Estructura de la célula NK humana NKR

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 5022 (2022) Citar este artículo

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La señalización por parte del receptor tipo lectina tipo C humano, el receptor inhibidor de células asesinas naturales (NK) NKR-P1, tiene un papel fundamental en muchas enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario y el cáncer. Los receptores tipo lectina tipo C tienen afinidades débiles con sus ligandos; por lo tanto, es necesario establecer un modelo integral de interacciones NKR-P1-LLT1 que considere el estado natural del receptor en la superficie celular para comprender sus funciones. Aquí informamos las estructuras cristalinas de los complejos NKR-P1 y NKR-P1:LLT1, lo que proporciona evidencia de que NKR-P1 forma homodímeros en un arreglo inesperado para permitir la unión de LLT1 en dos modos, uniendo dos moléculas LLT1. Estos grupos de interacción sugieren una sinapsis inmune inhibitoria. Al observar la formación de estos grupos en solución mediante el análisis SEC-SAXS, mediante microscopía de superresolución dSTORM en la superficie celular y al seguir su papel en la señalización del receptor con células NK recién aisladas, mostramos que solo la ligadura de la unión de LLT1 interfases conduce a una señalización inhibitoria efectiva de NKR-P1. En resumen, nuestros hallazgos respaldan colectivamente un modelo de agrupamiento de NKR-P1:LLT1, que permite que las proteínas que interactúan superen la afinidad débil del ligando-receptor y desencadenen la transducción de señales al contacto celular en la sinapsis inmunitaria.

Las células asesinas naturales (NK, por sus siglas en inglés) son linfocitos inmunitarios innatos equipados con una amplia gama de receptores de superficie activadores e inhibidores, lo que les permite reconocer con sensibilidad y destruir células malignas, infectadas u otras células transformadas a través de mecanismos "ausentes" y "autoinducidos" y a través de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC)1. Además, las células NK también contribuyen al inicio y desarrollo de la respuesta inmune adaptativa, secretando varias clases de citoquinas, especialmente IFN-γ1 proinflamatoria. Curiosamente, los hallazgos recientes muestran que las células NK pueden incluso mantener una forma de memoria inmunológica1,2, lo que destaca aún más los roles principales que desempeñan las células NK en la inmunidad, particularmente a través de sus receptores.

Los receptores NK comprenden dos clases estructuralmente divergentes: las familias de receptores tipo inmunoglobulina y los receptores tipo lectina tipo C (CTLR)3,4. Los CTLR están codificados dentro del complejo del gen asesino natural (NKC, cromosoma 12 humano) y, a diferencia de las lectinas de tipo C, los CTLR no se unen a los iones de calcio ni se involucran con ligandos de carbohidratos5,6. En cambio, se sabe que los CTLR interactúan con ligandos de proteínas. Por ejemplo, los receptores como Ly49, CD94/NKG2 o NKG2D reconocen moléculas similares a MHC de clase I3, mientras que los receptores de la subfamilia NKR-P1 reconocen CTLR Clr/Ocil estructuralmente muy relacionados. Estos están codificados por genes CLEC23,5 genéticamente estrechamente vinculados a los genes KLR que codifican NKR-P1. Este exclusivo sistema de interacción CTLR:CTLR está implicado tanto en el auto-reconocimiento no-MHC como en el auto-reconocimiento inducido3,4,5. Se han descrito varios receptores NKR-P1 inhibidores y activadores en ratones y ratas; sin embargo, el receptor humano NKR-P1 (CD161, gen KLRB1) sigue siendo desde 1994 el único ortólogo humano descrito hasta el momento7. Sin embargo, en base a la homología estructural y funcional con NKR-P1, los pares de ligandos CTLR activadores humanos NKp65:KACL (KLRF2:CLEC2A)8 y NKp80:AICL (KLRF1:CLEC2B)9 se han propuesto como las contrapartes activadoras de NKR- humano P14,10.

La NKR-P1 humana (CD161) se informó por primera vez como un marcador de células NK7, en las que la NKR-P1 actúa como un receptor inhibidor7,11,12 regulado positivamente por IL-1213. Sin embargo, NKR-P1 también es expresado por las células T asesinas naturales (NKT)14, las células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT)15 y otros subconjuntos de linfocitos T16, donde NKR-P1 actúa como un receptor coestimulador, aumentando el IFN- secreción γ11,17. Como era de esperar, NKR-P1 se detecta incluso en células CD16− CD56− NK inmaduras18 y en precursores de células Th17 y MAIT en la sangre del cordón umbilical19. Recientemente, se identificó NKR-P1 en células T infiltrantes de glioma, que tiene un papel inhibidor e inmunosupresor en la destrucción de células de glioma mediada por células T20. Además, NKR-P1 promueve la migración transendotelial a nichos inmunológicamente privilegiados tras la interacción con su ligando endógeno, el transcrito 1 similar a lectina (LLT1)19,21,22.

LLT1 (gen CLEC2D) se expresa principalmente en monocitos activados y células B23. En estas células, LLT1 ayuda a mantener la autotolerancia de las células NK10,23. Sin embargo, la IL-2 puede inducir su expresión en células NK y T24. Además, LLT1 está regulado al alza en glioblastoma25, próstata y cáncer de mama triple negativo26,27 y células B de linfoma no Hodgkin28, en las que LLT1 contribuye a la evasión inmunitaria al amortiguar la citotoxicidad de las células NK. Curiosamente, se ha detectado un aumento en el número de células CD161+ Th17 en tumores de glioma29. Al mismo tiempo, las funciones de los receptores NKR-P1 en las células T reguladoras productoras de IL-1730, en subconjuntos de células Tc1731 y en todas las células Th1719 son particularmente relevantes porque estas células se han implicado en varias enfermedades autoinmunes (enfermedad de Crohn32, esclerosis múltiple33, artritis reumatoide34 y psoriasis35). Por lo tanto, el análisis de los receptores y ligandos de NKR-P1 como LLT1 es esencial para obtener una visión más profunda de las relaciones estructura-función que subyacen a los procesos fisiológicos y patogénicos en el sistema inmunitario.

NKR-P1 y LLT1 humanos son glicoproteínas transmembrana de tipo II con una topología de proteína similar4: una cola de señalización citoplasmática N-terminal, una hélice transmembrana, una región de tallo flexible y un dominio tipo lectina tipo C (CTLD) C-terminal3, 7,36. Además, se demostró que tanto NKR-P1 como LLT1 forman homodímeros de disulfuro7,36, probablemente unidos en sus regiones de tallo. Sin embargo, la estructura del complejo NKp65:KACL37 es la única entre todos los complejos de la subfamilia de ligandos del receptor similar a la lectina (CTL) de tipo C humano que se ha resuelto hasta ahora. Un estudio posterior demostró además que la interacción entre NKp65 y KACL se basa en proteínas y es independiente de la glicosilación38. Con base en estos datos, se propuso posteriormente un modelo del complejo NKR-P1:LLT1 y se identificaron los residuos de interacción clave a través del análisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR) de los mutantes NKR-P1 y LLT1, destacando la cinética rápida de esta interacción39,40 . Además, recientemente se informaron las estructuras del ectodominio NKR-P1B de ratón relacionado complejado con la proteína inmunoevasina m12 del citomegalovirus murino (MCMV), o con su ligando afín Clrb41,42. Anteriormente, informamos sobre la primera estructura de LLT143 que forma un dímero no covalente independientemente de la glicosilación44 y sigue el modo de dimerización conservado de los ligandos codificados por CLEC2 observados para CD6945,46 y Clrg47. No obstante, todavía no se dispone de un modelo completo de la interacción dímero:dímero de los complejos CTLR:ligando, correspondiente al estado natural de estas proteínas cuando se expresan en la superficie de las células.

Aquí, investigamos la estructura de NKR-P1 humana y examinamos los efectos de la dimerización de NKR-P1 en la unión de LLT1. Presentamos la estructura cristalina de NKR-P1 en complejo con LLT1, explicamos las observaciones previas de interacción en solución y mostramos un nuevo ensamblaje de este complejo que utiliza dos sitios de unión no simétricos diferentes en LLT1. Nuestros resultados explican cómo el receptor NKR-P1 humano supera su débil afinidad por LLT1 mediante el entrecruzamiento y la agrupación inducidos por la unión de ligandos y aclaran el modo de transducción de señales de este receptor dentro de la sinapsis inmunitaria de las células NK, proporcionando así un buen modelo para la descripción futura de complejos homólogos de baja afinidad relacionados.

