Bioimpresión 3D usando una nueva foto

npj Regenerative Medicine volumen 8, Número de artículo: 18 (2023) Citar este artículo

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La bioimpresión tridimensional (3D) es una técnica muy eficaz para fabricar construcciones cargadas de células en la ingeniería de tejidos. Sin embargo, la versatilidad de fabricar hidrogeles cargados de células precisos y complejos está limitada debido a la escasa capacidad de reticulación de los hidrogeles que contienen células. En este documento, proponemos un proceso de bioimpresión asistida por fibra óptica (OAB) para reticular de manera eficiente los hidrogeles metacrilados. Al seleccionar las condiciones de procesamiento adecuadas para la técnica de fotorreticulación, fabricamos estructuras cargadas de células biofuncionales que incluyen gelatina metacrilada (Gelma), colágeno y matriz extracelular descelularizada. Para aplicar el método a la regeneración del músculo esquelético, se procesaron construcciones Gelma cargadas de células con una boquilla funcional que tenía una señal topográfica y un proceso OAB que podría inducir una alineación uniaxial de C2C12 y células madre adiposas humanas (hASC). Se observaron grados significativamente más altos de alineación celular y actividades miogénicas en la estructura Gelma cargada de células en comparación con las de la construcción celular que se imprimió utilizando un método de entrecruzamiento convencional. Además, se observó un potencial regenerativo in vivo en defectos musculares volumétricos en un modelo de ratón. La construcción cargada de hASC indujo significativamente una mayor regeneración muscular que la construcción celular sin señales topográficas. Sobre la base de los resultados, el proceso de bioimpresión recientemente diseñado puede resultar muy eficaz en la fabricación de construcciones cargadas de células biofuncionales para diversas aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Recientemente, se han fabricado andamios cargados de células que imitan estructuras tisulares complejas naturales utilizando una variedad de métodos ascendentes, como procesos de bioimpresión electrohidrodinámicos, microfluídicos, fotolitográficos o blandos y tridimensionales (3D)1,2,3, 4,5. Debido a la capacidad de producción eficiente demostrada por las técnicas multicapa, el proceso de bioimpresión 3D se ha adoptado ampliamente en aplicaciones de ingeniería de tejidos. En particular, se han explorado significativamente las aplicaciones versátiles de varios biotintas6,7,8,9.

Previamente, se han logrado muchos resultados prometedores en el desarrollo de músculo esquelético de ingeniería tisular con funcionalidades mejoradas sin bioimpresión10,11. Sin embargo, una desventaja notable de las construcciones de músculo esquelético de ingeniería tisular sin bioimpresión es la insuficiencia para fabricar geometrías específicas del paciente. Para superar este problema, se deben considerar varios parámetros que incluyen la temperatura de impresión, la presión neumática, la velocidad de impresión y el proceso de entrecruzamiento para fabricar construcciones de células 3D con actividades biológicas apropiadas, como alta viabilidad/proliferación celular y diferenciación/maduración fenotípica de las células impresas. .

Sin embargo, los procesos de extrusión basados en boquillas muestran varias deficiencias, como una resolución limitada del tamaño de los puntales, una densidad celular restringida de los puntales cargados con celdas y una capacidad de impresión baja, que resultó de la débil naturaleza mecánica de los hidrogeles de carga de celdas. Se han introducido varios bioenlaces avanzados conjugados con iones para obtener construcciones celulares; sin embargo, la fabricación de estructuras cargadas de células mecánicamente estables utilizando la tecnología de impresión 3D sigue siendo un desafío para superar en la técnica de impresión y el proceso de formación de biotintas8,12,13.

Recientemente, para superar las deficiencias de los struts cargados de células obtenidos mediante un proceso de impresión 3D, se han propuesto varias estrategias de reticulación, incluidos los procesos de fotorreticulación in situ combinados con la impresión8,14,15. Por ejemplo, la fabricación de filamentos cargados de células a microescala mecánicamente estables requiere procesos de impresión para emplear un sistema de boquilla de núcleo/carcasa, en el que la biotinta de alginato en la región de la carcasa se reticula inmediatamente con una solución de cloruro de calcio que protege la gelatina metacrilada cargada de células fotorreticulada. (Gelma) en el núcleo16,17. Además, estudios similares han fabricado fibras de núcleo (Gelma)/cubierta (alginato de sodio) cargadas de células utilizando un canal de microfluidos en el que se diseña Gelma cargado de células endoteliales en el núcleo18. Además, se ha introducido un método de reticulación in situ que utiliza una boquilla coaxial capilar transparente conectada a una impresora 3D para obtener estructuras impresas estables (rejillas a microescala y tubos huecos) sin depender de la viscosidad de la biotinta8.

Los procesos de impresión propuestos han demostrado claramente resultados avanzados en la obtención de estructuras microfibrosas 3D cargadas de células que imitan las morfologías y biofunciones intrínsecas de los tejidos fibrosos reales; sin embargo, los métodos emplean biotinta limitada (es decir, el uso de alginato reticulable rápido en iones de calcio) para soportar materiales bioactivos cargados en células. Además, para los sistemas fotorreticulados in situ, no se puede obtener fácilmente una estructura 3D multicapa realista debido a la región de la cubierta apenas fotorreticulada de los hidrogeles cargados de células metacriladas que fluyen, y se requiere una boquilla específicamente transparente e hidrofóbica.

Para abordar estos desafíos a los que se enfrentaban los sistemas de impresión anteriores, presentamos una nueva estrategia de fotorreticulación combinada con un proceso de impresión para fabricar estructuras mecánicamente estables y estructuras cargadas de células multicapa realistas. Con ese fin, utilizamos una fibra óptica incrustada dentro de una boquilla de impresión general para fotorreticular de manera estable hidrogeles metacrilados que fluyen (gelatina metacrilada, colágeno y matriz extracelular descelularizada (dECM)). Utilizando este exclusivo sistema de reticulación, se fabricaron eficazmente puntales cargados de células mecánicamente estables y biológicamente seguros y una estructura cargada de células en 3D de varias capas construida con una fuerza adhesiva razonable entre los filamentos cargados de células. Para aplicar la versatilidad del proceso de fotorreticulación, se fabricaron puntales cargados de células con micropatrones de superficie, utilizando C2C12 y células madre adiposas humanas (hASC) procesadas con una boquilla de plástico ranurada en la superficie, para la regeneración del tejido muscular. Las construcciones celulares con un patrón de superficie ranurada uniaxialmente demostraron una diferenciación miogénica mejorada debido a la alineación celular lograda por la combinación de la superficie ranurada en la boquilla y el proceso de reticulación asistido por fibra óptica in situ. Además, las construcciones de hASC bioimpresas se aplicaron en una lesión de defecto muscular volumétrico en ratones y demostraron una regeneración muscular significativamente mejorada en comparación con las fabricadas mediante un proceso de bioimpresión convencional.

