grupo 1), aversivo + aversivo (Grupo 2), apetitivo + aversivo (Grupo 3) , y apetitivo + apetitivo (Grupo 4), (F (3, 12) = 170,0, P < 0,0001). j Diferencia de NS en células superpuestas de cfos+EYFP en estrés de restricción + shock frente a leche condensada azucarada + exposición femenina. k, valencias similares aversiva y estresante y apetitiva y láctea se superponen mucho entre sí en comparación con la superposición de diferentes valencias, apetitiva y estresante y aversiva y láctea. ANOVA unidireccional de comparaciones múltiples; F (3, 12) = 20,77, P < 0,0001. l Recuentos de superposición triple para EYFP + TdTomato + cfos (F (3, 12) = 10,55, ns, no significativo p > 0,05, P = 0,0011; las barras de error representan la media ± la media estándar del error (SEM).

Después de inyectar el cóctel de virus antes mencionado en el vHPC, usamos este sistema de etiquetado dual para etiquetar las células que procesan engramas apetitivos o aversivos. Diez días después de la cirugía y la recuperación, se retiró a los ratones de su dieta DOX chow durante 48 horas para abrir la primera ventana de etiquetado. Mientras estaban fuera de DOX, para etiquetar la experiencia apetitosa, los ratones fueron expuestos a hembras durante 1 hora en una jaula limpia13,19 y se les volvió a poner inmediatamente en la dieta DOX durante el resto del estudio. Para etiquetar la experiencia aversiva, el segundo conjunto de células, 24 horas más tarde, los ratones macho se sometieron a cuatro descargas en los pies de 2 s y 1,5 mA. 30 minutos después del final del condicionamiento del miedo, se inyectó a los ratones 40 mg/kg de 4-OHT y se los dejó en reposo durante 72 horas (Fig. 1b). Primero observamos una distinción anatómica sorprendente entre engramas apetitivos y aversivos a lo largo del eje anterior y posterior en secciones sagitales de vCA1 (Fig. 1c). Las células del engrama apetitivo se ubicaron predominantemente en las secciones más posteriores, mientras que las células del engrama aversivo estuvieron presentes en gran medida en las secciones anteriores de vCA1, con un patrón de sal y pimienta observado dentro de las secciones mediales (Fig. 1c, d). Descubrimos que el orden de etiquetado, el choque de etiquetado y luego la exposición femenina no afectaron el reclutamiento anatómico de estas células (Fig. 2 complementaria).

A continuación, utilizando la misma estrategia de etiquetado dual descrita anteriormente, preguntamos si estas poblaciones etiquetadas con apetitivo y aversivo fueron o no reclutadas durante experiencias posteriores de valencias similares. Con ese fin, agregamos un tercer punto de tiempo al visualizar la expresión endógena de cFos 90 minutos después de una experiencia de comportamiento final, es decir, exposición a leche condensada azucarada o estrés de restricción20,21,22,23 (Fig. 1e, f). Para controlar el orden de las experiencias, contrapesamos los cuatro grupos, cada uno de los cuales contenía dos poblaciones de células marcadas (es decir, aversivas para las células marcadas por el condicionamiento del miedo y apetitivas para las células marcadas por interacciones hombre-mujer), seguidas de una tercera experiencia de variables valencia, estrés de restricción como otro aversivo y leche condensada azucarada como la otra experiencia apetitiva, que fue capturada por la expresión endógena de cFos. Nuestros grupos fueron los siguientes: Estrés Aversivo-Apetitivo-Restringido (GRUPO 1), Estrés Aversivo-Aversivo-Restringido (GRUPO 2), Leche Condensada Apetitiva-Aversiva-Azucarada (GRUPO 3), y Leche Condensada Apetitiva-Apetitiva-Azucarada (GRUPO 4) ) como se muestra en la Fig. 1f. En cada grupo, medimos la colocalización celular de TdTomato, EYFP y cFos para inferir qué células estaban activas en una o más de las tres experiencias (Fig. 1g). Todos los ratones exhibieron una proporción similar de células etiquetadas en los tres enfoques de etiquetado, independientemente del método de etiquetado o valencia (Fig. 1h y Fig. 3 complementaria).

Los análisis histológicos revelaron que había tasas significativamente más altas de células que mostraban la co-localización de TdTomato y EYFP cuando se etiquetaban con las mismas experiencias (es decir, apetitivas y apetitivas) y tasas más bajas de co-localización cuando se etiquetaban experiencias con diferente valencia (es decir, apetitivas y aversivas) en Figura 1i. Además, observamos una colocalización significativa entre TdTomato, EYFP y cFos cuando los ratones fueron sometidos a tres experiencias aversivas o tres apetitosas (Fig. 1l), es decir, GRUPO 2 y GRUPO 4 respectivamente. Las células marcadas con apetito se reactivaron preferentemente cuando los ratones se expusieron a leche condensada azucarada, y las células marcadas con aversión se reactivaron preferentemente cuando los ratones se expusieron a estrés por restricción (Fig. 1j, k). Juntos, estos hallazgos plantean la intrigante posibilidad de que vCA1 designe información emocionalmente relevante para dos conjuntos de celdas parcialmente no superpuestas.

En el futuro, elegimos dos engramas con valencia, shock y exposición hombre-mujer, como proxy para comprender mejor cómo el vHPC procesa estas experiencias aversivas y apetitivas. Por lo tanto, utilizamos las mismas estrategias de etiquetado dual para caracterizar las propiedades fisiológicas básicas de las células vHPC (Fig. 4 complementaria). Los ratones TRAP2 se inyectaron simultáneamente con los mismos virus dependientes de la actividad y se etiquetaron de la misma manera que se mencionó anteriormente (Figuras complementarias 4a, b). Curiosamente, no observamos ninguna diferencia en la frecuencia de activación, la caracterización por encima del umbral, la tasa de adaptación, la tasa de entrada o las tasas de pico (Figura complementaria 4c-l), lo que sugiere que, a pesar de reclutar conjuntos de células parcialmente no superpuestas para experiencias apetitivas y aversivas, estas mismas células etiquetadas comparten características fisiológicas similares.

A pesar de estas similitudes fisiológicas, se ha demostrado que las células vHPC se proyectan a una miríada de regiones cerebrales distintas involucradas en el estrés y los comportamientos de evitación de acercamiento, formando así redes multirregionales que involucran emoción y memoria1. Especulamos que dentro de estas redes existe una heterogeneidad estructural definida en parte por si una experiencia tiene una valencia apetitiva o adversa, como se ha observado en áreas que incluyen la amígdala10,24,25, el núcleo accumbens26 y la corteza prefrontal medial27. Usando nuestra estrategia de etiquetado dual, luego rastreamos las salidas de vHPC etiquetadas por experiencias de apetito y choque dentro del sujeto y medimos las intensidades de fluorescencia axonal en las siguientes áreas objetivo, dado su papel crucial en el procesamiento emocional: BLA, NAc, PFC, dorsal hipotálamo, fórnix y giro dentado (Fig. 2a, b). Curiosamente, observamos una señal fluorescente roja y verde entre los terminales vCA1 marcados con apetito y aversión en el BLA medial (AP -1.8) y el PFC (incluidos IL y PL), mientras que también encontramos evidencia de segregación estructural en las siguientes regiones: observaron proyecciones EYFP (apetitivas) predominantemente más fuertes, medidas por intensidades de fluorescencia, en la parte posterior de la amígdala basomedial (BMP), la parte anterior de la comisura anterior (ACA), el fórnix, el núcleo hipotalámico medial dorsal (DMD y DMV) y la capa inferior de la circunvolución dentada (Fig. 2c-o). Además, encontramos proyecciones predominantemente más fuertes de TdTomato (aversivas) en el BLA anterior, el BLA posterior, el núcleo NAc y la capa superior del DG (Fig. 2c-o). Estudios anteriores han demostrado que las neuronas en regiones como PFC27, NAc26 y BLA10.25 procesan colectivamente las experiencias de una manera que puede ser anatómicamente segregada o heterogénea. Postulamos que las terminales vHPC etiquetadas con apetito y aversión están integradas en una red más grande de procesamiento de memoria emocional que puede definirse en parte tanto por patrones anatómicos únicos como por el reclutamiento dependiente de la actividad de conjuntos involucrados en el procesamiento de una valencia específica.