Se resolvieron dos estructuras cristalinas del ectodominio NKR-P1 humano: la estructura de NKR-P1 glicosilado que posee N-glicanos Asn-GlcNAc2Man5 uniformes (NKR-P1_glico) y de NKR-P1 desglicosilado con N-glicanos escindidos después del primer residuo de GlcNAc (NKR-P1_desglico); los datos estadísticos de todas las estructuras se describen en la Tabla 1. NKR-P1 en ambas estructuras cristalinas sigue la característica general de pliegue de un dominio CTL: dos hélices α (α1 y α2) y dos láminas β antiparalelas con el motivo WIGL hidrofóbico conservado dentro el núcleo del dominio (Figs. 1 y 2a). Las dos hojas β están formadas por cadenas β β0, β1, β1' y β5, y β2, β2', β3 y β4, respectivamente (asignación según Zelensky y Gready5, también utilizada para describir otras estructuras CTL relacionadas37,40 ). Además, tres enlaces disulfuro intramoleculares estabilizan el dominio: Cys94-Cys105, Cys122-Cys210 y Cys189-Cys202.

Los elementos de estructura secundaria y las regiones de bucle (L) se indican para NKR-P1 y LLT1 por encima de las alineaciones. Los números apareados en la parte inferior indican los pares de disulfuro en las estructuras NKR-P1 y LLT1; los asteriscos marcan la mutación His176Cys en LLT1 y el residuo Ile168 en NKR-P1. Los sitios de N-glicosilación predichos de NKR-P1 y LLT1 se indican con triángulos naranjas. Los motivos WIGL conservados están subrayados en negro. Las líneas azules sobre la secuencia indican las regiones que forman los dímeros no covalentes de NKR-P1 o LLT1. Los residuos conservados están marcados en rojo; las letras en negrita denotan residuos estrictamente conservados. a Alineación de secuencias de CTLD de receptores de células NK relacionados con NKR-P1 humanos, es decir, NKR-P1, NKp65 y NKp80 humanos. Los residuos de NKR-P1 que contactan con LLT1 en el complejo NKR-P1:LLT1 en el modo de unión primaria y los residuos de NKp65 que contactan con KACL en el complejo NKp65:KACL se resaltan en verde. Los triángulos morados indican residuos de NKR-P1 que se involucran con LLT1 en el complejo NKR-P1:LLT1 en el modo de unión secundario. b Alineación de secuencias de CTLD de ligandos CLEC2 humanos relacionados con LLT1, es decir, LLT1, KACL y AICL. Los residuos de LLT1 que contactan con NKR-P1 en el complejo NKR-P1:LLT1 en el modo de unión primaria y los residuos de KACL que contactan con NKp65 en el complejo NKp65:KACL se resaltan en verde. Los triángulos morados indican residuos de LLT1 que interactúan con NKR-P1 en el complejo NKR-P1:LLT1 en el modo de unión secundario. El alineamiento se realizó en Clustal Omega83, y la gráfica se preparó en ESPript 3.084.

un diagrama de cinta del NKR-P1 CTLD. Los elementos de la estructura secundaria están etiquetados en diferentes colores: la hélice α1 es roja, la hélice α2 es amarilla y las hebras β y los bucles son cian. b Comparación entre los dímeros de NKR-P1 formados por las formas glicosilada (cian), libre desglicosilada (verde) y unida a LLT1 (azul) de NKR-P1. c Comparación entre la dimerización centrada en hélices α1 y α2 de dectina-1 murina (https://doi.org/10.2210/pdb2CL8/pdb, magenta) y LLT1 humana (https://doi.org/10.2210/pdb4QKI/pdb , verde), respectivamente; las hélices α1 y α2 se muestran en rojo y amarillo. Las alineaciones estructurales de los homodímeros de dectina-1 y NKR-P1 y los homodímeros LLT1 y NKR-P1, preparadas alineando solo un monómero de cada dímero, se muestran en el lado derecho. Aunque el pliegue CTLD se conserva en cada par de monómeros alineados, los dímeros centrados en la hélice α1 y la hélice α2 muestran una disposición inversa.

La unidad asimétrica de NKR-P1_glico contiene dos monómeros, mientras que la unidad asimétrica de NKR-P1_deglico contiene ocho monómeros NKR-P1. Todos estos monómeros están organizados en homodímeros muy similares, con RMSD por pares en átomos de Cα hasta 0,5 Å (Fig. 2b). Sin embargo, estos homodímeros tienen una configuración inesperada: no siguen el modo de dimerización habitual observado para los CTLD de los ligandos CLEC2 como CD69 o LLT1 con hélice α2 en la interfaz de dimerización. En cambio, la interfaz de dimerización de NKR-P1 está formada por la hélice α1, como en el receptor murino de reconocimiento de patrones tipo lectina tipo C dectina-1 (https://doi.org/10.2210/pdb2CL8/pdb)48, con el cual NKR-P1 humano comparte solo el 32% de identidad de secuencia del CTLD (Fig. 2c). La RMSD de los átomos de Cα entre NKR-P1 y los dímeros de dectina-1 es de 3,7 Å en la región superpuesta (que coincide con 196 del total de 250 residuos del dímero NKR-P1). La región estructuralmente distinta cubre principalmente hélices α2, cuyas posiciones difieren hasta 7 Å entre NKR-P1 y dectina-1. También observamos una disposición muy similar con la interfaz de dimerización centrada en hélice α1 en la estructura de un dímero de disulfuro covalente del ectodominio del receptor NKR-P1B de rata (https://doi.org/10.2210/pdb5J2S/pdb)49 con 1.4 Å RMSD de los átomos de Cα entre estos dos dímeros (Fig. 1a complementaria). Por el contrario, el dímero no clásico del ratón NKR-P1B (https://doi.org/10.2210/pdb6E7D/pdb)42 tiene una disposición general completamente diferente (Fig. 2a complementaria).

La interfaz de dimerización del homodímero NKR-P1 consta de seis enlaces proteína-proteína y varios enlaces de hidrógeno mediados por agua (Tabla complementaria 1), una interacción de enlaces peptídicos a través de electrones deslocalizados (Lys126-Glu127) y un pequeño núcleo hidrofóbico que comprende Leu119, Ala120 , e Ile168 de ambas cadenas (Fig. 3). El área de la superficie de contacto es ca. 500 Å2. En comparación con el dímero LLT1 centrado en hélice α2 (7–12 enlaces de hidrógeno, núcleo hidrofóbico más fuerte, área de superficie de contacto de 500–800 Å2)43, el dímero NKR-P1 centrado en hélice α1 se forma a través de un área de superficie de contacto más pequeña con menos residuos de contacto .

a Dimerization interface of human NKR-P1. Subunits of human NKR-P1 are shown as Cα-trace (blue and cyan), and the dimer contact residues are shown as sticks with carbon atoms colored in light blue (blue subunit) and orange (cyan subunit); for clarity, only the residues of the blue subunit are labeled. The first GlcNAc unit N-linked to Asn116 and the carbohydrate chain N-linked to Asn169, observable in the NKR-P1_glyco structure, are shown with carbon atoms colored yellow and green, respectively. b Top view of the dimerization interface. The NKR-P1 subunits surfaces are colored blue and cyan. The GlcNAc units bound to Asn116 are shown as sticks with carbon atoms in yellow. Contact residues between the GlcNAc bound to chain A, and the chain B, are shown in yellow, whereas contact residues between the GlcNAc bound to chain B, and the chain A, are shown in purple. Hydrogen bonds are shown as green-dashed lines with a detailed view on the right-hand side. c Mixed glycosylation states at the dimer interface in the NKR-P1_deglyco structure. The GlcNAc unit N-linked to Asn157 of chain A is modeled with an occupancy of 0.5, while the second GlcNAc unit present at Asn116 of chain B is not modeled. Contours of 2mFo-DFc (2.8σ, cyan) and mFo-DFc (1σ, green) electron density maps are shown. d Small hydrophobic core in the central part of the NKR-P1 dimerization interface (subunits colored as in (a)). The central residues are shown as spheres with carbon atoms in yellow. The carbon atoms of Ile168 residues (whose mutation decreases the ability of NKR-P1 to bind LLT1)C polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e2666">51 se muestran en naranja.