En general, los biotintas fotoreticulables, como los hidrogeles metacrilados a base de gelatina, colágeno, ácido hialurónico y matriz extracelular descelularizada, se han utilizado ampliamente en la fabricación de construcciones cargadas de células debido a sus excelentes capacidades de encapsulación celular y propiedades mecánicas controlables que pueden lograrse de manera efectiva utilizando varios procesos de fotorreticulación9,19,20,21,22. Cuando se combinan biotintas fotoentrecruzables con un proceso de bioimpresión general, se pueden fabricar con éxito construcciones cargadas de células de varias capas con geometrías de poros personalizables. Sin embargo, la formación precisa y estable de construcciones celulares fabricadas mediante bioimpresión complementada con un proceso de fotoentrecruzamiento depende de manera crítica del enfoque de entrecruzamiento empleado. De las diversas estrategias de entrecruzamiento que se combinan con la bioimpresión, la estrategia más innovadora es el "método de fotoentrecruzamiento in situ" ejecutado con una boquilla de silicona hidrofóbica transparente, que puede reducir la tensión de corte de una biotinta fotoentrecruzada fluida8. Cuando la biotinta pasa a través de la boquilla, la luz ultravioleta puede exponerse directamente a la boquilla transparente para reticular la biotinta fotorreticulable y de baja viscosidad que fluye. Este método tiene una importancia inmensa porque reticula de manera efectiva y estable biotintas de baja viscosidad para lograr puntales cargados de células mecánicamente estables. Sin embargo, el proceso de fotorreticulación in situ requiere una boquilla fotopermeable transparente e hidrofóbica especialmente diseñada. Además, debido a que la superficie de los puntales cargados de células se puede entrecruzar de forma más activa que la región central de los puntales impresos, la propiedad adhesiva entre los puntales puede ser relativamente pobre después de fabricar estructuras de celdas 3D, lo que resulta en una capacidad de forma estructural 3D baja. .

Para superar las deficiencias del entrecruzamiento in situ de biotintas fotoentrecruzables, desarrollamos un nuevo método de entrecruzamiento usando un proceso de bioimpresión 3D asistido por fibra óptica (OAB) que era completamente diferente a la bioimpresión convencional (CB) usando un proceso de entrecruzamiento in situ ( Figura 1a-c). Para evaluar el rendimiento del proceso OAB, seleccionamos una biotinta basada en Gelma fotoentrecruzable cargada con mioblastos C2C12 con una densidad de 1 × 107 células/mL. Esto se debe a que Gelma se puede considerar un biotinte fotorreticulable típico con propiedades biocompatibles y biodegradables, y se puede aplicar ampliamente en andamios de ingeniería de tejidos, sistemas de administración de fármacos y sustratos de cicatrización de regiones de heridas23,24,25. Para reticular de manera eficiente la biotinta, se incrustó una fibra óptica en una boquilla de impresión general y, al controlar la intensidad de una fuente de luz UV (cabeza de punto UV, que se muestra en la Fig. 1d), pudimos obtener un 3D mecánicamente estable y biológicamente seguro. construcción cargada de células, como se presenta en las imágenes ópticas y vivas (verde) / muertas (rojas) en la Fig. 1a y la imagen óptica de la estructura de malla Gelma impresa (Fig. 1c). La figura 1a, c presenta una imagen óptica de la luz ultravioleta observada a través de la fibra óptica insertada dentro de la boquilla. Además, para evitar que la fibra óptica aumentara la temperatura de la biotinta, se colocó una camisa de agua refrigerante (4 °C) alrededor de la boquilla de impresión (Fig. 1c, d). En comparación con la reticulación posterior convencional, el proceso OAB propuesto puede obtener estructuras 3D cargadas de células con morfologías intrínsecas, como lo demuestran los valores de circularidad mejorados (Fig. 1 complementaria). Además, el método OAB puede fabricar una estructura 3D multicapa realista en contraste con CB, debido a una mejor adhesión entre puntales.

un esquema de un proceso de bioimpresión asistido por óptica (OAB) que utiliza una fibra óptica colocada dentro de una boquilla de una impresora e imágenes ópticas y vivas (verde)/muertas (rojas) del puntal Gelma cargado de C2C12 impreso. b Esquemas de un hidrogel fotorreticulado dentro de una boquilla procesada con el proceso OAB y CB. c, d Sistema OAB conectado con una camisa de refrigeración por agua, una imagen de la boquilla de impresión transversal y una imagen óptica de una estructura Gelma cargada de celdas de malla impresa.

Para observar el efecto del proceso OAB sobre la capacidad de fotorreticulación de la biotinta Gelma, se utilizó Gelma al 5 % en peso. La Figura 2a ilustra el módulo de almacenamiento (G′) de la biotinta Gelma en el modo de barrido de tiempo antes y después de la exposición a los rayos UV (dosis de UV = 120 mJ/cm2 durante 10 s). Como era de esperar, la rigidez de Gelma expuesta a la luz ultravioleta mejoró significativamente después de la exposición a la luz ultravioleta.

a Módulo de almacenamiento (G′) de Gelma al 5 % en peso obtenido de pruebas de barrido de tiempo realizadas antes y después de la exposición UV (dosis UV = 120 mJ/cm2 durante 10 s). b Cambio de color en la mezcla de 5% en peso de Gelma y rojo fenol a varias dosis de UV. c Imágenes ópticas transversales de los puntales impresos de Gelma/fenol-rojo fabricados con procesos convencionales de bioimpresión (CB) y OAB, la distribución del valor de gris utilizando las imágenes transversales para el radio y la diferencia del valor de gris en el centro y regiones de borde. d Imágenes ópticas de estructuras de malla Gelma impresas después de la impresión in situ, durante la agitación y después de la agitación para ilustrar la estabilidad estructural. e Prueba de corte de las estructuras de malla impresa procesadas con CB y OAB para observar las propiedades adhesivas entre los puntales. f Curvas tensión-deformación por tracción y módulo de Young de las estructuras de Gelma impresas. Todos los datos se presentan como media ± SD. Los valores de p se calcularon mediante la prueba t de Student (n = 3/grupo; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Barra de escala, 200 µm (c); 1 mm (d).

Para observar el efecto de la foto-reticulación producida por la fibra óptica colocada en el interior de la boquilla sobre la distribución de la reticulación sobre el área de la sección transversal de un puntal Gelma, medimos la distribución de la intensidad de color rojo del rojo fenol, que difería según el grado de fotorreticulación. La Figura 2b muestra las diversas intensidades de color rojo para la mezcla de 5% en peso de Gelma/rojo fenol (150 mg/L) a diferentes dosis de UV (0, 60 y 120 mJ/cm2), lo que indica que el color rojo se desvaneció. en blanco con una dosis creciente de UV. La figura 2c ilustra dos imágenes transversales de puntales Gelma que se entrecruzaron mediante los procesos CB y OAB, respectivamente. En los procesos de impresión/reticulación, el tamaño de la boquilla de impresión, la velocidad de la boquilla, la presión neumática y la dosis de UV fueron 700 μm, 1 mm/s, 120 ± 10 kPa y 120 mJ/cm2, respectivamente.

La distribución del color rojo para los puntales de gelatina fotorreticulados fabricados con los métodos CB y OAB se ilustra en la Fig. 2c. Como se indica en los resultados, la distribución transversal del color gris que ilustra el grado de fotoentrecruzamiento fue diferente para cada método. Para el proceso CB, la distribución relativa del color gris en la región de la sección transversal del puntal Gelma fue similar en el radio, mientras que para el puntal Gelma procesado con OAB, la fotorreticulación fue relativamente mayor en la región del núcleo que en la cubierta. región (el gráfico de la diferencia de valor gris en la Fig. 2c). A partir de estos resultados, podemos esperar que el grado relativamente bajo de reticulación en la región de la cubierta del puntal pueda afectar la formación estructural 3D de los filamentos impresos multicapa. La figura 2d ilustra estructuras de malla impresas fabricadas con los procesos CB y OAB (5% en peso de Gelma, dosis de UV = 120 mJ/cm2, tamaño de la boquilla = 700 μm, velocidad de movimiento de la boquilla = 2 mm/s y presión neumática = 120 ± 10 kPa ). Después de fabricar las estructuras de Gelma, se sacudieron las estructuras impresas. Como se muestra en las imágenes ópticas, la estructura de malla 3D se destruyó en los puntales Gelma fabricados con el proceso CB, mientras que la estructura de malla Gelma fabricada con el proceso OAB se mantuvo estable en su forma original diseñada. Este resultado indica que los puntales de gelatina impresos mediante el proceso OAB se adhirieron bien entre sí para mantener la forma estructural 3D.