Se inyectó a ratones Fos-CreERT2 con un cóctel viral de proporción 1:1 de AAV9-c-Fos-tTA y AAV9-TRE-EYFP mezclados con AAV-Flex-DIO-TdTomato en el vHPC para el etiquetado de memoria dual. b Cronología experimental para el etiquetado; EYFP representa aversión y TdTomato representa apetito. c, d Imágenes representativas de proyecciones terminales; BLA anterior, medial y posterior, hipocampo dorsal, corteza prefrontal, núcleo accumbens, núcleo hipotalámico medial dorsal y fórnix. Unidades arbitrarias para EYFP (apetitivo) y TdTom (aversivo) (N = 3) para e, BLA anterior (prueba t de Student no apareada t = 7.279, df = 4, p = 0.00019), f BLA medial (t = 1.271, df = 4; p = 0,2725), g, BLA posterior (t = 14,95, df = 4; p = 0,0001), h, BMP (t = 6,168, df = 4; p = 0,0035), i, PFC (incluye IL y PL) (t = 1.078, df = 4; p = 0.3419), j, ACA (t = 50.68, df = 4; P < 0.0001), k, NAc Core (t = 3.018, df = 4; p = 0.0392 ), l, fórnix (t = 5,718, df = 4; p = 0,0046), m, hipotálamo t = 13,96, df = 4; p = 0.0002, n, capa superior de DG (t = 54.94, df = 4; p < 0.0001), o, capa inferior de DG (t = 11.73, df = 4; p = 0.0003). ns = p > 0,05. Las barras de error representan la media ± SEM. Las barras de escala son todas de 100 μm.

Estudios recientes han identificado perfiles moleculares únicos de células vCA1 que contienen distintos objetivos de proyección. Estas proyecciones de vCA1 transmiten información a múltiples áreas involucradas en la emoción y la memoria y forman una red que se puede organizar por características arquitectónicas únicas, incluidas las entradas, salidas y firmas transcripcionales de células vCA11. Queríamos hacer la pregunta de si las poblaciones de células en su conjunto, para el engrama apetitivo o aversivo, tienen diferencias genéticas distintas basadas en la experiencia. En consecuencia, a continuación examinamos si la composición molecular de las células vHPC contenía perfiles genéticos distintos. Para catalogar el panorama molecular de las células vHPC de una manera dependiente de la actividad, etiquetamos una experiencia apetitiva (es decir, interacciones hombre-mujer), una experiencia aversiva (es decir, descargas múltiples) o una experiencia neutral (es decir, exposición a la misma jaula de condicionamiento sin un estímulo apetitivo o aversivo, ver métodos, Fig. 3a). Luego realizamos RNA-seq usando núcleos etiquetados (EYFP + ) aislados por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), que mostró ~ 0, 6% de núcleos etiquetados de los grupos apetitivos y aversivos, mientras que neutral reclutó en promedio 0, 35 % de núcleos EYFP + ( Fig. 3b, c). Los grupos apetitivo y aversivo reclutaron significativamente más núcleos EYFP + que el grupo de experiencia neutral (Fig. 3c). Al comparar las células vCA1 aversivas y apetitivas con el grupo neutral, identificamos 474 genes expresados ​​​​diferencialmente (DEG) en células vCA1 aversivas (Fig. 3d, f), incluidos 340 genes regulados a la baja y 134 genes regulados al alza (Fig. 3g). También identificamos 1104 DEG en células vCA1 apetitivas en comparación con el grupo neutral (Fig. 3e, f), incluidos 1025 genes regulados a la baja y 79 genes regulados al alza (Fig. 3g). Hubo 842 DEG únicos en células de engrama apetitivo y 212 DEG únicos en células de engrama aversivo (Fig. 3f), lo que sugiere paisajes transcripcionales distintos en estas dos poblaciones.

un esquema experimental para etiquetar, aislar y analizar los dos grupos de células vCA1 marcadas por EYFP tras estimulación aversiva (descarga eléctrica) o estimulación apetitiva (ratones machos que interactúan socialmente con ratones hembra) o condicionamiento neutral en la misma jaula sin aversivo o estimulación apetitiva. b Aislamiento FACS de núcleos con apetito por EYFP del hipocampo de ratones marcados con el virus AAV9-cFos-tTA + AAV9-TRE-ChR2-EYFP de sus respectivos grupos c, Porcentaje de núcleos con apetito por EYFP de cada grupo (N = 3 por grupo /punto de tiempo, ANOVA ordinario unidireccional, comparaciones múltiples ***P = 0,001, ****P < 0,0001, ns = no significativo, p > 0,05). d Un diagrama de volcán con el cambio relativo de veces de la expresión génica en relación log 2 y el valor p ajustado por FDR en relación log 2 como eje X e Y que muestra los genes regulados hacia arriba y hacia abajo en células vCA1 aversivas en comparación con el grupo neutral. Los genes regulados hacia arriba o hacia abajo con un valor de p ajustado por FDR inferior a 1e-5 más diferencias de al menos cuatro veces se resaltaron en rojo o azul, respectivamente. Los nombres de los genes se mostraron para los 20 genes más importantes clasificados según las estadísticas de Wald. e Un gráfico de volcán que muestra los genes regulados hacia arriba y hacia abajo en células vCA1 apetitivas en comparación con el grupo neutral. f Un diagrama de Venn que muestra los 1104 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en células apetitivas y 474 DEG en células vCA1 aversivas. Se identificaron 262 DEG en ambos grupos. g Un gráfico UpSet que muestra 226 genes regulados negativamente en células vCA1 aversivas y apetitivas, y 35 genes regulados positivamente en células vCA1 aversivas y apetitivas. Solo un gen (Nufip1) estaba regulado positivamente en el engrama apetitivo pero regulado negativamente en el engrama aversivo. Las barras de error representan la media ± SEM.

Además, los 20 principales DEG regulados a la baja identificados para células vCA1 aversivas y apetitivas no se superponen entre sí, y 14 de los 20 DEG principales regulados al alza para células vCA1 aversivas y apetitivas no se superponen entre sí (Fig. 3d, e, Tablas complementarias 1 y 2), apoyando los distintos transcriptomas en estas neuronas. Curiosamente, entre los 262 DEG compartidos, identificamos un gen Nufip1 (Proteína 1 que interactúa con la proteína de retraso mental nuclear frágil X) que estaba regulado al alza en las células vCA1 apetitivas y regulado a la baja en las células vCA1 aversivas (Fig. 3g). Este gen codifica una proteína de unión a ARN nuclear que contiene un motivo de dedo de zinc C2H2 y una señal de localización nuclear28. Las enfermedades asociadas con las mutaciones de NUFIP1 incluyen el síndrome de Peho (encefalopatía progresiva con edema, hipsarritmia y atrofia óptica), un trastorno neurodegenerativo progresivo autosómico recesivo y dominante que comienza en las primeras semanas o meses de vida. Su proteína interactuante FMRP1 es esencial para la síntesis de proteínas en la sinapsis29 y la mutación de expansión del trinucleótido CGG del gen FMR1 que codifica FMRP1 causa el síndrome X frágil, la discapacidad intelectual más común en los hombres30. La investigación adicional de la importancia funcional de NUFIP1 y otros DEG podría revelar información mecanicista sobre la plasticidad transcriptómica involucrada por las valencias de la memoria.

Para obtener una visión más profunda de las firmas moleculares de los transcriptomas asociados con las células vCA1 aversivas y apetitivas, realizamos un análisis de Gene Ontology (GO) de las vías reguladas hacia arriba y hacia abajo en las células vCA1 aversivas y apetitivas (Fig. 4a-d). Descubrimos que la vía superior regulada al alza en las células vCA1 aversivas involucraba complejos de neurotransmisores como la actividad del receptor de glutamato ionotrópico (Fig. 4a). Este hallazgo es consistente con estudios previos que utilizaron tejidos cerebrales que identificaron 3.759 regiones de ADN metiladas diferencialmente en el hipocampo asociadas con 1.206 genes enriquecidos en las categorías de actividad del canal controlado por iones después del condicionamiento del miedo contextual29,31,32. Curiosamente, encontramos que la vía superior regulada a la baja en las células vCA1 aversivas involucraba la reparación del desajuste de ADN (Fig. 4b). Aunque las vías superiores reguladas al alza en las células vCA1 apetitivas también incluyen la actividad del receptor de glutamato ionotrópico (Fig. 4c), las vías superiores reguladas a la baja en las células vCA1 apetitivas enriquecen el ensamblaje del axonema y la formación de haces de microtúbulos (Fig. 4d) diferentes de las vías reguladas a la baja en vCA1 apetitivo células (Fig. 4b). A continuación, comparamos los datos de RNA-seq entre células vCA1 aversivas y apetitivas directamente. Identificamos 494 DEG, incluidos 47 genes regulados al alza y 447 genes regulados a la baja (Figura complementaria 5a y Tabla complementaria 3). Además, encontramos que cinco vías estaban reguladas al alza en las células vCA1 apetitivas, como el complejo de ARNasa de exosoma nuclear, y 16 vías estaban reguladas a la baja en el engrama apetitivo en comparación con las células vCA1 aversivas, como el ensamblaje del axonema. Figura complementaria 5b, c). Estas vías de señalización alteradas diferencialmente entre las células vCA1 aversivas y apetitivas, que resultaron de múltiples comparaciones, respaldan nuestra conclusión de que estas neuronas representan subpoblaciones transcripcionalmente distintas. Una dirección futura es explorar las funciones de estos DEG y las vías de señalización alteradas. Como prueba de concepto, aplicamos GeneMANIA33 para predecir las funciones de los 20 DEG principales en la figura 4e-h. Por ejemplo, el inhibidor 2 de la angiogénesis específico del cerebro (BAI2) se identifica únicamente para los DEG regulados al alza en células vCA1 aversivas (Fig. 4e), y el receptor de glutamato ionotrópico solo está implicado para los DEG regulados al alza en células vCA1 apetitivas (Fig. 4g ). De manera similar, el componente de la vía de señalización WNT Disheveled se identifica de manera única para los DEG regulados negativamente en células vCA1 aversivas (Fig. 4f), y el canal TRPV1-4 solo está implicado para los DEG regulados positivamente en células vCA1 apetitivas (Fig. 4h). El estudio de la función de pérdida y ganancia de estos genes predichos proporcionará una visión mecánica de las firmas moleculares de las neuronas de engrama con diferentes valencias de memoria.