El ectodominio NKR-P1 contiene tres sitios potenciales de N-glicosilación en los residuos Asn116, Asn157 y Asn169 (Fig. 1a). La glicosilación en Asn169 es visible en los mapas de densidad de electrones de las estructuras NKR-P1_glico y _deglico. En NKR-P1_glyco, la cadena de carbohidratos GlcNAc2Man5 completa se localiza en la cadena A, mientras que una cadena GlcNAc2Man3 parcial se localiza en la cadena B (Fig. 3a). En NKR-P1_deglyco, una sola unidad de GlcNAc que queda en Asn169 puede identificarse bien en las ocho cadenas de NKR-P1. Curiosamente, las primeras unidades de GlcNAc localizadas unidas en Asn116 en NKR-P1_glico y las unidades de GlcNAc superpuestas en Asn116 y Asn157 que quedan en NKR-P1_deglico participan en contactos de dimerización con residuos de hélices α1 y regiones β2, L1 y β2' de la subunidad opuesta. del homodímero NKR-P1 (Fig. 3b). En NKR-P1_glico, cinco enlaces de hidrógeno entre Asn116:GlcNAc y la subunidad opuesta estabilizan el homodímero centrado en la hélice α1 (Tabla complementaria 1). El área de superficie de contacto entre la cadena opuesta de NKR-P1 y la unidad GlcNAc localizada es de aproximadamente 125 Å2.

En NKR-P1_deglyco, la densidad en la interfaz del homodímero puede acomodar la unidad GlcNAc restante de Asn116 de una cadena o Asn157 de la cadena opuesta del dímero NKR-P1 (para obtener detalles, consulte Métodos, Tabla 1 y Fig. 3c). Por el contrario, en NKR-P1_glico, la primera unidad GlcNAc en Asn116 está bien definida en densidad electrónica en ambas cadenas, A y B, del dímero NKR-P1, mientras que no se encontró densidad electrónica para glicosilación en Asn157. Esto sugiere que aunque la glicosilación en Asn116 o Asn157 puede contribuir a la formación de dímeros, la dimerización podría verse afectada por un impedimento estérico si ambos N-glicanos están presentes simultáneamente. Para probar esta hipótesis, expresamos el mutante NKR-P1 S159A, anulando así la glicosilación en Asn157. El pliegue general del mutante es comparable al NKR-P1 de tipo salvaje, según lo evaluado por espectroscopia de CD (Fig. 3a complementaria). De hecho, cuando se analizó mediante ultracentrifugación analítica, la proteína mutante exhibió niveles sustanciales de especies oligoméricas (Fig. 3b complementaria), mientras que el ectodominio NKR-P1 de tipo salvaje es puramente monomérico50. Por lo tanto, la heterogeneidad de la glicosilación puede afectar la propensión de la NKR-P1 humana a dimerizarse y, por lo tanto, su capacidad para formar complejos multiméricos con LLT1.

La estructura cristalina del complejo NKR-P1:LLT1 está formada por ectodominios NKR-P1 y LLT1 desglicosilados. La unidad asimétrica del cristal contiene un complejo de NKR-P1 dimérico con LLT1 dimérico y un dímero extra de NKR-P1 (Fig. 4a). Estos dímeros NKR-P1 tienen la misma interfaz de dimerización centrada en hélice α1 que las estructuras de los dímeros NKR-P1 no unidos descritos anteriormente (Fig. 2b). El dímero LLT1 conserva el modo de dimerización centrado en hélice α2 esperado (Fig. 2c), idéntico al descrito anteriormente en las estructuras LLT1 no unidas43. LLT1 tiene unidades GlcNAc claramente identificables en los residuos Asn95 y Asn147. La glicosilación de NKR-P1 observada en la densidad electrónica del complejo coincide con la glicosilación identificada en la estructura NKR-P1_deglico.

a La organización general de la estructura cristalina compleja. El dímero LLT1 (verde/limón) contacta con el dímero NKR-P1, formado por los monómeros azul y cian. El segundo dímero azul-cian NKR-P1 está relacionado con el primero por simetría cristalina. El monómero cian NKR-P1 interactúa con LLT1 en el modo de interacción principal, mientras que el monómero azul NKR-P1 interactúa con LLT1 utilizando la interfaz de interacción secundaria. Un asterisco negro marca el contacto accesorio mutuo de NKR-P1 enlazado en modo primario y secundario. Además, la unidad asimétrica del cristal contiene otro dímero NKR-P1 (rosa/magenta) que carece de contacto con LLT1. b Comparación general de la estructura del KACL dimérico (púrpura) en complejo con dos monómeros NKp65 (rojo; https://doi.org/10.2210/pdb4IOP/pdb) y la estructura del dímero LLT1 (verde/limón) con los dos moléculas NKR-P1 que interactúan en los modos de unión primario (cian, lado izquierdo) y secundario (azul, lado derecho). La comparación solo con los modos de interacción NKR-P1:LLT1 primario o secundario se destaca en la sección inferior (ambos en una vista lateral, usando una rotación del eje Y de 90°). c, d Interfaces de interacción primaria y secundaria NKR-P1:LLT1. Los residuos de contacto dentro de una distancia de 5 Å están coloreados en amarillo. Los aminoácidos que forman los cuatro contactos más fuertes están resaltados en rojo para el modo primario o magenta para el modo secundario.

El homodímero LLT1 interactúa con su pareja de forma bivalente, es decir, un dímero interactúa con dos dímeros NKR-P1 relacionados por simetría cristalográfica: cada monómero LLT1 se une a una subunidad diferente de un homodímero NKR-P1 distinto (Fig. 4a). No hay un ajuste inducido aparente de los socios de unión: el RMSD de los átomos de Cα entre los dímeros NKR-P1 que no interactúan y los que interactúan (NKR-P1_glico y el complejo) es de 0,5 Å, y el de LLT1 (https://doi .org/10.2210/pdb4QKI/pdb y el complejo actual) es de 0,7 Å. Además, las cadenas de glicosilación unidas a N no contribuyen directamente a la interacción.

NKR-P1 y LLT1 establecen dos tipos de contacto en esta estructura: el modo de interacción primario (LLT1 cadena B: NKR-P1 cadena D) y secundario (LLT1 cadena A: NKR-P1 cadena relacionada con la simetría C). El modo de interacción principal coincide bien con la estructura del complejo NKp65:KACL humano homólogo (https://doi.org/10.2210/pdb4IOP/pdb)37: la RMSD de los átomos de Cα de los dos complejos es de 1,3 Å (una cadena del receptor y una cadena del ligando en cada caso, Fig. 4b, abajo a la izquierda). De manera similar, en la estructura del complejo NKR-P1B de ratón con inmunoevasina m12 de MCMV, la interfaz de interacción observada coincide con el modo principal en la estructura actual del complejo NKR-P1 humano, aunque el área cubierta por la proteína m12 es considerablemente mayor (Fig. 1b, c) 41. La estructura recientemente descrita del complejo NKR-P1B:Clrb de ratón (https://doi.org/10.2210/pdb6E7D/pdb)42 también mostró una interfaz de interacción común para ambos receptores NKR-P1 (Fig. 2b, c complementarias). Sin embargo, la disposición receptor:ligando observada en el segundo modo de interacción del complejo NKR-P1:LLT1 es única y difiere de todos los complejos homólogos conocidos en la orientación del ligando (Fig. 4b, abajo a la derecha y Fig. 2b complementaria).

Las interfaces de interacción de la NKR-P1 humana involucradas en los modos de interacción primaria y secundaria son muy similares. Están formados principalmente por residuos distales de membrana de los bucles L0, L3, L5 y L6 y por hebras β3 y β4 (Fig. 4c, d), creando una superficie plana para la interacción con LLT1. Por el contrario, en LLT1, las interfaces de interacción primaria y secundaria son sustancialmente diferentes, aunque comparten una pequeña cantidad de residuos. Mientras que los bucles L0', L0, L3, L5, L6 y las cadenas β3 y β4 forman el parche de interacción principal de LLT1 (Fig. 4c), los residuos de los bucles L2 y L5, la cadena β2" y la hélice α2 están involucrados en el segunda interfaz de interacción (Fig. 4d) Ambos modos de interacción colocan las partes próximas a la membrana del receptor y el ligando en lados opuestos del complejo, creando un modelo plausible para la interacción entre dos células vecinas.

El modo de interacción principal se establece a través de nueve enlaces de hidrógeno directos y varios mediados por agua, además de dos interacciones soportadas por carga y de apilamiento π-π (Tyr201-Arg175), con un área de superficie de contacto total de ca. 800 Å2 (Tabla complementaria 1). Los cuatro enlaces más fuertes ocurren entre los residuos de NKR-P1 Arg181, Tyr201, Lys148 y Ser199 y los residuos de LLT1 Glu179, Glu162, Ser129 y Tyr177, respectivamente (Fig. 4c). El segundo modo de interacción se establece a través de cinco enlaces de hidrógeno directos, dos soportados por carga y uno hidrofóbico (LLT1:Pro156 – NKR-P1:Ala149, Leu151), con un área de superficie de contacto total de ca. 550 Å2 (Tabla complementaria 1). Los tres enlaces más fuertes ocurren entre los residuos de NKR-P1 Asp147, Ser199 y Arg181 y los residuos de LLT1 Arg153, Lys169 y Asn120, respectivamente (Fig. 4d).