Para evaluar la fuerza adhesiva entre los puntales Gelma, medimos el desplazamiento frente a la carga para la prueba de corte (Fig. 2e). En consecuencia, la energía adhesiva entre los puntales Gelma y la carga máxima de la fuerza interfacial entre los puntales Gelma fabricados con el proceso OAB fueron significativamente más altos que los de los puntales Gelma procesados con el proceso CB. Esto indicó que las formaciones estructurales 3D que consisten en puntales multicapa impresos con el proceso OAB se pueden obtener de manera mucho más eficiente que las impresas con el proceso CB. Sin embargo, para las curvas de tensión-deformación por tracción, la estructura procesada con CB mostró un módulo de Young significativamente más alto que la estructura impresa con OAB (Fig. 2f). Creemos que la diferencia en el módulo de tracción podría deberse a los diferentes grados de homogeneidad de reticulación dentro de los puntales, como se muestra en la Fig. 2c. Para los puntales de Gelma reticulados con el proceso OAB, la tensión de tracción aplicada externamente podría estar muy concentrada en la región de reticulación relativamente baja de los puntales, induciendo una menor resistencia de la fuerza de tracción en comparación con la de los puntales de Gelma homogéneamente reticulados procesados con CB.

Para determinar el rango apropiado de parámetros de impresión (dosis UV y temperatura de procesamiento) bajo una fracción de peso de Gelma fija (5% en peso) y condiciones de impresión (tamaño de boquilla = 700 μm, velocidad de movimiento de la boquilla = 1 mm/s y presión neumática = 120 ± 10 kPa), se realizó una prueba de una sola línea.

En primer lugar, medimos las propiedades reológicas de la biotinta Gelma al 5 % en peso durante barridos de temperatura y tiempo bajo varias dosis de UV (30, 90 y 150 mJ/cm2). Como era de esperar, la biotinta Gelma para el barrido de temperatura exhibió un comportamiento típico de transición sol-gel (Fig. 3a). Además, el aumento de la dosis de UV a una temperatura constante (10 °C) mejoró el grado de reticulación de la biotinta Gelma (Fig. 3b).

Propiedades reológicas de Gelma al 5% en peso obtenidas a través de (a) barrido de temperatura y (b) barrido de tiempo a varias dosis de UV. c Diagrama de proceso que ilustra el efecto de la temperatura de procesamiento y la dosis de UV en el grado de reticulación de los puntales de Gelma impresos (sin reticulación, reticulación insuficiente y reticulación estable). d Imágenes ópticas de la forma impresa de los struts de Gelma procesados a través de OAB a varias dosis de UV (0, 90 y 120 mJ/cm2) e imágenes ópticas de los struts impresos a los 7 días de cultivo. e Relaciones de expansión del troquel (diámetro del puntal impreso/diámetro de la boquilla) para varias dosis de UV. f Degradación de los struts de Gelma impresos determinada utilizando la diferencia de diámetro observada antes y después de 7 días de cultivo. Barra de escala, 1 mm (d—puntal); 500 µm (d—cultivado).

Para observar el efecto de la temperatura de la biotinta Gelma en el grado de fotorreticulación, seleccionamos tres temperaturas de procesamiento típicas: (1) región gel: 10 °C, (2) región de transición gel-sol: 20 °C y ( 3) región sol: 30 °C para varias dosis de UV (0–150 mJ/cm2). Para la temperatura de la región del sol (30 °C), no se obtuvo una fotorreticulación estable del puntal Gelma impreso independientemente de la dosis de UV aplicada (0–150 mJ/cm2), mientras que para los puntales Gelma impresos en el gel y gel-sol temperaturas de transición y con más de 60 mJ/cm2 de dosis de UV, se formaron de forma estable puntales Gelma reticulados (Fig. 3c). El grado de fotorreticulación para varias temperaturas sol-gel de la biotinta Gelma fue consistente con el informado en el estudio realizado por Chansoria et al.26. Según su investigación, el módulo de compresión de la biotinta Gelma dependía en gran medida no solo de la condición de exposición a los rayos UV, sino también de la temperatura de fotorreticulación; el módulo aumentó a temperaturas de reticulación más bajas (temperatura del gel, 10 °C) de Gelma. Este resultado se obtuvo porque el fotoentrecruzamiento de la solución de Gelma a baja temperatura podría inducir un efecto sinérgico de redes polipeptídicas estrechamente entrelazadas a bajas temperaturas y su fotoentrecruzamiento por unión covalente26.

Además, para demostrar la estabilidad estructural después de la fotorreticulación/impresión, medimos la relación de expansión del troquel (D1/D0, donde D0 y D1 indican el diámetro de la boquilla interna y el diámetro del puntal en la punta de la boquilla, respectivamente) y el cambio en el área de la sección transversal de los puntales Gelma después de 7 días en la solución de PBS. La figura 3d y la figura complementaria 2a muestran imágenes ópticas del puntal Gelma impreso cerca de la boquilla de impresión a una temperatura de impresión fija (10 °C) y varias dosis de UV (0–120 mJ/cm2). Debido al bajo grado de entrecruzamiento de Gelma expuesto a dosis de UV de 0 y 30 mJ/cm2, la relación de hinchamiento fue significativamente mayor que la del Gelma impreso entrecruzado a dosis de UV más altas (90 y 150 mJ/cm2) (Fig. 3e) . Además, la circularidad del puntal extruido aumentó significativamente hasta 120 mJ/cm2; sin embargo, el aumento adicional de la dosis de UV no afectó la circularidad (Fig. 2b complementaria). Además, la velocidad del flujo (Fig. 2c, d complementaria) y la fibra óptica a la distancia de salida de la boquilla (Fig. 2e, f complementaria) se investigaron utilizando una dosis UV fija (120 mJ/cm2). Como resultado, la velocidad del flujo tuvo efectos insignificantes en la circularidad de los puntales extruidos, mientras que el aumento de la distancia entre la fibra óptica y la boquilla mejoró la circularidad. Se observó un resultado similar para el comportamiento de degradación (=[A0 − A1]/A0, donde A0 y A1 denotan las áreas transversales de los struts impresos in situ y el área del strut a los 7 días, respectivamente) de los struts Gelma (Figura 3f). Para dosis de UV por debajo de 90 mJ/cm2, la degradación del strut fue extremadamente rápida debido a grados de reticulación insuficientes. Basándonos en los resultados obtenidos utilizando la formación y las dimensiones de los puntales, pudimos seleccionar los ajustes apropiados para la dosis de UV (120 mJ/cm2).