un análisis de conjunto de enriquecimiento de genes de las vías reguladas al alza en engramas aversivos utilizando el módulo Gene Ontology (GO). El tamaño del punto representa el recuento de genes y el color del punto indica el FDR. La vía con un valor de P ajustado por FDR inferior a 0,25 se considera significativamente enriquecida. b Análisis GO de vías reguladas a la baja en células vCA1 aversivas. c Análisis GO de vías reguladas al alza en células vCA1 apetitivas. d Análisis GO de vías reguladas a la baja en células vCA1 apetitivas. Red GeneMANIA de los 20 principales genes regulados al alza y a la baja en células vCA1 aversivas y apetitivas, respectivamente. Los genes con nodos rojos se regulan al alza e, o se regulan a la baja f, en las células vCA1 aversivas en comparación con la muestra neutral, y los genes con nodos verdes se regulan al alza (g) o se regulan a la baja (h) en el vCA1 apetitivo en comparación con la muestra neutral. Los nodos grises representan los genes que interactúan con estos 20 genes expresados ​​diferencialmente. Los dominios de proteínas compartidos respaldados por las bases de datos de dominio InterPro dentro de cada red se etiquetaron en rojo para las células vCA1 aversivas y en verde para las células vCA1 apetitivas. La descripción detallada de cada dominio de proteína compartido se enumera en la Tabla complementaria 4. Las categorías de la red de interacción entre estos genes se anotan en la leyenda junto al panel g.

Además de los distintos perfiles transcriptómicos en las neuronas del engrama descritos anteriormente, estudios recientes revelan el papel de preparación transcripcional de la regulación epigenética en el engrama34. Para explorar si el paisaje epigenómico dinámico también contribuye a la especificidad de las neuronas de engrama con diferentes valencias, realizamos una secuenciación de bisulfito de representación reducida (RRBS) para caracterizar los paisajes de metilación del ADN en células vCA1 aversivas y apetitivas. Como se muestra en la Fig. 5a, b, identificamos 1939 citosinas diferencialmente metiladas (DMC) con un cambio en la metilación del ADN superior al 20% y un valor de p inferior a 0,05 en células vCA1 aversivas en comparación con el grupo neutral, y 3117 DMC en vCA1 apetitivo células. Estos DMC están ubicados en las diferentes posiciones del genoma, incluidos 5'UTR, promotor, exón, intrón, 3'UTR, sitios de terminación de la transcripción (TTS), regiones intergénicas no codificantes, lo que sugiere un rendimiento funcional diferente a nivel transcripcional. Curiosamente, las distribuciones genómicas de estos DMC en células vCA1 aversivas son ligeramente diferentes de las de vCA1 apetitivo (Tabla complementaria 5). Con base en estos DMC, identificamos regiones metiladas diferencialmente (DMR) que contienen al menos dos DMC para cada DMR (Fig. 5c, d). Estos DMR nos permiten identificar los genes diferencialmente metilados (DMG) que contienen o están cerca de estos DMR. Los 20 principales DMG con un cambio en el nivel de metilación superior al 20 % y un valor de p inferior a 0,05 no muestran superposición entre las células vCA1 aversivas y apetitivas, lo que sugiere que diferentes valencias de memoria desencadenan diferentes cambios en las metilaciones del ADN. Entre los 266 DMG en células vCA1 apetitivas y los 98 DMG en células vCA1 aversivas, solo se comparten comúnmente 32 DMG (Fig. 5e, Datos complementarios 1), lo que confirma el paisaje distinto de metilación del ADN entre estas dos poblaciones de células de engrama. Por último, realizamos un análisis de Gene Ontology (GO) de DMG en células vCA1 aversivas y apetitivas (Fig. 5f, g). Encontramos que las vías en las células vCA1 aversivas se enriquecieron principalmente en la estructura y función de las conexiones sinápticas (Fig. 5f). Sin embargo, las vías enriquecidas en células vCA1 apetitivas son mucho más diversas, incluido el crecimiento de axones, la conexión sináptica, los canales iónicos y el complejo regulador de la transcripción de ARN polimerasa II (Fig. 5g). Estas vías diferencialmente enriquecidas entre células vCA1 aversivas y apetitivas sugieren salidas funcionales potencialmente distinguidas atribuidas por la metilación del ADN a nivel transcripcional para conferir la especificidad de las valencias de memoria. Una dirección futura interesante es explorar el mantenimiento y las funciones de estos cambios de metilación del ADN durante la consolidación y recuperación de la memoria. En general, nuestros resultados en las Figs. 3, 4 y 5 mostraron que las distintas firmas moleculares de las células vCA1 aversivas y apetitivas se reflejan en los niveles transcriptómicos y epigenómicos, lo que probablemente contribuya a las diferentes valencias de la memoria.

Gráficos de volcán que muestran las citosinas metiladas diferencialmente (DMC) con el cambio de metilación del ADN superior al 20 % y un valor de p inferior a 0,05 en células vCA1 aversivas a o apetitivas b en comparación con el grupo neutral. Los DMC en diferentes posiciones genómicas (3'UTR, 5'UTR, exón, intergénico, intrón, promotor no codificante, TSS) están codificados por colores. Gráfica de volcán que muestra regiones metiladas de manera diferente (DMR) que contienen al menos dos DMC para cada DMR en células vCA1 aversivas c y apetitivas d. Las 10 regiones principales hipermetiladas e hipometiladas se resaltaron en rosa o azul por separado y se anotaron en sus genes más cercanos. e Un diagrama de Venn que muestra genes metilados de manera diferente (DMG) que están asociados con DMR en c y d identificados en células vCA1 aversivas y apetitivas. f, análisis GO de DMG en células vCA1 aversivas. g Análisis GO de DMG en células vCA1 apetitivas.

Se sabe que vCA1 tiene proyecciones monosinápticas en BLA, NAc y mPFC35. Estudios previos han demostrado que estas regiones cerebrales son importantes en la modulación de experiencias tanto apetitivas como aversivas, especialmente en NAc26,36 y BLA24,37, en las que se han identificado poblaciones celulares molecular y topográficamente distintas para cada comportamiento. Por lo tanto, probamos el papel causal de los cuerpos celulares vHPC etiquetados y sus terminales seleccionados en el comportamiento de conducción al infundir primero un cóctel de virus de AAV9-cFos-tTA y AAV9-TRE-ChR2-EYFP o AAV9-TRE-EYFP en vCA1. Luego implantamos una fibra óptica bilateralmente sobre el vCA1 o sus terminales, vCA1–BLA, vCA1–NAc, vCA1–PFC (Fig. 6a). Primero descubrimos que todas las terminales eran capaces de activar sus objetivos aguas abajo correspondientes al evaluar los aumentos en los niveles de cFos después de la estimulación (Fig. 6 complementaria). Después de 10 días de recuperación, se retiró DOX a un grupo separado de ratones y se etiquetaron con experiencias aversivas (es decir, shock) o apetitivas (es decir, interacciones entre hombres y mujeres). Como se ilustra en la Fig. 6b, para el primer conjunto de experimentos, el día 1, los ratones etiquetados con aversión se colocaron en una cámara de preferencia/evitación de lugar en tiempo real (RTPP/A) el día 1 para evaluar los niveles de referencia. El día 3, los animales se volvieron a colocar en la cámara PTPP/A; esta vez recibieron estimulación óptica a 20 Hz bilateralmente en un lado y ninguna estimulación en el otro. Descubrimos que la estimulación óptica de las terminales vCA1-BLA o vCA1-NAc generó aversión (Fig. 6e, f), mientras que los controles EYFP, la estimulación del cuerpo celular vCA1 y las terminales vCA1-PFC no se desviaron estadísticamente de los niveles de referencia (Fig. 6c , d, g). El día 5 del experimento, los ratones se sometieron a un protocolo de inducción, como se informó anteriormente13, para probar la capacidad del engrama para cambiar el comportamiento que impulsa. Los ratones machos marcados con aversión se colocaron en una nueva cámara con un ratón hembra durante 10 minutos mientras recibían estimulación óptica durante toda la exposición. Posteriormente, los animales se volvieron a colocar en sus cámaras y se evaluaron los cambios de comportamiento el día 7. En esta prueba posterior a la inducción, observamos que la estimulación óptica de los terminales vCA1-BLA ahora era suficiente para impulsar la preferencia a pesar de generar aversión en la preinducción. prueba antes (Fig. 6e). El protocolo de inducción también reveló que las terminales vCA1-NAc, que anteriormente eran suficientes para impulsar la aversión, ahora habían invertido o restablecido su capacidad para modular el comportamiento y regresaron a los niveles de referencia (Fig. 6g). Por último, no vimos cambios en los controles EYFP, el cuerpo celular vCA1 o la estimulación vCA1-PFC (Fig. 6c, d, g).