Además de la interacción con LLT1, los dímeros NKR-P1 unidos en modos primario y secundario también tienen un contacto accesorio mutuo no despreciable (cadena D de NKR-P1 y cadena C de NKR-P1 en posición relacionada con la simetría, Csym). El área de interfaz tiene 440 Å2 y se establece a través de siete enlaces de hidrógeno directos (Tabla complementaria 1). Cuatro residuos sobresalen por encima de la interfaz: Asn143 y Arg146 de la cadena D y Asn174 y Asn176 de la cadena Csym (ninguno de los residuos de asparagina es un sitio de glicosilación). La interfaz también tiene varios contactos por agua.

Para caracterizar el tamaño y la forma del complejo NKR-P1:LLT1 en solución, hemos realizado ultracentrifugación analítica (AUC), termoforesis a microescala (MST) y dispersión de rayos X de ángulo pequeño junto con cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-SAXS ) experimentos. Los datos de AUC adquiridos dependen de la concentración y reflejan la naturaleza dinámica de este sistema interactivo, similar a los resultados de las mediciones SEC-SAXS. El ectodominio NKR-P1 humano libre es monomérico, con un coeficiente de sedimentación s20,w de 2,1 S que corresponde a una masa molecular estimada de 18 kDa, coincidiendo estrechamente con el valor esperado de 17,5 kDa. El ectodominio LLT1 forma un dímero estable no covalente (2,9 S) que no se disocia en monómeros, excepto en muy baja concentración, como se caracterizó previamente43,50. Al aumentar la concentración de carga de la mezcla equimolar NKR-P1:LLT1, el coeficiente de sedimentación del complejo también aumenta, alcanzando un valor de s20,w de 3,7 S en la concentración más alta analizada (Fig. 3c complementaria). Este valor, cuando se corrige por la falta de idealidad causada por la alta concentración de carga de proteína utilizada (18 mg/ml), corresponde a un valor estimado de coeficiente de sedimentación de concentración cero de proteína s020,w de 4.5 S, y una partícula moderadamente alargada con aproximadamente dimensiones de 10–15 × 4–5 × 4–5 nm. Eso se compara bien con las dimensiones de 8–10 × 5–6 × 4–5 nm esperadas para los posibles ensamblajes de interacción NKR-P1:LLT1 observados en la estructura cristalina del complejo, es decir, monómero:dímero:monómero o dímero:dímero (tenga en cuenta que mientras que las cadenas de N-glicanos no están presentes en la estructura del complejo desglicosilado, estuvieron presentes durante todos nuestros análisis en solución).

Para comprender si el modo de interacción secundario observado dentro de la estructura cristalina también se utiliza en la solución, diseñamos un mutante triple N120R, R153E, K169A de LLT1 (LLT1SIM), eliminando así los tres contactos más fuertes en la interfaz de interacción secundaria LLT1 (Fig. 4d). El mutante LLT1SIM se expresó y purificó de la misma manera que el LLT1 de tipo salvaje y mostró un espectro de CD comparable (Fig. 3a complementaria). La serie de concentración de mezcla equimolar de NKR-P1:LLT1SIM alcanzó un valor de s20,w de 3,3 S (correspondiente a un valor de s020,w estimado de 3,9 S), que muestra claramente la formación del complejo de un tamaño más pequeño en comparación con el NKR de tipo salvaje -Mezcla de P1:LLT1, posiblemente un conjunto de monómero:dímero (Fig. 3d complementaria). Mediante la integración de las curvas c(s) de distribución de tamaño continua completa y el trazado de los valores S promedio ponderados resultantes frente a las concentraciones de proteínas LLT1 utilizadas, se construyeron isotermas de unión para ambas series de dilución y, en primer lugar, se ajustaron mejor al modelo de unión de heteroasociación más simple. A + B ⇔ AB, donde A es el dímero LLT1 y B es el monómero NKR-P1 (Fig. 4a complementaria). LLT1SIM mostró una afinidad general aproximadamente tres veces más débil que el LLT1 de tipo salvaje, lo que se corroboró aún más mediante un análisis MST independiente utilizando NKR-P1 marcado con fluorescencia titulado con LLT1 o LLT1SIM (Fig. 4b complementaria). Para analizar la diferencia entre LLT1 de tipo salvaje y LLT1SIM con respecto a la unión del segundo monómero NKR-P1, también ajustamos mejor los datos usando el modelo A + B ⇔ AB + B ⇔ BAB (Fig. 4c complementaria). Mientras que para el LLT1 de tipo salvaje esto mejoró el ajuste y proporcionó dos valores de KD diferentes, posiblemente correspondientes a los modos de interacción primario y secundario, para LLT1SIM, los valores de KD ajustados permanecieron sin cambios, refutando la unión del segundo monómero NKR-P1. De manera similar, cuando los datos de AUC y MST se ajustaron globalmente junto con los parámetros de AUC fijados en los valores de mejor ajuste anteriores, los datos de LLT1SIM MST se pudieron ajustar igualmente bien con los modelos AB y BAB. Por el contrario, el ajuste es deficiente para el modelo AB en el caso de LLT1 de tipo salvaje (Fig. 4d complementaria). En conjunto, nuestros datos muestran que la interfaz de interacción secundaria no es solo un contacto de cristal, sino que contribuye significativamente a la afinidad general de la interacción NKR-P1:LLT1.

Es improbable observar conjuntos de orden aún mayor en el experimento de velocidad de sedimentación AUC, dada la cinética rápida de esta interacción, la larga escala de tiempo del experimento y el hecho de que la concentración de proteína disminuye constantemente a lo largo del límite de sedimentación. Sin embargo, la estructura cristalina del complejo NKR-P1:LLT1 sugiere una disposición en forma de cadena de dímeros de receptor:ligando. Para determinar si dichos ensamblajes existen en la solución, realizamos un análisis SEC-SAXS de la mezcla equimolar NKR-P1:LLT1 a una concentración de carga de 15 mg/ml. Se observaron dos picos de absorbancia a 280 nm, correspondientes a dos picos SAXS distintos, en el experimento SEC-SAXS (Fig. 5). Para un análisis más detallado, muestreamos cuatro intervalos de datos del primer pico y dos intervalos de datos del segundo pico y fusionamos por separado los datos dentro de estos intervalos (Fig. 5 y Fig. 5 complementaria). El radio de giro calculado a partir de la señal SAXS disminuye constantemente con el volumen de retención. Dos pequeñas mesetas en el pico principal sugieren un equilibrio dinámico entre la formación de complejos y la disociación (Fig. 5). Como resultado, las curvas de dispersión fusionadas no pudieron ajustarse bien a las curvas de dispersión simuladas a partir de una sola estructura del complejo NKR-P1:LLT1 o sus componentes. Por lo tanto, construimos modelos de ensamblajes del complejo NKR-P1:LLT1 en diferentes longitudes (número de cadenas de proteínas), considerando todas las permutaciones posibles del orden de las moléculas usando solo modos de interacción primarios, solo secundarios o ambos de manera alterna. . La biblioteca resultante de todos estos modelos (en total, 49 estructuras diferentes) fue luego utilizada por el software OLIGOMER para ajustar mejor los intervalos de datos muestreados (Figura 5 complementaria), así como las curvas experimentales SAXS individuales (Datos complementarios 1). Con este enfoque, los datos SAXS muestreados se ajustan razonablemente bien a las curvas de dispersión calculadas superpuestas de grupos de estructuras complejas NKR-P1:LLT1 de estequiometría superior (χ2 1,29–3,47; tenga en cuenta que no se modeló la glicosilación completa, pero contribuyó a la dispersión ; Fig. 5 complementaria). Siguiendo el radio de giro continuamente decreciente calculado a partir de los datos SAXS, la estequiometría de las estructuras de mejor ajuste del complejo NKR-P1:LLT1 también disminuye constantemente con el volumen de retención. La curva de dispersión SAXS del primer pico se ajusta mejor con dos o tres dímeros LLT1 que interactúan en un oligómero en forma de cadena con dos o tres dímeros NKR-P1, la curva del segundo pico a un dímero LLT1 que interactúa con un NKR-P1 dímero en modo primario o secundario. En particular, OLIGOMER generalmente favoreció los ensamblajes que combinan modos de interacción primarios y secundarios contra modelos con los modos primario o secundario solos.