Después de fijar la dosis de UV, investigamos varias temperaturas de la camisa de agua (4, 10 y 20 ° C), como se muestra en la figura complementaria 3a, b. Como resultado, la homogeneidad del puntal extruido medida utilizando la circularidad y la suavidad de la superficie mostró que el puntal procesado con la temperatura de la camisa de agua relativamente baja (4 °C) indicó una circularidad significativamente mayor y una superficie más suave en comparación con las de las otras temperaturas. Esto se puede atribuir a que el entrecruzamiento UV simultáneo de Gelma a temperaturas más bajas puede inducir una estabilidad estructural expresiva27,28. Además, cuando la temperatura de la camisa de agua se establece en 4 °C, la temperatura de impresión se midió en 10 °C. Después de fijar la dosis de UV y la temperatura de impresión, se observó el efecto de la fracción en peso de Gelma sobre el grado de reticulación. La figura complementaria 4a, b ilustra el módulo de almacenamiento para las tres fracciones de peso (3, 5 y 7% en peso) de la biotinta Gelma. Como era de esperar, las biotintas Gelma demostraron una transición sol-gel similar para el barrido de temperatura, y se logró la reticulación bajo una dosis fija de UV (120 mJ/cm2) y una temperatura de impresión (10 °C). Después de emplear las condiciones de procesamiento UV y fijas, registramos las imágenes ópticas y medimos la relación de expansión del troquel y la degradación de los puntales Gelma impresos mediante el proceso OAB (Fig. 4c-e complementaria). Para todas las concentraciones de biotinta Gelma, se observó una proporción de hinchamiento de matriz de aproximadamente 1; sin embargo, se observó una reticulación insuficiente en el biotinta Gelma al 3% en peso (Fig. 4e complementaria). Según los resultados, utilizamos una concentración de Gelma del 5 % en peso y los siguientes parámetros de impresión: dosis UV = 120 mJ/cm2 y temperatura de impresión = 10 °C para una evaluación adicional. Como se muestra en la figura complementaria 5, la dispersión de la luz ultravioleta dentro de la boquilla utilizando los parámetros establecidos puede provocar una reticulación en la región del núcleo del puntal extruido, mientras que la región de la carcasa está relativamente menos reticulada. Con base en estos datos, predecimos cuidadosamente que los parámetros optimizados en el sistema OAB pueden permitir la fabricación de estructuras 3D multicapa.

Recientemente, los hidrogeles que cambian de forma o los sistemas de biofabricación 4D han estado ganando atención debido a que permiten la biomimética y la formación de microarquitecturas complejas29,30,31. Para expandir el proceso OAB a la fabricación 4D de varias arquitecturas biológicas complejas, adjuntamos dos fibras ópticas (fibra óptica 1 y fibra óptica 2) en una boquilla, que se muestra en la imagen esquemática de la Fig. 4a. En la imagen, como se encendió la fibra óptica-1, se puede lograr la foto-reticulación asimétrica de la estructura de Gelma impresa. En general, la alta propiedad elástica (≈alto grado de reticulación) inducida en baja hinchazón por agua32, de modo que el grado de reticulación asimétrica del hidrogel parece determinar la dirección de la curvatura del hidrogel. La Figura 4b describe el mecanismo de curvatura en detalle, y la imagen óptica del puntal Gelma que se fabricó mediante el proceso de fotorreticulación asimétrica puede indicar la reticulación asimétrica del puntal. Las Figuras 4c, d muestran la capacidad de curvatura de los puntales Gelma dependiendo del uso de las fibras ópticas. Cuando se expusieron al agua, los struts Gelma fotorreticulados asimétricamente iniciaron diferentes tasas de hinchamiento y se produjeron diversos comportamientos de hinchamiento en la dirección de la sección transversal del strut debido al diferente grado de reticulación, formando estructuras en espiral y en forma de s. Con base en la prueba de concepto demostrada de la fabricación 4D, predecimos cuidadosamente que el sistema OAB se puede aplicar en varias aplicaciones biológicas, como la formación de vasos sanguíneos o los injertos de nervios.

a Óptica y esquema de foto-reticulación asimétrica utilizando dos fibras ópticas. b Mecanismo de transformación de la forma del puntal Gelma y una imagen óptica del puntal Gelma fabricado. Capacidad de curvatura (formación de espiral c y curva d 's') de los puntales Gelma dependiendo de la reticulación asimétrica de los puntales Gelma. Barra de escala, 100 µm (b); 5 mm (c, d).

Como se indicó en la sección anterior, una de las ventajas del proceso OAB es que las biotintas fotorreticulables se pueden reticular dentro de la boquilla, independientemente de la transparencia del material de la boquilla y la complejidad de la boquilla. Se utilizaron tres boquillas diferentes (boquilla de vidrio, boquilla de plástico opaco y boquilla de acero comprimida) para demostrar la viabilidad del proceso OAB, independientemente del diseño específico de la boquilla. Como se ilustra en la Fig. 5a, se usó una boquilla de vidrio para extruir la biotinta Gelma, y los puntales de Gelma impresos con los procesos CB y OAB en las condiciones de impresión y UV previamente establecidas demostraron una forma cilíndrica completamente similar (Fig. 5b). Sin embargo, cuando se empleó el proceso OAB utilizando la boquilla de acero elipsoidal que se muestra en la Fig. 5c, se obtuvo un puntal Gelma con una forma más similar a la forma de la boquilla de sección transversal de acero que a la forma del puntal impresa con el proceso CB. (Fig. 5c, d).

a Imágenes ópticas de superficie y transversales de los struts de Gelma impresos procesados a través de CB y OAB (dosis UV = 120 mJ/cm2) yb circularidad de las imágenes transversales. c, d Una boquilla de acero con forma de sección transversal elipsoidal, puntales de Gelma impresos procesados a través de CB y OAB, y la relación de aspecto (longitud del eje largo (L1)/longitud del eje corto (L0) del puntal impreso) determinado usando las imágenes ópticas transversales de los puntales impresos. e Imágenes ópticas de tres boquillas de plástico con diferentes formas de sección transversal (N-1: redonda, N-2: plus, N-3: estrella) y formas de Gelma de sección transversal impresas fabricadas con cada boquilla de plástico y el proceso OAB. N-3-CB indica la imagen óptica transversal de Gelma procesada con la forma de boquilla de plástico N-3 pero reticulada mediante el proceso CB, no el proceso OAB. f Imágenes ópticas que muestran varias estructuras Gelma 3D usando la boquilla N-3 y el proceso OAB y (g) imágenes ópticas y de fluorescencia (colágeno: rojo y fibronectina: verde) de la superficie y los puntales transversales Colma y dECM-ma fabricados usando el Boquilla de plástico N-3 y proceso OAB. Todos los datos se presentan como media ± SD. Los valores de p se calcularon mediante la prueba t de Student (n = 3/grupo; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Barra de escala, 1 mm (a, c-boquilla y puntal); 200 µm (a, c—sección transversal del puntal, e—SEM, g—fluorescencia y sección transversal); 500 µm (c, e—sección transversal de la boquilla, f—sección transversal, g—imágenes ópticas de la boquilla); 5 mm (f—vista lateral y vista superior).

Además, se utilizaron tres boquillas de plástico opaco con diferentes formas de sección transversal [redonda (N-1), en forma de cruz (N-2) y en forma de estrella (N-3)] para imprimir el biotinta Gelma utilizando la OAB proceso, como se muestra en la Fig. 5e. Las imágenes transversales de los struts Gelma impresos con el proceso OAB muestran formas similares a las de las boquillas de impresión, mientras que el strut Gelma (N-3-CB) impreso con la boquilla N-3 y el proceso CB no presenta una forma similar a la de la boquilla de impresión (sección transversal en forma de estrella). Además, la Fig. 6 complementaria muestra imágenes ópticas del puntal Gelma impreso con boquillas N-2 y N-3 en varias dosis de UV (0–150 mJ/cm2). Para mostrar las formas 3D de Gelma fabricadas con el proceso OAB y la boquilla N-3, fabricamos las formas con tres estructuras diferentes, que se muestran en la Fig. 5f.