A los ratones se les inyectó un cóctel de virus de AAV9-c-Fos-tTA AAV9-TRE-ChR2-EYFP o AAV9-TRE-EYFP en vCA1 y se colocaron fibras ópticas bilateralmente sobre los cuerpos celulares de vCA1 o los terminales de vCA1 a BLA , Nacc, o el PFC, en grupos separados. Luego, los ratones se etiquetaron con una experiencia aversiva o apetitiva y se sometieron a evitación y preferencia de opto-lugar en tiempo real. a Imágenes representativas de cuerpos celulares de etiquetado de ChR2-EYFP en vCA1 y sus respectivos terminales en BLA, NAcc y PFC. b Protocolo de miedo a la recompensa en el que los sujetos recibieron estimulación del cuerpo celular vCA1 o proyecciones vCA1 a los terminales BLA, NAcc o PFC. c–g Porcentaje de preferencia por el lado de la estimulación al inicio, antes de la inducción y después de la inducción (n = 7 sujetos para controles EYFP, n = 8 sujetos para vCA1, n = 8 sujetos para BLA, n = 7 para NAcc y n = 7 para PFC, **P = 0,0018, ***P = 0,0006, ANOVA unidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey). h Protocolo de recompensa al miedo en el que los sujetos recibieron estimulación de terminales BLA, NAcc o PFC que se originaban en vCA1. i–m, porcentaje de preferencia por el lado de la estimulación al inicio, antes de la inducción y después de la inducción (n = 7 para EYFP, n = 9 para vCA1, n = 8 para BLA, n = 7 para NAcc y n = 7 para PFC, ns = p > 0,05, **P = 0,0032, ****P < 0,0001, ANOVA unidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Las barras de error representan la media ± SEM.).

A continuación, preguntamos si las terminales vCA1 etiquetadas con apetito para BLA, NAc o PFC eran suficientes para modular el comportamiento (Fig. 6h). Similar a los hallazgos anteriores, la estimulación óptica de las terminales vCA1-BLA (Fig. 6k) y vCA1-NAc (Fig. 6l), pero no en ninguno de los otros grupos (Fig. 6i, j, m), fue suficiente para impulsar lugar de preferencia. Durante la fase de inducción del experimento, colocamos a los ratones en una cámara de acondicionamiento del miedo donde recibieron múltiples golpes en los pies y estimulación óptica simultánea de las terminales marcadas con el apetito. Este experimento evaluó si estos terminales vCA1 pueden cambiar o restablecer su capacidad para impulsar la preferencia de una manera que refleja los experimentos anteriores. De hecho, encontramos que en las pruebas posteriores a la inducción, el grupo vCA1-BLA cambia de preferencia de conducción a aversión (Fig. 6k) mientras que el grupo vCA1-NAc se restablece de la preferencia de conducción a los niveles de referencia (Fig. 6l). Además, no observamos este efecto en animales etiquetados con neutralidad (Fig. 7 complementaria), ni vimos ningún cambio de comportamiento estadísticamente significativo para la tarea RTPP/A en los controles EYFP, el grupo de estimulación del cuerpo celular vCA1 o vCA1-PFC grupo de estimulación (Fig. 6i, j, m). Es importante destacar que probamos si la estimulación óptica puede causar aumentos en los comportamientos motores. No encontramos diferencias significativas en la distancia recorrida en todos los grupos durante las épocas de luz encendida o apagada en un campo abierto (Fig. 8 complementaria). Además, la falta de preferencia o evitación observada en la estimulación del cuerpo celular de vCA1 planteó la posibilidad de que el papel de vCA1 en el comportamiento de conducción se determine de una manera específica terminal35; una noción que encaja con estudios recientes que sugieren que los cálculos a lo largo de los axones de un cuerpo celular determinado pueden impulsar de manera diferencial el comportamiento de acuerdo con el objetivo aguas abajo8. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que los cuerpos celulares vHPC transmiten su contenido específico de valencia y relevante desde el punto de vista del comportamiento a sus objetivos posteriores a pesar de compartir firmas moleculares y neuronales parcialmente no superpuestas y patrones de proyección distintos. Esto está corroborado por la evidencia que muestra que las salidas axonales de vHPC enrutan preferentemente características independientes de un comportamiento determinado7.

Aquí hemos demostrado que el vHPC procesa experiencias apetitivas y aversivas en poblaciones definidas de células que son parcialmente distintas a nivel molecular, celular y de proyección específica. También demostramos su capacidad para impulsar comportamientos a través de terminales específicos de proyección funcionalmente plásticos. Nuestros datos inmunohistoquímicos sugieren que vCA1 contiene al menos tres poblaciones de neuronas: dos subconjuntos que se pueden demarcar en función de sus ubicaciones anteroposteriores y su respuesta preferencial a las valencias apetitivas o aversivas, y una tercera población que responde a ambas, tal vez reflejando una predilección biológica por prominencia5. Si bien sus resultados estructurales y funcionales exactos en todo el cerebro siguen sin determinarse, especulamos que nuestra población observada de células vCA1 que responden a la aversión es un superconjunto de células de ansiedad observadas recientemente que transmiten información al hipotálamo25 y PFC38. Además, las células vCA1 que procesan aversión o apetito tal vez enrutan información e inervan BLA y NAc en diferentes tipos anatómicos, de receptores y de células, optimizando específicamente su capacidad para integrar información mnemotécnica25.

Además, al combinar estrategias de etiquetado dependientes de la actividad transgénica con la expresión de fluoróforos basada en todos los virus, nuestro diseño permite la visualización de múltiples conjuntos dentro del sujeto, lo que se fusiona con estudios previos que monitorean y manipulan un solo conjunto activo en dos discretos puntos de tiempo también26. Al cruzar estos enfoques con estrategias de secuenciación genética, estas herramientas permiten el etiquetado, la manipulación y la documentación molecular de las células que procesan comportamientos aversivos y apetitivos, lo que abre la posibilidad de catalogar las similitudes y diferencias topográficas entre los dos en todo el cerebro. Por ejemplo, los estudios futuros pueden probar la composición molecular de las células vCA1 marcadas con apetito y aversión a lo largo de su eje anterior-posterior, y evaluar si los perfiles transcriptómicos de estas células difieren o no tanto en la valencia como en su ubicación física. Además, es intrigante que las terminales marcadas con apetito y aversión de vCA1 mostraran evidencia de segregación dentro de la amígdala y el hipocampo. En consecuencia, la investigación posterior puede tratar de desentrañar funcionalmente sus contribuciones al comportamiento y medir los tipos de información que transmiten a través de una combinación de imágenes y enfoques de perturbación específicos del terminal.

Es importante restringir las interpretaciones de los engramas dada la amplia gama de herramientas genéticas que se utilizan para acceder a las células de manera dependiente de la actividad. Por ejemplo, los conjuntos de vCA1 varían drásticamente en tamaño y patrones de actividad en el aprendizaje y la memoria. Estos números van desde porcentajes únicos y pueden alcanzar ~35 % de las células según el marcador genético temprano inmediato utilizado, la estrategia de etiquetado, la línea de roedores y las herramientas virales empleadas36,39,40,41. Oportunamente, creemos que nuestra estrategia de etiquetado dual sobremuestrea parcialmente el número de células etiquetadas dado el marco de tiempo necesario para que ocurra el etiquetado (por ejemplo, 48 horas sin Dox; 72 horas después de la inyección de 4OHT42,43,44,45), y los experimentos futuros pueden apuntar a mejorar la resolución temporal de los enfoques de etiquetado contemporáneos para mejorar la relación señal-ruido del etiquetado relacionado con la experiencia al etiquetado de fondo o fugas. Además, las células cFos+ solo reflejan un subconjunto de un engrama que, de lo contrario, se distribuye por todo el cerebro y recluta numerosos genes tempranos inmediatos, tipos de células y actividad fisiológica complementaria que los marcadores dependientes de la actividad pueden no capturar debido a las escalas de tiempo relativamente lentas de la expresión génica. . De hecho, observamos que, si bien las células cFos+ indican actividad neuronal reciente, una célula que estuvo activa recientemente no necesariamente tiene que expresar cFos, especialmente en regiones del cerebro y tipos de células que presumiblemente tienen sus propios umbrales para la expresión de cFos. Estos puntos resaltan la naturaleza compleja de un engrama de memoria y subrayan una precaución que se justifica cuando se interpretan los datos a la luz de las limitaciones técnicas inherentes. Creemos que un enfoque multifacético que combine estrategias de etiquetado genético con imágenes en tiempo real durante comportamientos complejos ayudará a desentrañar la relación entre la actividad neuronal, las modificaciones genéticas y los cambios a nivel de sistemas en respuesta al aprendizaje y la memoria.