Superposición del perfil de cromatografía de exclusión por tamaño (línea negra) y la señal de dispersión SAXS (línea roja) para la mezcla equimolar NKR-P1:LLT1 a una concentración de carga de 15 mg/ml. Ambas señales muestran dos picos distintos. Para cada marco SAXS recopilado, el radio de giro se calculó utilizando AUTORG (círculos azules). Para un análisis más detallado, se seleccionaron seis intervalos de los datos SAXS y se fusionaron por separado (fotogramas 355–367, 368–378, 379–388, 389–399, 431–440, 481–491; indicados como columnas con sombreado diagonal). La curva de dispersión SAXS (a), la gráfica de Kratky (b) y la función de distribución de distancia de pares (c) para los intervalos 389–399 y 481–491 se muestran en el recuadro para la evaluación de la calidad de los datos fusionados. Los seis intervalos de datos combinados fueron luego analizados individualmente por OLIGOMER (Datos complementarios 1 y Figura complementaria 5). Se han depositado los datos de difracción del experimento SEC-SAXS (https://doi.org/10.17632/268ww2m4j3.1)81.

Para responder a la relevancia biológica de estos complejos de orden superior en el contexto de una célula viva, realizamos estudios de microscopía de localización de una sola molécula con una línea celular que expresa NKR-P1 y cuantificamos la distribución superficial de NKR-P1 con respecto a LLT1 o Enlace LLT1SIM. Se indujo a los transfectantes de NKR-P1 de longitud completa generados con el sistema piggyBac a expresar el receptor en una densidad limitada para permitir la microscopía de localización de una sola molécula. A continuación, las células se incubaron en presencia o ausencia de LLT1 o LL1SIM solubles, se fijaron y marcaron con anti-NKR-P1 AlexaFluor® 647 mAb. Se adquirieron imágenes de microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) y se utilizó el análisis de conglomerados de teselación de Voronoi para evaluar el efecto de LLT1 soluble en la organización a nanoescala de NKR-P1 en la superficie celular (Fig. 6a). En ausencia de LLT1, detectamos grupos de eventos fluorescentes con un área promedio de 1870 ± 777 nm2 (Fig. 6b) y un diámetro promedio de 41 ± 7 nm (Fig. 6c), en su mayoría grupos de eventos con un diámetro que va desde 10 a 40 nm (Fig. 6d), indicativo de homodímeros NKR-P1 doblemente marcados de AlexaFluor® 647 (aprox. 6 nm + 10 nm de error de enlace por cada mAb ±15 nm de precisión de localización; tenga en cuenta que el tamaño aparente de los grupos fluorescentes no se corresponde directamente con el tamaño de los grupos de receptores). La adición de LLT1 soluble aumentó significativamente el grupo observado de diámetros de eventos (a 47 ± 6 nm; p < 0.0001, Fig. 6c, d), el área (2713 ± 1180 nm2; p < 0.0001, Fig. 6b) y el número de eventos detectados en los grupos (38.8 ± 12.3; p < 0.0001, Fig. 6e), mientras que la densidad de eventos en los grupos se mantuvo sin cambios, como se esperaba (Fig. 6f). Además, el efecto de la adición de LLT1SIM en la organización a nanoescala de NKR-P1 fue estadísticamente indistinguible del control negativo, mientras que fue significativamente diferente del efecto de la adición de LLT1. Con base en la comparación relativa de estos tres estados de receptor distintos (libre, unido a LLT1 y unido a LLT1SIM), podemos suponer que la interfaz de interacción secundaria en LLT1 es necesaria para formar grupos de NKR-P1 a nanoescala tras la interacción. No se encontraron diferencias significativas en la densidad total de eventos por superficie celular interna (área evaluada) (Fig. 6g), lo que apunta a niveles de expresión estables de NKR-P1 a lo largo de la medición. En consecuencia, el tamaño de los nanoclusters de NKR-P1 aumenta (más allá de una unidad de homodímero) no por diferencias en los niveles de expresión de NKR-P1, sino porque LLT1 entrecruza dos o más homodímeros de NKR-P1.

Los transfectantes estables de NKR-P1 se incubaron en presencia o ausencia de LLT1 o LLT1SIM solubles, y la distribución de la superficie celular de NKR-P1 se controló mediante microscopía de superresolución. a Imágenes representativas de campo claro (BF) y dSTORM de transfectantes estables NKR-P1 HEK293 de longitud completa en portaobjetos recubiertos con PLL incubados sin (negro) o con LLT1 (rojo) o LLT1SIM (verde), fijados y teñidos con AlexaFluor® 647 marcado mAb anti-NKR-P1; las barras de escala representan 5 µm. Las regiones de 10 µm2 (cuadros rojos en imágenes dSTORM) se amplían y se muestran con los grupos correspondientes de mapas de eventos fluorescentes (CoE) y mapas binarios; las barras de escala representan 1 µm. b–g Análisis de los cambios relativos de la distribución de NKR-P1 de longitud completa inducidos por la presencia de sus ligandos solubles LLT1 o LLT1SIM: área promedio del grupo de eventos (b), diámetro promedio del grupo de eventos (c), distribuciones de tamaño del grupo de eventos diámetros superpuestos con funciones de distribución de Poisson (d), eventos promedio por grupo de eventos (e), densidad de eventos detectados por grupo de eventos (f) y densidad total de eventos detectados (g). En b, c y e, f, cada punto graficado representa el valor medio obtenido del análisis de la superficie interna total de una sola celda. El centro del diagrama de caja representa el valor medio general, los límites de la caja representan el rango intercuartílico y los bigotes representan ±SD. Los datos son de n = 45 células de control NKR-P1+ y n = 41 o n = 47 células NKR-P1+ incubadas con LLT1 o LLT1SIM en siete o cuatro experimentos independientes, respectivamente. ANOVA unidireccional con corrección de Bonferroni, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns. insignificante. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, analizamos el efecto de LLT1 soluble o LLT1SIM sobre el potencial inhibidor de NKR-P1 nativo expresado en la superficie de células NK recién aisladas en un ensayo de citotoxicidad mediado por células NK, investigando así más la influencia de la unión inducida por ligando de NKR-P1. entrecruzamiento en la señalización celular. Las células NK aisladas de la sangre de tres donantes sanos diferentes se activaron con IL-2 y se mezclaron con las células diana K562 en una proporción de 40:1 de células efectoras:células diana y se incubaron durante 4 h con tampón PBS como control negativo o con el soluble LLT1 o LLT1SIM (ambos en dos concentraciones diferentes). En ausencia del ligando NKR-P1, las células K562 son muy susceptibles a la lisis mediada por células NK (Fig. 7; control PBS, menos del 10 % de células K562 vivas). Como era de esperar, la lisis se bloqueó sustancialmente en presencia de LLT1 soluble. Por el contrario, la variante LLT1SIM con una interfaz de interacción secundaria mutada no pudo bloquear la citotoxicidad mediada por células NK. Como se observó por dSTORM en la superficie celular (Fig. 6), LLT1SIM no entrecruza NKR-P1 de manera eficiente. Este mutante tampoco puede señalizar a través de la vía del receptor inhibitorio NKR-P1. Por lo tanto, en función de los datos de microscopía y análisis de citotoxicidad, concluimos que el entrecruzamiento de NKR-P1 desencadenado por la ligadura de LLT1 es biológicamente relevante e indispensable para la señalización celular y requiere interacción en los modos de interacción primaria y secundaria.

Se incubaron células NK de tres donantes diferentes (azul, rojo y verde) y células diana K562 solo con tampón PBS (control negativo) o con las proteínas solubles LLT1 o LLT1SIM, ambas en concentraciones de 50 y 250 µM correspondientes a las concentraciones 1x y 1x. Valores de 5 × KD, respectivamente, analizados por el AUC para el modo de interacción principal (cf. Fig. 4 complementaria). Los gráficos de barras representan las medias de las células K562 vivas en cada condición con los resultados de los experimentos individuales trazados como círculos vacíos y los bigotes representan ± SD. Cuando correspondía, los datos se evaluaron estadísticamente mediante ANOVA unidireccional. Considerando p < 0,05 como estadísticamente significativo, el efecto inhibidor de LLT1 soluble difiere significativamente de LLT1SIM, que no difiere de la condición de control que carece de ligando NKR-P1. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Actualmente, solo hay dos complejos CTL:CTL NK receptor:ligando similares con estructura 3D conocida: NKp65:KACL37 humano y NKR-P1B:Clrb42 de ratón. Estos complejos homólogos son topológicamente similares al modo de interacción principal del complejo NKR-P1:LLT1 (Fig. 4b). La identidad de secuencia de la parte extracelular de NKR-P1 con NKp65 es del 33 % y con NKR-P1B murino del 42 %. En comparación, la identidad de secuencia de la porción extracelular de LLT1 con KACL es del 49 % y con Clrb murino del 51 %. La estructura del complejo NKp65:KACL humano comprende dos unidades NKp65 monoméricas que interactúan por separado y simétricamente con un ligando KACL dimérico. La estructura cristalina del complejo murino NKR-P1B:Clrb muestra dos dímeros de Clrb que interactúan con un dímero de NKR-P1B colocado entre ellos (cada dímero de Clrb interactúa con una de las dos cadenas de NKR-P1B). La disposición del complejo murino es similar a la estructura del complejo NKR-P1:LLT1 presentada aquí, aparte del hecho de que el complejo murino es simétrico mientras observamos dos interfaces de unión distintas, el modo de interacción primario y secundario de LLT1.