Ampliar la viabilidad del proceso OAB a diferentes hidrogeles metacrilados, un colágeno metacrilado (Colma) (grado de metacrilación: 79,3 ± 1,6 %) y metacrilato dECM (dECM-ma, grado de metacrilación: 76,0 ± 2,4 %) que se derivó del esqueleto Se utilizó tejido muscular. Se describió el esquema de los procesos de descelularización/metacrilación utilizando tejido muscular porcino (Fig. 7a complementaria), y se mostraron los contenidos de ADN y colágeno, elastina y GAG para el tejido muscular, Colma y dECM-ma (Fig. 7b-e complementaria) . La figura 5g mostró las imágenes ópticas y de fluorescencia (colágeno: rojo, fibronectina: verde) de la superficie y la sección transversal de los puntales impresos mediante el uso de la boquilla N-3 y el proceso OAB. El patrón de superficie con microranuras se observó claramente en los puntales Colma y dECM-ma.

Adoptando los siguientes parámetros de impresión: dosis de UV = 120 mJ/cm2, temperatura = 10 °C, presión de impresión = 120 ± 10 kPa, velocidad de movimiento de la boquilla = 1 mm/s, filamentos de Gelma cargados de células (5% en peso de Gelma, C2C12 densidad de 1 × 107 células/ml) se fabricaron utilizando los procesos CB y OAB-N-3 (forma de boquilla: N-3). Como se ilustra en la Fig. 6a, las imágenes ópticas de la superficie y la sección transversal de los puntales de Gelma cargados de células exhiben formas redondas y de estrella para los puntales procesados con CB y OAB-N-3, respectivamente. Las imágenes vivas (verde)/muertas (rojas) y la viabilidad celular (CB = 92,5 ± 2,2 % y OAB-N-3 = 91,9 ± 1,8 %) de los struts a 1 y 3 días de cultivo celular revelaron que los procesos, incluido cada procedimiento de fotorreticulación, eran seguros para las células cargadas (Fig. 6b, c).

a Imágenes ópticas de la superficie y de la sección transversal de los puntales Gelma procesados mediante procesos CB y OAB con la boquilla N-3. b Vivo (verde)/muerto (rojo) a los 1 y 3 días de cultivo y (c) viabilidad celular para cada puntal Gelma. d Proliferación celular determinada usando el ensayo MTT para los puntales Gelma. e DAPI (azul)/faloidina (roja) a los 14 días de cultivo y (f) DAPI/MHC (verde) a los 21 días de cultivo (el recuadro blanco indica la región ampliada). g Factor de orientación del MHC, índice positivo e índice de fusión para los puntales Gelma cargados con C2C12 a los 21 días de cultivo celular. h Expresión génica relativa de MHC y Troponina T en estructuras CB y OAB-N-3 a los 14 y 21 días de cultivo celular. Todos los datos se presentan como media ± SD. Los valores de p se calcularon mediante la prueba t de Student (n = 5/grupo; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Barra de escala, 500 µm (a—superficie, e, f—panel superior); 200 µm (a—sección transversal, b); 100 µm (e, f—panel inferior).

Además, medimos la proliferación celular utilizando el ensayo MTT para los puntales y descubrimos que la tasa de proliferación no fue significativamente diferente entre los puntales. Para observar la morfología celular de los puntales de Gelma, se capturaron imágenes DAPI (azul)/faloidina (roja) después de 14 días de cultivo celular. En las imágenes registradas, se observó actina F alineada uniaxialmente en el strut Gelma con un patrón de superficie acanalado fabricado con el proceso OAB-N-3, mientras que en el strut impreso con el proceso CB, se observó una alineación uniaxial similar de actina F. no logrado (Fig. 6e). Además, las imágenes DAPI/MHC (verde) a los 21 días de cultivo celular exhibieron MHC bien alineados y acelerados, determinados por el factor de orientación (=[90 − φ]/90, donde φ = ancho total a la mitad del máximo en una distribución de alineación ), y se observaron valores de índice/índice de fusión más positivos en los struts Gelma procesados con OAB-N-3 que en los struts procesados con CB (Fig. 6f, g).

Para observar la diferenciación miogénica de los puntales de Gelma impresos, se observó la expresión de genes miogénicos (MHC y troponina T) a los 14 y 21 días de cultivo celular (Fig. 6h). Los genes miogénicos aumentaron en el grupo Gelma procesado con OAB-N-3; esto se debió a la señal topográfica (forma de ranura) dentro de la boquilla, que fue especialmente diseñada para inducir la alineación de las células. Estos resultados están en buen acuerdo con los resultados de varios estudios que han demostrado que varios andamios con patrones topográficos uniaxiales pueden ajustar la alineación de los mioblastos e incluso la formación de miotubos33,34,35. Aquí, se usaron células C2C12 inmortalizadas para evaluar las actividades celulares in vitro. Sin embargo, los resultados in vitro pueden diferir cuando se utilizan células primarias autólogas o alogénicas.

Los puntales Gelma cargados de hASC fabricados con los procesos CB, OAB-N-1 (forma de boquilla: N-1) y OAB-N-3 (forma de boquilla: N-3) se aplicaron a la regeneración de tejido VML, que se obtuvo extirpando el 40% de un músculo TA original en un modelo de ratón36. En este análisis, usamos hASC para respaldar la regeneración de VML defectuoso37,38 porque la diferenciación de hASC en varios linajes celulares, incluido un linaje miogénico, puede ser inducida por diversos estímulos químicos y físicos39. Como se ilustra en la Fig. 7a, las construcciones de Gelma cargadas de hASC fabricadas (densidad celular = 1 × 107 células/ml, tamaño = 2 × 4 × 1,6 mm3) (CB, OAB-N-1 y OAB-N-3) se aplicaron en la región muscular defectuosa. Como era de esperar, las hASC estaban vivas en las tres estructuras y las células cargadas en el grupo OAB-N-3 estaban bien alineadas en la dirección de impresión en comparación con las de CB y OAB-N-1 (Fig. 7a-c).

a Imágenes ópticas, vivos/muertos en los días 1 y 3, e imágenes DAPI/faloidina en los días 7 y 14 de construcciones musculares CB y OAB (OAB-N-1 y OAB-N-3) cargadas con células madre adiposas humanas procesadas con Boquillas N-1 y N-3, respectivamente. b Viabilidad celular de las construcciones musculares a los 1 y 3 días de cultivo celular (n = 5 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra) y (c) factor de orientación usando F-actina a los 14 días de cultivo celular (n = 5 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra). d Aspecto macroscópico de las construcciones implantadas en el defecto del músculo TA. Cuantificado (e) fuerza de agarre, (f) latencia para la prueba de caída y (g) peso muscular después de 4 semanas de implantación (n = 5 por animales, tres mediciones repetidas por muestra). h H&E (púrpura: núcleos, rosa: citoplasma), MT (rojo: fibra muscular, azul: colágeno) y DAPI/MHC (verde) de sitios trasplantados, (i) área fibrótica (%) (n = 5 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra), (j) miofibra nucleada centralmente (%) (n = 5 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra), (k) área de miofibra nucleada periféricamente (%) (n = 5 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra), (l) diámetro de las miofibras (μm) (n = 25 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra), y (m) área MHC positiva (%) (n = 5 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra) para muestras simuladas, solo defectos, CB, OAB-N-1 y OAB-N-3. Todos los datos se presentan como media ± SD. Los valores de p se calcularon mediante la prueba t de Student (b, c) y ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey (e-m) (no significancia estadística NS, *p < 0,05; **p < 0,01; *** p < 0,001). Barra de escala, 2 mm (a—óptica, d); 500 µm (a—vivo/muerto, h–H&E); 100 µm (a—DAPI/faloidina); 50 µm (h—H&E ampliada, MT, DAPI/MHC).