Nuestras manipulaciones de terminales están en línea con estudios recientes que demuestran el enrutamiento de información específico de terminales de cuerpos celulares vCA1 a través de una variedad de procesos simples, bifurcantes y trifurcantes8,46,47. Nuestros datos proporcionan una demostración de ganancia de función de que los terminales vCA1 activados pueden generar preferencia o aversión, lo que creemos que fue ofuscado por la estimulación del cuerpo celular dado que este último presumiblemente activa el cuerpo celular y la mayoría, si no todas, las salidas axonales correspondientes. El primero modularía selectivamente un conjunto de terminales que emergen de vCA1 que se proyectan a un área de destino distinta mientras que solo afecta mínimamente a los terminales de vCA1 que se proyectan a otras áreas de destino. Además, si bien la base molecular que subyace a nuestros experimentos de cambio de valencia sigue siendo desconocida, postulamos que la plasticidad del transcriptoma podría conferir la capacidad de cambiar qué aspecto del comportamiento impulsa una terminal dadas las respuestas rápidas y duraderas al aprendizaje y la memoria presentes en la genética. nivel en celdas etiquetadas34.

De hecho, el paisaje transcripcional integral en el hipocampo del ratón es dinámico a lo largo de la vida de la formación y el recuerdo de la memoria, y sus modificaciones dependientes de la experiencia están presentes en gran medida específicamente en las células etiquetadas a los pocos minutos del aprendizaje y duran varias semanas47. Los experimentos futuros pueden realizar RNA-seq en las células antes y después del protocolo de inducción para medir los cambios transcripcionales resultantes e identificar loci putativos que median dicha plasticidad funcional. Además, nuestros datos de secuenciación mejoran nuestra comprensión de cómo el hipocampo ventral analiza genéticamente los engramas apetitivos y aversivos, cómo esas experiencias pueden causar un cambio en la regulación positiva y negativa de genes discretos, y cómo estas experiencias pueden tener efectos duraderos en el genoma epigenético a través del estudio de metilación (fig. 4). Los estudios futuros, por ejemplo, pueden basarse en trabajos recientes que evalúan la conectividad molecular y definida por proyección entre vCA1 y sus objetivos posteriores con MAPSeq1, al tiempo que agregan un componente dependiente de la actividad, como nuestro enfoque de etiquetado de memoria dual, para medir los principios de organización del hipocampo ventral y sus proyecciones de una manera que tiene en cuenta la historia de una célula. Este estudio en particular proporciona una plataforma influyente para caracterizar la organización del hipocampo ventral y sus patrones de entrada-salida no aleatorios, y postulamos que esta lógica incluye una dimensión definida dependiente de la actividad tal que las experiencias apetitivas y aversivas involucran entradas-salidas únicas del hipocampo. circuitos también.

Finalmente, si bien la base fisiológica por la cual las terminales pueden cambiar o restablecer su capacidad para impulsar comportamientos específicos de valencia sigue sin estar clara, los estudios futuros pueden considerar mecanismos candidatos que incluyen plasticidad homeostática, crecimiento y retracción dendríticas, y cambios facilitados por contracondicionamiento a lo largo del axón. interfase dendrítica entre vCA1 y BLA o NAc24,37. De acuerdo con esta especulación, estudios previos han demostrado que el hipocampo dorsal contiene conjuntos definidos de cuerpos celulares funcionalmente plásticos suficientes para impulsar un comportamiento aversivo o apetitivo, mientras que el BLA contiene poblaciones fijas que son suficientes para impulsar cada comportamiento dependiendo de la ubicación anatómica estimulada a lo largo de el eje anteroposterior, así como en sus sitios específicos de proyección7,8,24,25,37. La investigación posterior puede tener como objetivo utilizar nuestro enfoque de etiquetado de memoria dual para mapear genética y fisiológicamente qué tipos de células y circuitos también muestran respuestas tan programadas o dependientes de la experiencia a los recuerdos emocionales. En nuestro estudio, especulamos que las células vCA1 se vuelven apetitivas o aversivas de una manera dependiente de la experiencia en lugar de estar programadas para cualquiera de las valencias per se, como se ha observado en muchas otras regiones del cerebro (por ejemplo, BLA24). Sin embargo, sigue siendo posible que un subconjunto de estas células vCA1 esté preferentemente sintonizado para procesar una valencia determinada de manera independiente de la experiencia. De hecho, la noción de que la experiencia misma modifica estas neuronas para volverlas apetitivas o aversivas no excluye la posibilidad de que experiencias posteriores modifiquen su capacidad de manera flexible para impulsar un comportamiento dado asociado con una valencia dada.

Además, en nuestro estudio, mientras que los criterios de valencia se cumplieron en la Fig. 1 (por ejemplo, las células del hipocampo respondieron de manera diferente a los estímulos de valencia positiva y negativa de una manera independiente de las características del estímulo), nuestros conjuntos de datos posteriores se concentraron en un solo apetito ( ej., interacciones sociales entre hombres y mujeres) y una única experiencia aversiva (p. ej., golpes en los pies) para obtener perfiles moleculares, anatómicos y conductuales exhaustivos. Es importante destacar que aquí destacamos que para hacer una afirmación directa sobre la valencia, la estructura de la tarea debe mantenerse constante. Por ejemplo, una interpretación alternativa de nuestros datos actuales es que nuestras diferencias observadas en los perfiles de enriquecimiento de genes y la segregación anatómica se deben a las diferencias inherentes en las tareas utilizadas (p. ej., interacciones sociales entre hombres y mujeres frente al condicionamiento contextual del miedo), y no a la valencia per se. . Sigue siendo posible, por lo tanto, que las interacciones sociales entre hombres y mujeres, que requieren una integración multimodal de señales sociales y contextuales, recluten un conjunto único de genes y una anatomía del hipocampo ventral en comparación con el condicionamiento del miedo contextual, en el que se utiliza una señal condicionada (p. ej., contexto). asociado con una señal no condicionada (por ejemplo, shock), y por lo tanto recluta actividad molecular y anatómica específica de la tarea. Como tal, proponemos que los estudios futuros se centren en etiquetar experiencias en las que la mayoría, si no todas, las características ambientales se mantienen constantes, excepto la valencia asociada con un estímulo unimodal en sí mismo, lo que creemos abre una plataforma experimental para estudiar cómo múltiples experiencias de valencias similares o variables involucran diferencialmente a las poblaciones celulares. Si bien creemos que esto se explica parcialmente mediante la utilización de múltiples experiencias de valencia similar en la Fig. 1, los experimentos futuros adicionales pueden implementar un enfoque de registro in vivo en el que se obtienen imágenes de células etiquetadas negativas y positivas putativas mientras que la estructura de la tarea y la valencia varían paramétricamente. . A partir de esta noción, nuestros datos de metilación de ADN y ARN-Seq proporcionan un medio adicional por el cual los recuerdos alteran las funciones del genoma de una manera dependiente de la valencia, tanto en estados saludables como patológicos. Por ejemplo, nuestros datos de metilación identificaron Pin148,49 entre 266 DMG en las células apetitivas vCA1, que es conocido por sus cualidades neuroprotectoras específicamente en la neurodegeneración a través de la regulación en la propagación de cis p-tau. Los estudios de seguimiento pueden aprovechar estos engramas apetitivos al alterar estos DMG como un medio para aliviar enfermedades psiquiátricas y neurodegenerativas.

Juntos, proponemos que, además de procesar unidades espacio-temporales de información, el hipocampo contiene conjuntos discretos de células que procesan información aversiva y apetitiva que transmiten información específica del contenido y conductualmente relevante a las áreas posteriores en un contexto definido molecularmente y específico de la proyección. manera, proporcionando así colectivamente un sustrato biológico multisináptico para múltiples engramas de memoria.

FosCreER (existencias de Jax: n.º 021882) y ratones C57BL/6 macho Wildtype (2-3 meses de edad; Charles River Labs) se alojaron en grupos de 5 ratones por jaula. El vivero de animales se mantuvo en un ciclo de luz de 12:12 horas (luces encendidas a las 07:00). Los ratones recibieron una dieta que contenía 40 mg/kg de doxiciclina (Dox) durante un mínimo de 48 horas antes de la cirugía con acceso a alimentos (dieta de doxiciclina) y agua ad libitum. A los ratones se les dio un mínimo de diez días después de la cirugía para recuperarse. La dieta que contenía Dox se reemplazó con alimento para ratones estándar (ad libitum) 48 horas antes del etiquetado conductual para abrir una ventana de tiempo de etiquetado dependiente de la actividad1,2. Todos los sujetos fueron tratados de acuerdo con el protocolo 17-008 aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Boston. Todos los experimentos cumplieron con todas las reglamentaciones éticas pertinentes para la experimentación con animales y la investigación según lo dictan los estándares de AALAC e IACUC.