A pesar de las diferentes formas oligoméricas de los complejos NKR-P1:LLT1, NKR-P1B:Clrb y NKp65:KACL, la interacción primaria receptor:ligando es similar en los tres casos a nivel de superposición monómero:monómero: el par receptor:ligando de los monómeros se superponen básicamente a lo largo de toda la cadena. Las regiones estructuralmente más conservadas son generalmente láminas β conservadas secuencialmente en el núcleo de las proteínas. La Fig. 6a complementaria muestra en rojo los fragmentos con posición 3D conservada, tipo de aminoácido y longitud de al menos tres aminoácidos. Dichos criterios los cumplen estos fragmentos: en ligandos: KCFYFS (en residuos LLT1 humanos 85–90), NWT (95–97), WIGL (132–135), WKW (143–145) y WICSK (182–186) , y en los receptores: WIGL (en los residuos humanos NKR-P1 153–156) e ICQ (209–211). Por lo tanto, parece que para su interacción, la orientación mutua del andamiaje del receptor y el ligando es más importante que la interfaz de interacción real.

Notamos solo tres pares de interacción de aminoácidos conservados en la interfaz de interacción en al menos dos de los tres complejos homólogos. Se reúnen alrededor de los residuos Tyr165-Tyr171-Phe148, Arg175-Arg181-Arg158 y Tyr177-Tyr183-Phe160 del ligando (Tabla complementaria 2 y Figura complementaria 6a). Los residuos de arginina forman enlaces de hidrógeno equivalentes en los casos de Clrb y KACL. En LLT1, la arginina asume una conformación diferente y forma un enlace de hidrógeno intramolecular con Asn183. El modo de interacción principal en NKR-P1:LLT1 se basa principalmente en los contactos de la cadena principal que permiten una cinética rápida de kon/koff, lo que corrobora los hallazgos basados ​​en SPR publicados anteriormente39,40 y nuestro análisis de AUC. Por lo tanto, se forma un complejo topológicamente similar en los tres casos, aunque el mecanismo de reconocimiento intermolecular subyacente es semiindependiente del pliegue real y la composición de aminoácidos (Fig. 6b complementaria). Sin embargo, el modo de interacción secundario es exclusivo del complejo NKR-P1:LLT1 y no se encuentra en los otros complejos relacionados.

Y. Li and coworkers reported that the orientation of NKp65 bound to its ligand precludes the putative α2-centered dimerization of NKp6537. Similarly, a hypothetical NKp65 α1-centered dimer is also implausible based on steric hindrance and the lack of stabilizing interactions. This observation contrasts with the α1-centered dimerization of NKR-P1 present in both its unbound and complexed crystal structure. Interestingly, the single-nucleotide polymorphism (SNP) c.503 T > C of the human KLRB1 gene, causing the substitution of isoleucine 168 for threonine in the NKR-P1 CTLD, was reported to have a 37% frequency of the Thr168 alleleC polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e3335">51. The authors showed that the Thr168 isoform of NKR-P1 has a lower affinity to LLT1 and a weaker inhibitory effect on NK cells. They proposed that Ile168 forms a part of the interaction interface between NKR-P1 and LLT1, directly affecting LLT1 recognition by NKR-P1C polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e3339"> 51. Sin embargo, la estructura del homodímero NKR-P1 muestra que Ile168 se encuentra en la interfaz de dimerización en lugar de en la interfaz de interacción membrana-distal, más específicamente, en un pequeño bolsillo hidrofóbico dentro de la interfaz de dimerización (Fig. 3d). Por lo tanto, proponemos que la sustitución del residuo de isoleucina no polar con treonina polar causada por c.503 T > C SNP afecta indirectamente la afinidad de unión porque esta sustitución desestabiliza el homodímero NKR-P1 centrado en α1. La glicosilación a menudo impacta significativamente en la homooligomerización del receptor, como se evidenció recientemente para, por ejemplo, el receptor de activación de células NK NKp3052. La homodimerización de NKR-P1 también está regulada por sus glucanos; específicamente, los glicanos presentes en Asn116 y Asn157 (Fig. 3b). Las cadenas centrales de glicanos presentes en estos residuos contribuyen parcialmente a la interfaz de dimerización centrada en α1, pero al mismo tiempo, los glicanos chocan entre sí. Como resultado, la estabilidad del homodímero NKR-P1 centrado en α1 se mejora al anular la N-glicosilación en Asn157, dejando solo el glicano Asn116 en la interfaz del dímero (Fig. 3b complementaria). Curiosamente, un SNP c.470 A > G que causa la mutación N157S también figura en la base de datos de variación del genoma humano. Sin embargo, aún no se ha investigado la importancia clínica de la mutación N157S, aunque podría afectar significativamente la señalización de NKR-P1 al estabilizar su estado unido al ligando. El estado oligomérico del receptor podría así modular la afinidad de unión global de NKR-P1:LLT1. El complejo NKp65:KACL destaca por su alta afinidad (Kd ~ 0,67 nM)37 – ca. 3000 veces más fuerte que la de NKp80:AICL (Kd ~ 2,3 µM)9 y 70 000–130 000× que la de NKR-P1:LLT1 (Kd ~ 48 µM39; este estudio 90 µM). Debido a la afinidad de unión excepcionalmente alta de NKp65:KACL, cualquier interfase de dimerización centrada en α1 ancestral putativa puede haberse perdido en NKp65. Por el contrario, los receptores NKR-P1 y NKp80 pueden haber evolucionado para compensar su baja afinidad por sus ligandos utilizando la dimerización centrada en α1 y permitiendo un efecto de mayor avidez.

El análisis SPR de mutantes de un solo residuo de ambos socios de unión, realizado por J. Kamishikiryo y actualizado por S. Kita y sus colaboradores en base a la estructura LLT1 publicada39,40, identificó varios residuos clave de NKR-P1 y LLT1 esenciales para su interacción. y propuso varios pares de residuos que interactúan (Tabla complementaria 3). Los residuos mutados que tuvieron efectos adversos perjudiciales o moderados sobre la unión en estos estudios de SPR se encuentran principalmente en la interfaz de interacción primaria (Fig. 1 y Tabla complementaria 3), en LLT1: Tyr165, Asp167, Lys169, Arg175, Arg180 y Lys181, y en NKR-P1: Arg181, Asp183, Glu186, Tyr198, Tyr201 y Glu205. Sin embargo, los pares de interacción propuestos no siempre concuerdan con la orientación mutua de ambas proteínas observada en la presente estructura cristalina del complejo NKR-P1:LLT1. Por ejemplo, los pares LLT1/NKR-P1 sugeridos Tyr177/Tyr198 y Arg175/Glu200 se corresponden bien con nuestros pares de interacción observados LLT1:Tyr177:OH/NKR-P1:Ser199:O y LLT1:Arg175:N/NKR-P1:Glu200 :OE2, respectivamente. Por otro lado, el emparejamiento propuesto de Glu179 del bucle L6 LLT1 con Ser193 y Thr195 del bucle L5 de NKR-P1 solo se parece a los contactos de la estructura cristalina de Glu179 con Arg181 (bucle L3) y Tyr198 (hebra β4), ubicados cerca de NKR-P1 bucle L5. En contraste con los estudios de SPR, no observamos contacto entre Tyr165 y Phe152, aunque LLT1: Tyr165 se usa en la interfaz principal y Phe152 está cerca de la región de interacción NKR-P1 L0. Por último, no podemos confirmar el enlace directo sugerido entre LLT1:Lys169 y NKR-P1:Glu205. Aunque estos residuos están cerca uno del otro en el modo primario (la distancia más cercana de 4,3 Å), claramente no forman un enlace fundamental en la interfaz de interacción. Además, la cadena lateral Lys169 es bastante flexible, como sugiere la baja calidad de su mapa de densidad de electrones en el modo primario, en contraste con todas las demás cadenas laterales cercanas con posiciones bien definidas.