Para evaluar la eficiencia de la regeneración muscular VML, cinco grupos: (1) simulado (sin defecto), (2) solo defecto, (3) CB, (4) OAB-N-1 y (5) OAB-N-3 grupo se implantaron en el modelo de ratón (Fig. 7d). La evaluación de la fuerza de prensión y la latencia a la caída es una evaluación fiable de la eficacia regenerativa muscular14,40,41,42. Como tal, los resultados de la prueba de fuerza de agarre y la prueba de latencia de caída en ratones 4 semanas después de la implantación de las construcciones se muestran en la Fig. 7e-g. El grupo OAB-N-3 mostró una fuerza de prensión significativamente mayor que los otros grupos y una fuerza de prensión similar a la del simulacro (Fig. 7e). Sin embargo, el tiempo de latencia de caída mostró una latencia de caída relativamente más larga en comparación con los otros grupos, pero fue significativamente menor que la del grupo simulado (Fig. 7f). Atribuimos estos hallazgos a la denervación de las fibras musculares posterior al defecto de VML, lo que resulta en un deterioro funcional42,43,44. Para evaluar este efecto, las secciones musculares recolectadas se tiñeron con receptores de acetilcolina (AchR) (Fig. 8a complementaria). Se observaron expresiones significativamente más altas de AchR en los ratones que recibieron OAB-N-3 en comparación con otros grupos (Fig. 8b complementaria). Además, el peso muscular del grupo OAB-N-3 fue muy similar al del grupo simulado (Fig. 7g). La figura 7h ilustra los resultados histológicos longitudinales de la tinción H&E, MT y DAPI/MHC, y la figura complementaria 9 muestra la tinción H&E transversal. Se midieron las áreas fibróticas, la miofibra nucleada centralmente, el área de miofibra nucleada periféricamente, el diámetro de las miofibras y el área positiva para MHC, y los resultados se presentan en la Fig. 7i-m. Como se ilustra en los resultados, se detectó una regeneración muscular más eficiente y un bajo grado de fibrosis (área azul en la tinción MT) en el grupo OAB-N-3 en comparación con los valores correspondientes en los grupos CB y OAB-N-1, lo que demuestra que las señales topográficas, causadas por la ranura de la boquilla utilizada en el proceso OAB-N-3. Además, las fibras musculares centralmente nucleadas en las secciones musculares extraídas de los ratones que se procesaron con OAB-N-3 fueron considerablemente más bajas en comparación con las del defecto, CB y OAB-N-142,45,46. Con base en estos resultados, predecimos cuidadosamente que el bioconstructo OAB-N-3 puede inducir una regeneración muscular más efectiva que la de los grupos CB y OAB-N-1 sin ninguna indicación topográfica.

Más interesante aún, las miofibras formadas en las construcciones implantadas se originaron a partir de las hASC impresas en CB, OAB-N-1 y OAB-N-3, respectivamente, según lo confirmado por doble inmunofluorescencia para MHC/MRPL11 y MHC/HLA-A. a las 4 semanas después de la implantación (Fig. 8a). En particular, se puede observar que el grupo OAB-N-3 tiene fibras musculares positivas para MRPL11 y HLA-A significativamente más altas que otros grupos (CB y OAB-N-1) (Fig. 8b, c). Basándonos en los resultados histológicos, podemos concluir que la regeneración muscular usando la construcción Gelma cargada de células procesada usando el proceso OAB-N-3 puede acelerarse en comparación con la usando la construcción Gelma procesada usando el proceso CB y OAB-N-1. Sin embargo, a pesar de estos resultados regenerativos musculares favorables con respecto a la construcción propuesta (OAB-N-3), vale la pena señalar que debido a los pequeños tamaños de defectos del modelo de VML de ratón, falta relevancia clínica.

a Imágenes de doble inmunofluorescencia de DAPI (azul)/MHC (rojo)/MRPL 11 (verde) y DAPI (azul)/MHC (rojo)/HLA-A (verde). Cuantificado (b) MRPL11 y (c) miofibras positivas para HLA-A (%) (n = 5 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra). Todos los datos se presentan como media ± SD. Los valores de p se calcularon mediante ANOVA de una vía con la prueba post hoc de Tukey (NS = estadística no significativa, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Barra de escala, 200 µm (a—DAPI/MHC/MRPL11); 50 µm (a—DAPI/MRPL11, DAPI/HLA-A); 100 µm (a—DAPI/MHC/HLA-A).

En este estudio, desarrollamos un nuevo proceso de bioimpresión complementado con un método de fotorreticulación asistido por fibra óptica para fabricar filamentos cargados de células con superficies microestampadas para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Para obtener puntales cargados de células biofuncionales con una señal topográfica, se seleccionaron cuidadosamente los parámetros de impresión apropiados, como la dosis de UV y la temperatura de impresión. Para demostrar la viabilidad del proceso de bioimpresión, se utilizaron mioblastos C2C12 y hASC para observar actividades miogénicas in vitro y defectos musculares volumétricos in vivo, respectivamente, en un modelo de ratón. Como resultado del fenotipo biomimético en las construcciones de Gelma cargadas de células procesadas con OAB-N-3, se observó una reparación de VML in vivo mejorada en comparación con las bioconstrucciones impresas a través de los procesos de impresión convencionales. En base a estos resultados, creemos que el proceso de bioimpresión recientemente diseñado combinado con la reticulación asistida por fibra óptica puede servir como un enfoque prometedor para fabricar construcciones cargadas de células biofuncionales para su aplicación en varias regeneraciones de tejidos.

El sistema de bioimpresión asistida por fibra óptica estaba compuesto por tres partes principales: una impresora 3D (DTR3-2210 T-SG; DASA Robot, Corea), un generador ultravioleta (UV) con un cabezal de punto UV (LGA-20562; Liim Tech, Corea), y una boquilla combinada con una fibra óptica, como se presenta en la Fig. 1a–c. Se compraron fibras ópticas de sílice (diámetro = 200 μm, longitud = 5,5 cm, apertura numérica = 0,22, Edmund Optics, NJ, EE. UU.) con baja atenuación a la radiación UV (40 db/km) de Edmund Optics (Barrington, NJ, EE. UU.) . Las boquillas de plástico se fabricaron con una impresora 3D de procesamiento de luz digital (X-CUBE3, Foshan Stek Technology, China) con resina de acrilato fotocurable (3DV-301; WOW 3D, Corea del Sur). Después de la impresión, las boquillas se lavaron con etanol y se secaron a temperatura ambiente. Posteriormente, la fibra óptica se insertó en las boquillas de plástico.

La metacrilación de la gelatina se realizó como se informó previamente47. Brevemente, se disolvió gelatina (10% en peso; 300 g Bloom; Sigma-Aldrich) obtenida de piel porcina en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se añadió anhídrido metacrílico (Sigma-Aldrich, EE. UU.) gota a gota a 50 °C y la solución se agitó a 500 rpm durante 3 h. Gelma se dializó en agua destilada utilizando una membrana de diálisis de corte de peso molecular de 12 kDa (Thermo-Fisher Scientific, EE. UU.) a 40 °C durante 7 días para eliminar el anhídrido metacrílico restante. Finalmente, Gelma fue liofilizado y almacenado en ultracongelador.

La solución de Gelma (5% en peso) se disolvió en PBS que contenía fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (0,05% en peso; Sigma-Aldrich, EE. UU.) a 37 °C. Para esterilizar los hidrogeles Gelma se utilizaron filtros de jeringa de 0,22 μm (Thermo-Fisher Scientific, EE. UU.). Se obtuvieron dos biotintas Gelma diferentes mezclándolas con mioblastos de ratón C2C12 (CRL-1772; ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) y hASC (PT-5006; Lonza, Basilea, Suiza) a una densidad de 1 × 107 células/mL.