Las inyecciones estereotáxicas y los implantes de fibra óptica siguen métodos previamente informados1,2. Todas las cirugías se realizaron bajo guía estereotáxica y las coordenadas posteriores se dan en relación con el bregma (en mm). Las inyecciones dorsales y ventrales se calcularon y se pusieron a cero en relación con el cráneo. Los ratones se colocaron en un marco estereotáxico (Kopf Instruments, Tujunga, CA, EE. UU.) y se anestesiaron con isoflurano al 3 % durante la inducción y se redujeron al 1-2 % para mantener la anestesia (oxígeno L/min) durante la cirugía. Se aplicó pomada oftálmica en ambos ojos para evitar la desecación de la córnea. El vello se eliminó con una crema depilatoria y el sitio quirúrgico se limpió tres veces con etanol y betadina. Después de esto, se hizo una incisión para exponer el cráneo. Las craneotomías bilaterales implicaron la perforación de ventanas a través del cráneo por encima de los sitios de inyección con una broca de 0,5 mm de diámetro. Las coordenadas fueron -3,16 anteroposterior (AP), ± 3,1 mediolateral (ML) y -4,6 dorsoventral (DV) para vCA1; −1,8 AP, ± 3,1 ML y −4,7 DV para el BLA; −1,25 AP, ± 1,0 ML y −4,7 DV para el NAc; 1,70 AP, ± 0,35 ML y −2,8 DV para el PFC. A todos los ratones se les inyectó un volumen de 300 nl de cóctel por sitio a una tasa de control de 100 μl min−1 usando una aguja biselada de calibre 33 llena de aceite mineral unida a una microjeringa Hamilton de 10 μl (701LT; Hamilton) en una microjeringa bomba (UMP3; WPI). La aguja permaneció en el sitio objetivo durante cinco minutos después de la inyección antes de retirarla. Para todos los objetivos, se colocaron fibras ópticas bilaterales 0,5 DV por encima del sitio de inyección. Los tornillos de joyería asegurados al cráneo actuaron como anclas. Se extendieron capas de cemento adhesivo (C&B Metabond) seguidas de cemento dental (AM Systems) sobre el sitio quirúrgico. Los ratones recibieron 0,1 ml de 0,3 mg/ml de buprenorfina (por vía intraperitoneal) después de la cirugía y se colocaron sobre una almohadilla térmica durante la cirugía y la recuperación. La evaluación histológica verificó la orientación viral y las ubicaciones de fibra. Los datos de las inyecciones fuera del objetivo no se incluyeron en los análisis.

pAAV9-cFos-tTA, pAAV9-TRE-eYFP y pAAV9-TRE-mCherry se construyeron como se describió anteriormente (Ramirez et al., 2015). AAV9-c-Fos-tTA se combinó con AAV9-TRE-eYFP o AAV9-TRE-ChR2-EYFP (núcleo UMass Vector) antes de la inyección en una proporción de 1:1. Este cóctel se combinó además en una proporción de 1:1 AAV9-CAG-Flex-DIO-TdTomato (UNC Vector Core).

Los implantes de fibra óptica se conectaron a un latiguillo conectado a un diodo láser de 450 nm controlado por un software automatizado (Doric Lenses). La salida del láser se probó al comienzo de cada experimento para garantizar que se entregaran al menos 15 mW de potencia al final del cable de conexión (lentes dóricas).

Cuando los animales estaban fuera de Dox, como se informó anteriormente9,10,11,12, la dieta Dox se reemplazó con comida de laboratorio estándar (ad libitum) 48 h antes del etiquetado de comportamiento. Exposición de hembras: se colocó un ratón hembra (PD 30–40) en una jaula doméstica limpia con una parte superior transparente. Luego se colocó el ratón macho experimental en la cámara y se le permitió interactuar libremente durante 2 horas. Exposición al miedo: los ratones se colocaron en una cámara de acondicionamiento y recibieron cuatro descargas en los pies de 1,50 mA (2 s) durante una sesión de entrenamiento de 8 minutos. Después del etiquetado, se reintrodujo Dox en la dieta y los ratones macho se devolvieron a su jaula de origen con acceso a la dieta Dox. Para el marcado con 4-OHT, se diluyó 4-hidroxitamoxifeno (Sigma: H7904) en etanol al 100 % y se agitó durante 5 minutos. Una vez en solución, se añadió aceite de maíz y la solución se sonicó para lograr una dilución de 10 mg/kg de stock. Cuando la solución estuvo lista, se cargó 4-OHT en jeringas para inyección y cualquier solución sobrante se colocó en el -20C para ser utilizada en el futuro. El día del marcaje, se administraron IP 200 mg de solución madre de 10 mg/ml (2 mg de 4OHT) en ratones FoscreER 30 minutos después del comportamiento y se dejaron en reposo durante 72 horas. A los ratones se les inyectó solución salina o DMSO al menos dos veces antes del protocolo de marcado para aclimatar a los animales a la inyección y evitar el marcado fuera del objetivo.

Todos los ensayos de comportamiento se realizaron durante el ciclo de luz del día (07:00-19:00). Los ratones se manipularon durante 3 a 5 días, de 5 a 10 minutos por día, antes de todos los experimentos de comportamiento. La cámara de prueba consistía en una caja rectangular hecha a medida con un soporte de fibra óptica (38 × 23,5 × 42 cm). La burocracia dividió la cámara por la mitad, creando dos mitades. Los lados derecho e izquierdo para la estimulación se aleatorizaron. El día 1 se utilizó para evaluar los niveles de referencia, durante los cuales se le dio al ratón 10 minutos para explorar libremente la arena. Los animales se volvieron a analizar en los días de referencia si mostraban más de un 45-55 % de preferencia por cualquiera de los dos lados. Los animales se aclimataron a la cámara hasta que tuvieron una preferencia mínima de 45/55. Una vez que se alcanza la línea de base, el día siguiente a la primera etiqueta de engrama, los ratones recibieron estimulación de luz (pulsos de 15 ms a 20 Hz) al entrar en el lado designado de la cámara (contrabalanceado entre grupos) durante un período de prueba de 10 minutos. Una vez que el ratón entró en el lado estimulado, una señal TTL del software EthoVision a través de una caja USB-IO de Noldus activó un generador de estímulo (STG-4008, sistemas multicanal). 6 Una cámara de video (cámara de acción LCD Activeon CX) grabó cada sesión y un experimentador ciego a las condiciones del tratamiento anotó la cantidad de tiempo en cada lado. Los análisis estadísticos incluyeron ANOVA unidireccionales que compararon las puntuaciones de diferencia de grupo [tiempo (en segundos) en el lado estimulado menos el tiempo en el lado no estimulado], así como los cambios a lo largo de los días usando ANOVA unidireccional de medidas repetidas o coincidentes. Los diagramas de comportamiento se realizaron con BioRender.

Para la inducción del miedo optogenético, los sujetos se colocaron en una cámara de choque con estimulación de luz (20 Hz, 15 ms) durante 500 segundos. Se administraron descargas en los pies (1,5 mA, 2 s de duración) en los puntos de tiempo de 198 s, 278 s, 358 s y 438 s. Durante la inducción de recompensa optogenética, en una habitación diferente de la etiqueta de miedo inicial, el sujeto se colocó en una jaula limpia con un ratón hembra. Se aplicó estimulación con luz (20 Hz, 15 ms) al ratón macho durante 10 minutos.

La inmunohistoquímica sigue protocolos previamente informados15,16,18. Los ratones recibieron una sobredosis de isoflurano al 3 % y se perfundieron transcardiacamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría (4 °C) seguida de paraformaldehído (PFA) al 4 % en PBS. Los cerebros se extrajeron y almacenaron durante la noche en PFA a 4 °C. Se recolectaron secciones coronales de cincuenta μm en orden serial utilizando un vibratomo y se recolectaron en PBS frío. Las secciones se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en PBST y suero normal de cabra (NGS) al 5% o suero de albúmina bovina (BSA) en un agitador. Las secciones se transfirieron a pocillos que contenían anticuerpos primarios (1:1000 guinea anti-c-Fos [SySy]; 1:1000 conejo anti-RFP [Rockland]; 1:5000 pollo anti-GFP [Invitrogen]) y se dejó incubar en un agitador durante la noche a temperatura ambiente o 3 días a 4 grados C. Luego, las secciones se lavaron en PBST durante 10 min (x3), seguido de 2 horas de incubación con anticuerpo secundario (1:200 Alexa 555 anti-rabbit [Invitrogen]; 1 :200 Alexa anti-guinea 647 [Invitrogen]; 1:200 Alexa 488 anti-pollo [Invitrogen]). Después de tres lavados adicionales de 10 min en PBST, las secciones se montaron en microportaobjetos (VWR International, LLC). Se aplicó Vectashield Hart Set Mounting Medium con DAPI (Vector Laboratories, Inc), se cubrieron los portaobjetos y se dejaron secar durante la noche.