Debido a que el modo de enlace secundario observado en la estructura NKR-P1:LLT1 involucra una región diferente de LLT1 que la región utilizada en el modo de enlace primario, la orientación de LLT1 y NKR-P1 en este modo de enlace no coincide con los pares de interacción propuestos en los estudios SPR. No obstante, la interfaz de interacción NKR-P1 es muy similar en los modos primario y secundario; por lo tanto, algunos de los residuos de interacción NKR-P1 propuestos anteriormente también están involucrados en el modo secundario (Arg181, Asp183, Tyr198 y Tyr201). Curiosamente, el residuo LLT1:Lys169 establece varios contactos con NKR-P1 (Arg181, Ser199 y Glu200) en modo de interacción secundaria. Sin embargo, el par Lys169/Glu20539,40 propuesto anteriormente tampoco se observa en este modo, y estos residuos están aún más separados, alrededor de 11 Å. La presencia de Lys169 en las interfases de interacción primaria y secundaria de LLT1 sugiere que este residuo juega un papel importante en la formación general del complejo. En consecuencia, la mutación LLT1 Lys169Glu39,40 previamente informada conduciría a una co-localización de varias cadenas laterales negativas en la interfaz secundaria (Glu200 y Asp183 de NKR-P1, y Glu169 mutado de LLT1), lo que indica que la interrupción de la NKR La interacción -P1:LLT1 observada en los experimentos SPR anteriores probablemente resultó del debilitamiento de la interfaz secundaria en lugar de la primaria. J. Kamishikiryo posteriormente restauró la unión al introducir la mutación Glu205Lys en NKR-P1. Según nuestra estructura, este efecto se explicaría mediante el fortalecimiento de la interfaz primaria. Por lo tanto, los datos de interacción basados ​​en SPR publicados anteriormente concuerdan en gran medida con los modos de interacción observados entre NKR-P1 y LLT1 en la estructura cristalina actual, aunque algunos pares de interacción sugeridos anteriormente estaban mal asignados y no están presentes en ninguna de las interfaces de interacción.

Varios autores han sugerido previamente un efecto de avidez de la multimerización sobre la interacción que compensa la baja afinidad del complejo NKR-P1:LLT137,40,47. Curiosamente, en la estructura actual de este complejo, observamos la formación de una cadena de homodímeros NKR-P1 y LLT1 repetidos. Este multímero pseudolineal tiene una forma de zigzag en la que las partes próximas a la membrana de las dos proteínas están en lados opuestos (Fig. 8), y se basa estructuralmente en los homodímeros NKR-P1/LLT1 centrados en hélice alterna α1/α2. (el efecto de formación de cadenas) y la participación simultánea de los modos de interacción primarios y secundarios (efecto estérico). Por el contrario, un modelo multimérico construido artificialmente de NKR-P1:LLT1 comprometido solo en el modo primario muestra una cadena de homodímeros con una conformación no lineal, casi helicoidal (Fig. 6c complementaria). Además, las regiones del tallo de NKR-P1 chocan estéricamente y las regiones del tallo de LLT1 están expuestas fuera del núcleo complejo en muchas direcciones diferentes. Por lo tanto, tal multímero es poco compatible con el anclaje y la formación de la membrana celular dentro de la sinapsis inmune. NKR-P1: LLT1 involucrado solo en el modo secundario también formaría un multímero helicoidal con regiones de receptor y tallo de ligando apuntando en muchas direcciones diferentes fuera del núcleo complejo (Fig. 6d complementaria). Al mismo tiempo, cuando se unen al dímero LLT1 tanto en modo de interacción primaria como secundaria, las moléculas NKR-P1 vecinas crean un contacto accesorio mutuo de contribución energética no insignificante a la estabilidad de todo el conjunto (Fig. 4a, marcada con un estrella negra). Este contacto accesorio abarca una cantidad similar de enlaces de hidrógeno y un tamaño similar al de la interfaz de unión secundaria entre NKR-P1 y LLT1 (Figura complementaria 6e), y por lo tanto podría considerarse un elemento estabilizador adicional que favorece una combinación de la unión primaria y secundaria. modos en lugar de uno solo de ellos.

a Representation of four adjacent asymmetric units within the NKR-P1:LLT1 complex crystal, excluding the additional unrelated NKR-P1 dimer. The NKR-P1 (blue and cyan) and LLT1 (green and lemon) dimers alternate in primary (cyan and green) and secondary (blue and lemon) interactions, forming a chain-like structure. The schematic depiction of this arrangement is shown in the inset with the same color code. The black and white triangles represent N-termini positions, pointing behind and in front of the display plane, respectively. b Depiction of the hypothetical arrangement of the chain-like structure upon contact of an NK cell (bottom, blue) with a target cell (top, green) showing the crystal structure of two NKR-P1 dimers (cyan and blue) interacting with two LLT1 dimers (green and lemon) in the primary (cyan and green) and secondary (blue and lemon) modes. The first three N-terminal residues in the structures are highlighted in red. The flexible stalk regions connecting the N-termini and cell membranes are represented as speckled lines of the corresponding color-coding. The view on the right-hand side is clipped for clarity at the plane indicated on the left-hand side view. c Schematic depiction of NKR-P1 extracellular domain dynamics and possible ligand binding arrangements. NKR-P1 is expressed as a disulfide-linked homodimer; however, its CTLDs may undergo conformation change similar to monomer-dimer equilibrium. Such putative equilibrium would be shifted towards monomeric species for the wild-type protein and its I168T allelic variantC polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e3460"> 51. Al mismo tiempo, se promovería una disposición dimérica correspondiente al dímero no covalente observado en las estructuras cristalinas aquí descritas para la variante S159A (lado izquierdo). Dicho dímero NKR-P1 podría entonces interactuar con el ligando LLT1 afín (expresándose también como un homodímero unido por disulfuro y formando dímeros no covalentes estables con sus CTLD) en el modelo estándar sugerido anteriormente de interacción entre el receptor de células NK y el ligando CTL. (centro) o alternar con el ligando dimérico en la disposición similar a una cadena propuesta basada en la estructura cristalina compleja NKR-P1:LLT1 (lado derecho).

Para determinar si tales oligómeros tipo cremallera de NKR-P1:LLT1 ocurren no solo en cristal y hasta cierto punto en solución (Fig. 5 y Fig. 5 complementaria), sino también en la superficie celular, utilizamos microscopía de localización de molécula única para examine los transfectantes de NKR-P1 de longitud completa marcados con mAb anti-NKR-P1 AlexaFluor® 647 en presencia o ausencia de LLT1 y LLT1SIM solubles (Fig. 6). Observamos un aumento significativo en el grupo NKR-P1 de tamaño y área de eventos fluorescentes al agregar LLT1, pero no su mutante de modo de interacción secundario, LLT1SIM. Aunque la configuración experimental con un compañero de unión incrustado en la membrana y el otro presentado como soluble no describe completamente la realidad biológica del contacto intercelular, asumimos que limitar la interacción a un espacio bidimensional entre las membranas de dos células adyacentes en el el caso de proteínas disulfídicas de longitud completa solo lo fortalecería. Nuestro experimento tuvo como objetivo probar la hipótesis de la capacidad del receptor NKR-P1 para formar grupos (oligómeros reticulados) en el contexto de la membrana celular al unirse a las especies diméricas de LLT1. Esta configuración experimental nos permitió normalizar la concentración de LLT1 a lo largo de la medición y garantizar la presencia de LLT1 principalmente dimérico en la solución. Además, nuestros datos SEC-SAXS se ajustaron mejor con cadenas de multímeros en modos de interacción primarios y secundarios alternos (Fig. 5 complementaria), a pesar de que se incluyó la biblioteca completa de todos los modelos posibles, incluidos los basados ​​únicamente en el modo primario o secundario. en el análisis. Se obtuvieron valores de χ2 aceptables principalmente para modelos de multímeros que contenían la disposición alterna. Tomados en conjunto, concluimos que la combinación de ambos modos de interacción es necesaria para una interacción multimérica biológicamente plausible, como lo respaldan los resultados del ensayo de citotoxicidad mediada por células NK (Fig. 7).