Se utilizó un reómetro rotacional Bohlin Gemini HR Nano (Malvern Instruments, Reino Unido) equipado con una geometría de placa paralela acrílica (diámetro = 40 mm y espacio = 200 μm) para evaluar las propiedades reológicas de las biotintas Gelma. Se realizó una prueba de barrido de tiempo (deformación = 1 %; temperatura = 10 °C; y frecuencia = 1 Hz) de la tinta biológica Gelma en diversas condiciones UV. Se realizó una prueba de barrido de temperatura (4–45 °C) de la solución de Gelma a una velocidad creciente (5 °C/min) con una frecuencia fija de 1 Hz y una deformación del 1 %.

Se utilizó una boquilla de fibra óptica, junto con un sistema de impresión de tres ejes (DTR3-2210 T-SG; DASA Robot, Corea) y un sistema de dispensación (AD-3000C; Ugin-tech, Corea), para fabricar las construcciones cargadas de células. . Los parámetros del proceso fueron los siguientes: velocidad de movimiento de la boquilla = 2 mm/s, caudal de biotinta = 0,045 ml/min, temperatura del cilindro = 10 °C y temperatura de la camisa de agua = 4 °C. Durante el proceso de extrusión, la biotinta se expuso simultáneamente a una dosis de UV [(dosis = Iv × t; Iv = intensidad de UV (20 mW/cm2), t = tiempo de exposición a UV (6 s)] de 120 mJ/cm2 para la reticulación La intensidad UV se midió usando un medidor de luz UV (LS125; Linshang, China).

La caracterización morfológica se realizó utilizando un microscopio óptico (BX FM-32; Olympus, Tokio, Japón) equipado con una cámara digital y un microscopio electrónico de barrido (SNE-3000M; SEC, Inc., Corea del Sur). Se utilizó el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.) para detectar diferencias entre los valores de gris transversales, la circularidad (=4π × A/P2, donde A = área y P = perímetro) y la relación de aspecto determinada. por la longitud más larga/longitud más corta. La tasa de biodegradabilidad se evaluó sumergiendo las muestras en PBS a 37 °C durante 7 días. Se consideraron las diferencias en los cambios de diámetro del puntal para medir la tasa de degradación.

Los análisis mecánicos, incluidas las pruebas de tracción y de cizallamiento de las estructuras, se realizaron utilizando una máquina de tracción universal (Toptech 2000; Chemilab, Corea). Para medir las propiedades de tracción, las muestras (10 × 3 × 1,6 mm3) se probaron a una velocidad de 0,5 mm/s utilizando una celda de carga de 30 kgf. Para calcular las propiedades de adhesión entre las construcciones impresas (10 mm × 25 × 1,6 mm3), la prueba de cizallamiento se basó en la norma ASTM F2255-0548 con una velocidad de estiramiento de 0,5 mm/s.

Para la evaluación in vitro, se bioimprimieron construcciones cargadas de células (mioblastos C2C12 o hASC) con densidades celulares de 1 × 107 células/ml y dimensiones de 6 × 30 × 1,6 mm3. Las construcciones cargadas de C2C12 se cultivaron en placas de cultivo tisular de seis pocillos con medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa que contenía penicilina-estreptomicina al 1 % (Pen-Strep, Thermo-Fisher Scientific, EE. UU.) y suero bovino fetal al 10 % ( FBS, Gemini Bio-Products, EE. UU.). Además, usamos DMEM alto en glucosa suplementado con suero de caballo al 2% (Sigma-Aldrich St Louis, EE. UU.) para inducir la miogénesis. Las construcciones cargadas de hASC se cultivaron en placas de cultivo tisular de seis pocillos con DMEM bajo en glucosa que contenía Pen-Strep al 1 % y FBS al 10 %. Además, utilizamos un suplemento DMEM bajo en glucosa que contenía suero de caballo al 5 %, dexametasona 0,1 μM e hidrocortisona 50 μM. El medio de todas las muestras se cambió cada 3 días.

La viabilidad celular dentro de las construcciones cargadas de células se investigó utilizando un kit de ensayo vivo/muerto (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las construcciones cargadas de células se recogieron después de 1 día de cultivo, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) y se incubaron en una solución de reactivo (0,15 mM/ml de calceína AM y 2 mM de homodímero-1 de etidio en DPBS) a temperatura ambiente durante 40 min para el ensayo vivo/muerto. Se capturaron tres imágenes de las muestras teñidas usando un microscopio confocal (LSM 700; Carl Zeiss, Alemania) después de un lavado suave con DPBS. Usando estas imágenes, cuantificamos el valor medio de la viabilidad celular (%) como la proporción de células vivas con respecto al total de células contando el número de células vivas (verde) y células muertas (roja) usando el software ImageJ.

La actividad metabólica celular dentro de la construcción se midió utilizando un kit de ensayo de bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazolio (MTT) (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). Después de 1, 3 y 7 días de cultivo, se midió la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial en células vivas a una absorbancia de 570 nm después de la exposición a 0,5 mg/mL de la solución de MTT a 37 °C durante 4 h. Los valores de absorbancia obtenidos de las construcciones sin células se restaron de los obtenidos de las construcciones cargadas de células.

Las construcciones bioimpresas que contenían mioblastos C2C12 y hASC se fijaron en paraformaldehído al 3,7 % (Sigma-Aldrich) durante 30 min, se bloquearon con un agente bloqueador de proteínas sin suero (Agilent) durante 1 h y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1 % ( Sigma-Aldrich) durante 3 min. El citoesqueleto de las células en las construcciones bioimpresas se visualizó mediante inmunofluorescencia usando faloidina conjugada con Alexa Fluor 594 (rojo; 1:100 en DPBS; Invitrogen), y los núcleos se tiñeron con diamidino-2-fenilinodol (DAPI) (azul; 1:100 en DPBS; Invitrogen). El factor de orientación [=(90° - φ)/90°, φ = ancho completo a la mitad del máximo (FWHM)] se analizó utilizando el software ImageJ.

Para la inmunofluorescencia de cadena pesada de miosina (MHC), las construcciones bioimpresas se trataron con un anticuerpo primario anti-MF20 (5 μg/ml; Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA, EE. UU.) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Luego, las muestras se lavaron con DPBS y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 (verde; 1:50 en DPBS; Invitrogen) durante 1 hora. Finalmente, los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes inmunofluorescentes de MHC/DAPI se visualizaron y capturaron con un microscopio confocal, y la madurez de las miofibras (índice positivo de MHC e índice de fusión) se cuantificó con el software ImageJ.

Para el análisis cuantitativo en tiempo real de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (qRT-PCR), las construcciones bioimpresas se recolectaron después de 14 y 21 días de cultivo, y se usaron marcadores de genes miogénicos MHC y troponina T. Brevemente, las construcciones cargadas de células se trataron con un reactivo TRIzol (Sigma-Aldrich) para aislar el ARN. La concentración y la pureza del ARN se midieron con un espectrofotómetro (FLX800T; BioTeK, EE. UU.). Las muestras de ARN se trataron con ADNasa libre de ARNasa antes de la síntesis de ADNc. Las muestras de ADNc se sintetizaron utilizando Power SYBRVR Green qPCR Master Mix (Qiagen). Se utilizó un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems, EE. UU.) para realizar el análisis de RT-PCR, de acuerdo con el protocolo del fabricante. El gen de limpieza gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utilizó para la normalización. Las secuencias de cebadores específicos para los genes objetivo se enumeran en la Tabla 1.