Solo se seleccionaron para la cuantificación los animales que tenían inyecciones bilaterales precisas. Las imágenes fluorescentes se adquirieron usando un microscopio confocal (Zeiss LSM800, Alemania) en el objetivo 20X. Para la cuantificación de cfos, todos los animales se sacrificaron 90 minutos después del comportamiento para análisis inmunohistoquímicos. Se contó el número de neuronas inmunorreactivas EYFP, TdTomato y c-Fos en el vCA1 para medir el número de células activas en el área respectiva. 3– 5 cortes coronales (espaciados 50 um entre sí) por ratón de los cuales se tomaron las medias; cada valor de N contiene 3-5 cuantificación de imágenes para 3-5 ratones. El número de células positivas para eYFP, positivas para TdTomato, positivas para c-Fos y positivas para DAPI en una región de interés (ROI) determinada se cuantificó manualmente en dos experimentadores diferentes con ImageJ (https://imagej.nih. gov/ij/). El tamaño del ROI se estandarizó entre cerebros, animales, experimentos y grupos. Los dos contadores estaban ciegos a los grupos experimental y de control. Para calcular el porcentaje de células etiquetadas, contamos el número de células fluorescentemente positivas y las dividimos por el número total de células DAPI. Las superposiciones también se contaron como un porcentaje sobre DAPI, por ejemplo, las células que fueron positivas tanto para EYFP como para TdTomato se contaron sobre DAPI. Los diagramas de Venn son gráficos representativos de la proporción de células EYFP+, TdTomato+ y cfos+ normalizadas al 100 %, no a DAPI.

Las secciones coronales de 50 micrómetros se tiñeron con pollo anti GFP (1:1000) y conejo anti RFP (1:1000) como se describe anteriormente. Las imágenes fluorescentes se tomaron con un aumento de 20X utilizando un microscopio confocal (Zeiss LSM800, Alemania). Todos los ajustes de imagen y láser se mantuvieron constantes en todos los animales y en todas las regiones del cerebro de las que se tomaron imágenes. Las regiones de interés (ROI) se mantuvieron constantes en todas las imágenes, secciones y animales. Los ROI se identificaron utilizando puntos de referencia y haciendo referencia al Atlas del cerebro del ratón Paxinos & Franklin. La cuantificación de la fluorescencia se realizó en ImageJ. Después de la selección manual del ROI con la herramienta de selecciones, nos preparamos para recopilar información sobre la densidad integrada del área y el valor medio de gris. Las imágenes se analizaron para EYFP y TdTomato por separado. Dentro de cada imagen, recopilamos información sobre la fluorescencia promedio de los terminales, así como los niveles de fondo/línea de base de una región negativa para tener un medio de normalización. A partir de aquí usamos la siguiente fórmula para Corregido

Fluorescencia Total (CTF)50,51,52

Esto nos dio las unidades arbitrarias para la intensidad de fluorescencia promedio de nuestros terminales de interés EYFP vs TdTomato.

Los archivos de imagen adquiridos (.czi) se abrieron en ImageJ. El procesamiento de imágenes en la Fig. 1 implicó maximizar la intensidad, eliminar el ruido atípico y ajustar el contraste de las imágenes.

Ratones macho de cinco semanas de edad marcados con ChR2-YFP transgene1 después del acondicionamiento fueron sacrificados con isoflurano. Los cerebros de los ratones se extrajeron rápidamente y las regiones del hipocampo se aislaron mediante microdisección. Se agruparon ocho ratones por cada condición experimental. La suspensión de células individuales se preparó de acuerdo con las directrices del Adult Brain Disociation Kit (Miltenyi Botec, Cat No: 13-107-677). Brevemente, las muestras de hipocampo se incubaron con enzimas de digestión en el tubo C colocado en el disociador con calentadores GentleMACS Octo con el programa gentleMACS: 37C_ABDK_01. Después de la finalización del programa, las muestras se aplicaron a través de un MACS SmartStrainer (70 μm). Luego se aplicaron un paso de eliminación de desechos y un paso de eliminación de glóbulos rojos para obtener una suspensión de células individuales.

La suspensión de células individuales se sometió a un clasificador de células BD FACSAria de acuerdo con el protocolo del fabricante para aislar la población de células individuales EYFP.

El ARN de las células positivas para YFP aisladas por FACS se extrajo usando Trizol (Life Technologies) seguido del kit Direct-zol (Zymo Research) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, la biblioteca de RNA-seq se preparó con el kit de RNA de entrada baja SMART-Seq® v4 Ultra® (TaKaRa).

Las lecturas resultantes de Illumina tuvieron buena calidad al verificar con FastQC53. Los primeros 40 pb de las lecturas se asignaron al genoma del ratón (mm10) utilizando STAR26, que se indexó con la anotación del gen Ensembl GRCm38.91. Los conteos de lectura se obtuvieron usando la función featureCounts54 del paquete Subread con la opción no trenzada55. Las lecturas se normalizaron según el tamaño de la biblioteca y el análisis de expresión diferencial basado en la distribución binomial negativa se realizó con DESeq256. Los genes con un valor de p ajustado por FDR inferior a 0,00001 más una diferencia de más de 4 veces se consideraron expresados ​​diferencialmente. Los datos sin procesar junto con los niveles de expresión génica se depositan en NCBI Gene Expression Omnibusas GSE198731. Para el análisis de Gene Ontology, clasificamos los genes que codifican proteínas por sus cambios de pliegue y los usamos como entrada para la herramienta GseaPreranked57. Según los resultados de GSEA, los diagramas de puntos se crearon con un script R personalizado. Se consideró que las vías con un valor de p ajustado por FDR inferior a 0,25 estaban enriquecidas. La red GeneMANIA fue analizada por GeneMANIA33. Los genes resultantes máximos fueron 20 y los atributos resultantes máximos fueron 10. A todas las redes se les asignó el mismo peso. Los diagramas de red fueron generados por Cytoscape58.

El ADN genómico de las células positivas para YFP aisladas por FACS se extrajo utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, el ADN genómico se digirió con la enzima MspI (NEB) y se seleccionó el tamaño con el kit de selección de tamaño de ADN EpiNext™ (EpigenTek) para enriquecer el fragmento de ADN entre 100 y 600 pb. Los fragmentos de ADN seleccionados se usaron para preparar la biblioteca de secuenciación con el kit EpiNext™ High-Sensitivity Bisulfite-Seq (EpigenTek) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las lecturas sin procesar se recortaron con cutadapt59 y luego se asignaron al genoma del ratón (mm10) con el módulo Bismark60 Mcomp de MOABS61 para llamar a las citosinas (DMC) y regiones (DMR) metiladas de manera diferente. Solo se usaron citosinas cubiertas con al menos cinco lecturas para análisis posteriores. Las diferencias en los niveles de metilación del ADN superiores a 0,2 y el valor P de la prueba exacta de Fisher inferior a 0,05 se consideraron DMC. Los datos sin procesar se depositan en NCBI Gene Expression Omnibus como GSE208137. Las regiones metiladas de forma diferente incluían al menos dos DMC, y la distancia máxima entre dos DMC era de 300 pb. El software Homer62 se utilizó para la anotación de DMC y DMR. El análisis GO se realizó mediante el paquete R clusterProfiler63.

A ratones macho FosCRE-ERT2 se les inyectó una proporción 1:1 de AAV-CAG-FLEX-TdTomato + AAV-cfos-tTA+AAv-TRE-EYFP en el hipocampo ventral. Los animales se equilibraron para el experimento en el que la mitad recibió marcado apetitivo con 4OHT y marcado aversivo con Dox y la otra mitad recibió marcado aversivo con 4OHT y marcado apetitivo con Dox. Se prepararon cortes coronales del hipocampo ventral a partir de animales previamente inyectados, 3-5 días después de la experiencia de marcado. Los animales se anestesiaron profundamente con anestesia de isoflurano, se decapitaron y se extrajeron los cerebros. Se prepararon cortes de cerebro en líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) sustitutivo de sacarosa perfundido con oxígeno. La solución contenía: NaCl 185 mM, KCl 2,5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, MgCl2 mM, NaHCO3 25 mM, glucosa 12,5 mM y CaCl2 0,5 mM. Se cortaron rodajas de 400 µm mediante Leica VT 1200 (Leica Microsystems) y se incubaron en ACSF a 30 °C que constaba de NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, D-glucosa 25 mM, KCl 2 mM, CaCl2 2 mM, NaH2PO4 1,25 mM y 1 MgCl2 mM, durante 20 minutos y luego enfriado a temperatura ambiente. Se usó un sistema de imágenes de dos fotones (Thorlabs Inc.) para distinguir las células apetitivas y aversivas. El sistema de imágenes está equipado con un láser Ti:Sapphire de modo bloqueado (Chameleon Ultra II; Coherent) que se configuró en longitudes de onda entre 920 nm y 950 nm para excitar los fluoróforos Alexa Fluor 488 y 568, tdTomato y EYFP usando un 20x, NA Lente objetivo 1.0 (Olympus). Para asegurar que las diferencias entre las dos poblaciones no sean atribuibles al tipo de virus utilizado para marcar las neuronas, se prepararon dos grupos de animales. En un grupo recuerdos apetitivos etiquetados con tdTomato y aversivos con EYFP y en el otro viceversa. Los electrodos de abrazadera de parche con puntas de 0,6 a 1 μm se extrajeron mediante un extractor horizontal (Sutter Instruments), y la resistencia de la pipeta se registró entre 4 y 6 MΩ. Las pipetas se llenaron con fluido intracelular que contenía: K-gluconato 120 mM, KCl 20 mM, HEPES 10 mM, diTrisPhCr 7 mM, Na2ATP 4 mM, MgCl2 2 mM, Tris-GTP 0,3 mM y EGTA 0,2 mM; tamponado a pH 7,3 con KOH. Se añadió 0,15 % en peso/volumen de hidrazida Alexa Fluor (Thermo Fisher Scientific) 488 (para el registro de células tdTomato) o 567 (para el registro de células EYFP) para visualizar la pipeta de registro bajo el sistema de imágenes. Antes de irrumpir en las células, se realizaron la neutralización de la capacitancia de la pipeta y la compensación del equilibrio del puente. Los datos se adquirieron utilizando Multiclamp 700B (Molecular Devices) y Digidata 1550 (Molecular Devices) con una frecuencia de muestreo de 10 kHz.

El análisis de datos de electrofisiología de cortes de cerebro se realizó en python con scripts personalizados usando el paquete pyABF (http://swharden.com/pyabf/). Para el análisis de la forma de los picos, los inicios de picos se identificaron utilizando su primera derivada, el voltaje correspondiente se denominó inicio de picos. Spike half-width indica el tiempo entre las dos mitades del pico de voltaje. Para el análisis dinámico de las propiedades de pico, se realizaron inyecciones de corriente paso a paso. El umbral de disparo es el voltaje al que una neurona dispara al menos un único pico, y el inicio de disparo es la corriente correspondiente. La ganancia de FI se calculó como el cambio en la frecuencia de disparo desde la frecuencia de disparo más baja a la más alta dividida por la corriente inyectada. La relación de adaptación se obtuvo dividiendo los intervalos entre picos (ISI) medios durante los últimos 200 ms de picos por los ISI medios durante los primeros 200 ms de picos. La comparación entre las células de memoria apetitivas y aversivas se realizó tanto dentro de un solo corte, dentro de un animal como entre animales para controlar las posibles diferencias entre animales o cortes. Dado que los resultados en las tres situaciones fueron similares, se utilizaron los datos agrupados para la comparación de diferentes grupos con la prueba K2 de d'Agostino-Pearson para determinar la normalidad de los datos. En base a los resultados de normalidad, se utilizó la prueba t independiente (distribución normal) o la prueba de Mann-Whitney-Wilcoxon bilateral con corrección de Bonferroni.

Los sujetos fueron asignados aleatoriamente a los grupos. No se utilizaron métodos estadísticos para determinar el tamaño de la muestra; el número de sujetos por grupo se basó en los estudios publicados anteriormente y se informa en las leyendas de las figuras.

Los experimentos de comportamiento se replicaron al menos tres veces con tres experimentadores diferentes. Los primeros experimentos se realizaron en una institución diferente y las dos últimas réplicas se realizaron en la Universidad de Boston. Los hallazgos de comportamiento no solo se mantuvieron entre los experimentadores (1 hombre, 2 mujeres), sino que también se mantuvieron entre las instituciones. Los datos de secuenciación también se replicaron dos veces para confirmar los hallazgos originales. Todos los contadores y anotadores de comportamiento y de células estaban cegados a los grupos experimentales y de control.

Para el comportamiento se realizaron experimentos sobre un tamaño de muestra que oscilaba entre 7 y 10; los animales que estaban mal seleccionados o tenían expresión unilateral del virus se eliminaron del experimento. Para el análisis histológico, los tamaños de muestra oscilaron entre 3 y 4 animales antes del grupo. Los datos de secuenciación de ARN o RRBS se realizaron con un grupo de muestra agrupado de 8 animales por grupo experimental. El tamaño de la muestra del control simulado o sin etiquetar fue de 2 ratones. Para los experimentos de electrofisiología, el tamaño de la muestra osciló entre 4 y 8 animales. Los datos se analizaron usando Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). Los datos se analizaron mediante pruebas t pareadas (dos factores), pruebas t no pareadas, ANOVA de una o dos vías con ANOVA de medidas repetidas (más de dos factores), según corresponda. Se usaron análisis post-hoc (prueba de comparaciones múltiples de Tukey) para caracterizar los efectos del tratamiento y la interacción, cuando el alfa estadísticamente significativo se estableció en p < 0,05, de dos colas). Los análisis estadísticos se informan en las leyendas de las figuras. Todos los gráficos con gráficos de barras mostrados representan el error estándar de la media (SEM).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de metilación y secuenciación de ARN están disponibles públicamente a través de la plataforma NIH, Gene Expression Omnibus (GEO), datos disponibles de RNA-seq: GSE198731 y datos de RRBS-seq: GSE208137 respectivamente. Los datos de comportamiento están disponibles a pedido de los autores principales. Los datos fuente subyacentes a las Figs. 1, 2, 3 y 6 se pueden encontrar en Datos complementarios 2. Los datos adicionales que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Agradecemos al Dr. Joshua Sanes y a su laboratorio en el Centro de Ciencias del Cerebro de la Universidad de Harvard por proporcionar el espacio de laboratorio en el que se realizaron los experimentos iniciales, especialmente a los primeros miembros del laboratorio, Emily Merfeld, Emily Doucette, Stephanie Grella y Joseph. Zaki. Además, agradecemos al núcleo del Center for Brain Science Neuroengineering por brindar apoyo técnico y a la Society of Fellows de la Universidad de Harvard por su apoyo. Este trabajo fue apoyado por un premio NIH Early Independence (DP5 OD023106-01), un premio NIH Transformative R01, una subvención para jóvenes investigadores de la Brain and Behavior Research Foundation, una subvención de la Ludwig Family Foundation, el premio McKnight Foundation Memory and Cognitive Disorders, el Centro de Neurociencia de Sistemas y Centro de Neurofotónica de la Universidad de Boston, y un Paquete de Inicio de la Universidad de Columbia (UR011118).

Programa de Posgrado en Neurociencia, Universidad de Boston, Boston, 02215, MA, EE. UU.

Monika Shpokayte

Departamento de Ciencias Psicológicas y del Cerebro, Centro de Neurociencia de Sistemas, Universidad de Boston, Boston, 02215, MA, EE. UU.

Monika Shpokayte, Evan Ruesch y Steve Ramírez

Programa de posgrado en neurociencia, Universidad de Brown, Providence, 02912, RI, EE. UU.

Olivia McKissick

Departamento de Fisiología y Biofísica Celular, Centro Médico de la Universidad de Columbia, Nueva York, 10032, NY, EE. UU.

Xiaonan Guan y X. Shawn Liu

Instituto Whitehead de Investigación Biomédica, MIT, Cambridge, 02142, MA, EE. UU.

Bingbing Yuan

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Boston, Boston, 02215, MA, EE. UU.

Bahar Rahsepar, Fernando R. Fernández, John A. White y Steve Ramírez

Centro de Neurofotónica y Centro de Fotónica, Universidad de Boston, Boston, 02215, MA, EE. UU.

Bahar Rahsepar, Fernando R. Fernández y John A. White

Universidad de Loyola, Departamento de Psicología de Chicago, Chicago, IL, 60660, EE. UU.

Stephanie L. Grella

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MS y OM realizaron y analizaron histología. MS, OM y ER realizaron y analizaron experimentos optogenéticos. BY, XG y XSL realizaron la secuenciación de bisulfito de representación reducida y RNA-seq y los análisis correspondientes. BR, FRF, JAW realizaron experimentos y análisis fisiológicos in vitro. MS, OM, XSL y SR diseñaron el proyecto. MSXSL y SR escribieron el manuscrito. SLG realizó análisis estadísticos. Todos los autores editaron y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a X. Shawn Liu o Steve Ramirez.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Editor principal de manejo: George Inglis. Este manuscrito ha sido revisado previamente en otra revista de Nature Portfolio. El manuscrito se consideró adecuado para su publicación sin revisión adicional en Communications Biology.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Shpokayte, M., McKissick, O., Guan, X. et al. Las células del hipocampo segregan engramas positivos y negativos. Commun Biol 5, 1009 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03906-8

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Recibido: 21 junio 2022

Aceptado: 26 de agosto de 2022

Publicado: 26 septiembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03906-8

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