Los defectos del músculo TA se crearon en ratones C57BL/6 (macho, 10 semanas de edad, DooYeol Biotech, Inc., Seúl, Corea), y todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité Asesor de Investigación y Cuidado Animal Institucional en el Sungkyunkwan University School of Medicine Laboratory Animal Research Center y cumplió con las normas del Comité de Ética Institucional (SKKUIACUC2021-08-11-2). Brevemente, los ratones se dividieron al azar en cinco grupos (un total de 25 ratones, n = 5 por grupo). Antes de la implantación, los ratones se anestesiaron primero usando isoflurano al 3% v/vy sus músculos se aislaron de la fascia mediante una incisión de la piel debajo de las piernas izquierda y derecha. Después de esto, se extirparon el extensor digitorum longus y el extensor hallucis longus para inducir una lesión por pérdida muscular volumétrica (VML), y aproximadamente el 40% de los músculos TA se extirparon y pesaron (Tabla complementaria 1). Para la restauración de VML, se trasplantaron construcciones bioimpresas cargadas de hASC (2 × 4 × 1,6 mm3) en las regiones del defecto del músculo TA y se cubrieron con fascia y piel suturadas. Después de la implantación, los ratones recibieron una inyección subcutánea de 0,5 mg/kg de buprenorfina para controlar el dolor y se les dio comida y agua normalmente después de la operación. Después de 4 semanas de implantación, los ratones fueron sacrificados mediante inhalación de CO2 y dislocación cervical secundaria. Antes del trasplante, las construcciones cargadas de hASC se cultivaron en un medio de cultivo durante 1 día para estabilizar las células31,49.

La funcionalidad del músculo esquelético de los ratones que recibieron varios tratamientos se evaluó midiendo la fuerza de agarre y la latencia para caer. La fuerza máxima de agarre de los ratones a las 4 semanas posteriores al trasplante se midió tirando del ratón en paralelo a la línea de la cuadrícula y midiendo la fuerza de agarre (medidor de fuerza de agarre, BIO-G53, BIOSEB, FL, EE. UU.) como el procedimiento descrito50. Además, la latencia de caída se evaluó midiendo el tiempo transcurrido después de que el ratón se colocó en una varilla. El período máximo de latencia se fijó en 300 s. Cada experimento se repitió tres veces por ratón. Se proporcionó una duración de intervalo de 5 min entre las repeticiones (n = 5 por animal, tres mediciones repetidas por muestra).

Para la tinción histológica, las muestras de músculo TA recolectadas se fijaron con formalina tamponada neutra al 10 % durante 24 h. Luego, las muestras se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se seccionaron en rodajas de cinco micras de espesor. Las secciones de músculo se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y tricrómico de Masson (MT). Las imágenes teñidas con H&E y las imágenes teñidas con MT se analizaron con el software ImageJ para cuantificar las miofibras nucleadas centralmente, el área de miofibras nucleadas periféricamente y el área fibrótica, respectivamente (n = 5 por muestra, cuatro campos aleatorios en cada muestra). Las miofibras nucleadas centralmente y las fibras musculares nucleadas periféricamente se cuentan manualmente utilizando la herramienta multipunto en imageJ. La miofibra nucleada centralmente se obtuvo dividiendo el número de miofibras nucleadas centralmente por el número total de fibras musculares. Además, el área de miofibras nucleadas periféricamente se calculó dividiendo el área de miofibras nucleadas periféricamente por el área total de fibras musculares.

Para la tinción de inmunofluorescencia, las muestras seccionadas se trataron con un anticuerpo primario anti-MF20 (5 μg/ml; Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA), anti-MRPL11 (proteína ribosómica antimitocondrial policlonal de conejo L11, reactividad de especies: humano, 1 :100 dilución; Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-HLA-A (reactividad de especie: humano, dilución 1:100; Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-CHRNB2 (subunidad beta-2 del receptor neuronal de acetilcolina, dilución 1:100 , Thermo-Fisher Scientific, EE. UU.) y se incubó durante la noche a 4 °C. Luego, las muestras se lavaron con DPBS y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 (verde; 1:50 en DPBS; Invitrogen) o anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 594 (rojo; 1:50 en DPBS; Invitrogen) y Alexa 488- IgG anti-conejo conjugado (dilución 1:200, Invitrogen) durante 1 h. Finalmente, los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes de inmunofluorescencia MHC/DAPI se capturaron utilizando un microscopio confocal. El área de fibra muscular por campo (%) (n = 5 por muestra, cuatro campos aleatorios en cada muestra), el diámetro de las miofibras (n = 25 por muestra, cuatro campos aleatorios en cada muestra) y el área positiva para MHC (% ) (n = 5 por muestra, cuatro campos aleatorios en cada muestra) se midieron con imágenes inmunofluorescentes para MHC/DAPI (x400 aumentos) de manera ciega. El área de miofibras positivas para MRPL11 y HLA-A (%) se midió con imágenes dobles de inmunofluorescencia para MHC/MRPL11 y MHC/HLA-A (aumento de ×400) de forma ciega (n = 5 por muestra, cuatro campos aleatorios en cada muestra). Todas las imágenes de muestra se cuantificaron utilizando el software ImageJ. Todos los valores se presentan como media ± desviación estándar.

Se utilizó el software SPSS (SPSS, Inc., EE. UU.) para realizar los análisis estadísticos. Las comparaciones de dos grupos se evaluaron mediante la prueba t, y tres o más grupos se compararon evaluando el análisis de varianza (ANOVA) unidireccional o bidireccional con la prueba post hoc HSD de Tukey. Los valores de *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 se consideraron estadísticamente significativos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Este estudio fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Ciencia y TIC para el Proyecto de Desarrollo de Tecnología de Innovación Bioinspirada (NRF-2018M3C1B7021997 y NRF-2021R1A5A8029876 para DR) y el Programa de Investigación de Ciencias Básicas (NRF-2021R1I1A1A01061021) . Este estudio también fue apoyado por una subvención del Ministerio de Comercio, Industria y Energía (MOTIE, Corea) bajo el Programa de Innovación de Tecnología Industrial (20009652: Tecnología en comercialización y materiales de hidroxiapatita bioabsorbible que es menos de un micrómetro de tamaño).

Estos autores contribuyeron por igual: JaeYoon Lee, Hyeongjin Lee.

Departamento de Medicina de Precisión, Facultad de Medicina de la Universidad Sungkyunkwan, Suwon, República de Corea

JaeYoon Lee, Hyeongjin Lee y Geun Hyung Kim

Departamento de Biotecnología y Bioinformática, Universidad de Corea, Sejong, República de Corea

Hyeong-jin Lee

Departamento de Biología Celular Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad Sungkyunkwan, Suwon, República de Corea

Eun-Ju Jin y Dongrieol Ryu

Departamento de Ciencia e Ingeniería Biomédica, Instituto de Ciencia y Tecnología de Gwangju, Gwangju, República de Corea

Dongryeol Ryu

Departamento de Biofísica, Instituto de Biofísica Cuántica, Universidad Sungkyunkwan, Suwon, República de Corea

Geun Hyun Kim

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JYLee: Conceptualización, Análisis de datos, Metodología, Investigación, Visualización. H.Lee: análisis de datos, metodología, investigación, visualización, redacción: borrador original. EJJ: Análisis de datos, Investigación. DR: Supervisión, Análisis de datos, Redacción—borrador original, Adquisición de fondos. GHK: Supervisión, Administración de proyectos, Conceptualización, Análisis de datos, Redacción—borrador original, Revisión y edición, Adquisición de fondos.

Correspondencia a Dongryeol Ryu o Geun Hyung Kim.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Lee, J., Lee, H., Jin, EJ. et al. Bioimpresión 3D utilizando un nuevo método de fotorreticulación para la restauración del tejido muscular. npj Regen Med 8, 18 (2023). https://doi.org/10.1038/s41536-023-00292-5

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Recibido: 02 julio 2022

Aceptado: 17 de marzo de 2023

Publicado: 31 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41536-023-00292-5

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