Aunque tal multimerización funcional de NK CTLR se ha pasado por alto en su mayoría, la formación de nanoclusters similares está bien descrita para la interacción entre la familia de inmunoglobulinas de KIR y las glicoproteínas MHC de clase I53 o la interacción entre KIR2DL1 y NKG2D54. Además, se informó una red periódica similar a una cremallera de dímeros que interactúan en las estructuras cristalinas de los inmunocomplejos coestimuladores B7-1:CTLA-4 y B7-2:CTLA-455,56. Curiosamente, B7-1 se expresa en la superficie celular en un equilibrio dinámico entre monómeros y dímeros no covalentes. Tras la interacción con el receptor coestimulador CD28, B7-1 forma una red de interacción compuesta por homodímeros B7-1 y CD28. El desacoplamiento de esta interacción se ve facilitado por la disociación de B7-1 en monómeros, mientras que la inserción del dímero obligado de B7-1 conduce a una señalización anormal y prolongada entre las células presentadoras de antígenos y las células T57.

Aunque como proteínas de longitud completa, tanto LLT1 como NKR-P1 forman homodímeros disulfuro covalentes en la superficie celular7,36, hasta donde sabemos, el estado dimérico de sus ectodominios CTL aún no se ha evaluado en células vivas. Por el contrario, la formación del homodímero no covalente centrado en la hélice α2 del ectodominio LLT1 soluble se ha caracterizado previamente40,43,44 y es probable que también ocurra dentro de la proteína de longitud completa. El dímero centrado en hélice α1 de NKR-P1 humano utiliza menos contactos intermoleculares, tiene un área de superficie de contacto más pequeña que los CTLR diméricos centrados en hélice α2 y, por lo tanto, es menos estable. Sin embargo, se espera que su formación aumente en el contexto del homodímero de disulfuro del receptor NKR-P1 de longitud completa. Al mismo tiempo, la longitud de la región del tallo de NKR-P1 (25 aminoácidos) confiere suficiente flexibilidad para el equilibrio de monómero/dímero de CTLD dentro del homodímero de disulfuro del propio receptor de longitud completa, que luego se regularía aún más mediante polimorfismo y glicosilación. heterogeneidad en la interfaz de dimerización NKR-P1 (Fig. 8c, abajo a la izquierda). Por lo tanto, de manera similar al sistema B7-1:CD28, un equilibrio entre los estados monoméricos y diméricos de los ectodominios CTL, modificando y ajustando la capacidad de NKR-P1 para formar complejos estables de orden superior con LLT1, en consecuencia puede regular la fuerza y señalización del sistema NKR-P1:LLT1, mientras que el entrecruzamiento de NKR-P1 por LLT1 dentro de la sinapsis inmune puede proporcionar suficiente avidez para la transducción de señales estables por este complejo de interacción de baja afinidad.

En conclusión, los datos presentados muestran que la estructura cristalina del complejo NKR-P1:LLT1 constituye una nueva forma de multimerización del receptor de células NK tipo lectina tipo C:ligando en la superficie celular que explica cómo la unión del ligando supera la baja afinidad a través del receptor. entrecruzamiento dentro de la sinapsis inmune.

La forma H176C estabilizada del ectodominio LLT1 soluble (Gln72-Val191) se expresó transitoriamente en células HEK293S GnTI–, como se describió anteriormente44. El modo de interacción secundaria mutante LLT1SIM N120R, R153E, K169A se clonó y produjo de la misma manera. El dominio similar a la lectina de tipo C de la NKR-P1 humana se produjo de manera similar en células HEK293S GnTI– transfectadas de forma estable50. Brevemente, la construcción de expresión correspondiente al dominio CTL extracelular de NKR-P1 (Gly90-Ser225) se subclonó en el plásmido pOPINGGTneo (amablemente proporcionado por el Prof. Ray Owens, Universidad de Oxford), flanqueado por el líder de secreción N-terminal y por la etiqueta His C-terminal (con el ETG y el KHHHHHH en los extremos N y C de la proteína secretada, respectivamente). El cultivo en suspensión de células HEK293S GnTI–58 se transfectó con una mezcla 1:3 (p/p) del plásmido de expresión y polietilenimina lineal de 25 kDa. El conjunto de células transfectadas de forma estable se seleccionó en 200 ng/µl de G418 en tres semanas. Las proteínas secretadas se purificaron a partir de los medios recolectados mediante cromatografía de dos pasos: se realizó una IMAC en una columna Talon (GE Healthcare), seguida de SEC en un Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) en 10 mM HEPES pH 7,5 con NaCl 150 mM y NaN3 10 mM. Para microscopía dSTORM y ensayos de células NK in vitro (ver más abajo), el tampón se cambió por un PBS de grado de cultivo de tejidos (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM, pH 7,4). Para la desglicosilación, se añadió Endo F159 fusionado con GST en una proporción en peso de 1:100 a proteínas en tampón SEC con citrato 50 mM pH 5,5 y se incubó durante 2 ha 37 °C. A continuación, las proteínas desglicosiladas se purificaron mediante cromatografía de afinidad por lotes en resina Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare) seguida de SEC, como se describe anteriormente.

NKR-P1 glicosilado (estructura NKR-P1_glico): el ectodominio NKR-P1 humano soluble a 20 mg/ml en tampón SEC se cristalizó utilizando el método de difusión de vapor de gota sentada. Las gotas (100 nl de solución de reservorio y 100 nl de solución de proteína) se configuraron usando un robot Cartesian Honeybee 961 (Genomic Solutions) a 294 K. El reservorio constaba de 20 % (p/v) de PEG 3350, disodio 200 mM tartrato pH 7,2 (PEG/pantalla de iones, condición 36; Hampton Research). Se crioprotegió un cristal hexagonal con dimensiones de 150 × 150 × 20 µm sumergiéndolo en la solución del depósito con la adición de 25% (v/v) de etilenglicol.

NKR-P1 desglicosilado (estructura NKR-P1_deglico) – El ectodominio NKR-P1 humano soluble desglicosilado con Endo F1 se concentró a 12 mg/ml y se cristalizó como se describe anteriormente. El depósito constaba de 20 % (p/v) de PEG 3350, fluoruro de amonio 200 mM y cloruro de litio 200 mM, pH 6,2 (pantalla PEG/Ion, condición 3, pantalla Aditiva, condición 17; Hampton Research). Un cristal en forma de varilla de 50 × 50 × 150 µm se crioprotegió como se indicó anteriormente mediante la adición de glicerol al 25% (v/v).

Complejo NKR-P1:LLT1 (estructura NKR-P1:LLT1): los ectodominios humanos solubles NKR-P1 y LLT1 desglicosilados con Endo F1 se mezclaron en una proporción molar 1:1 y se concentraron a 8 mg/ml de concentración de proteína total. El complejo proteico se cristalizó como se describe anteriormente; Se sembraron gotas (200 nl del reservorio y 100 nl de soluciones de proteínas) con 50 nl de solución madre de cristales triturados en forma de aguja de NKR-P1 desglicosilado cultivados en PEG 3350 al 20 % (p/v), fluoruro de amonio 200 mM pH 6.2 (pantalla PEG/Ion, condición 3; Hampton Research). El depósito consistía en sulfato de amonio 200 mM, PEG MME 5000 al 20% (p/v), Tris 100 mM pH 7,5 (pantalla Proplex, condición 1-40; dimensiones moleculares). Un cristal de bipirámide tetragonal de dimensiones 30 × 30 × 80 µm se crioprotegió como se detalla anteriormente mediante la adición de glicerol al 25% (v/v).

Todos los datos de difracción se recopilaron en Diamond Light Source (Harwell, Reino Unido) en la línea de luz I03 utilizando una longitud de onda de 0,97625 Å y un detector PILATUS3 6 M. La distancia del detector de cristal se fijó en 340 mm, el tiempo de exposición por imagen fue de 0,02 s, el ancho de oscilación fue de 0,1° y la temperatura fue de 100 K. Se recopilaron 7200 imágenes para cada conjunto de datos. En el caso del complejo NKR-P1:LLT1, finalmente solo se utilizaron 5000 imágenes para el procesamiento de datos. Todas las imágenes de difracción se indexaron e integraron con el paquete XDS60, se escalaron con AIMLESS61 y el 5 % de los reflejos seleccionados al azar se utilizaron como un conjunto libre de R. El problema de la fase se resolvió mediante reemplazo molecular – NKR-P1_glico: en el programa BALBES62 utilizando la estructura del receptor de células NK humanas KLRG1 unido a E-cadherina (https://doi.org/10.2210/pdb3FF7/pdb)63; NKR-P1_deglyco: 6 cadenas encontradas en PHASER64 utilizando NKR-P1A murino (https://doi.org/10.2210/pdb3T3A/pdb)65 se completaron con 2 cadenas encontradas en MOLREP66; NKR-P1:LLT1: 4 cadenas encontradas en BALBES como cadenas NKR-P1 (usando la estructura de la dectina-1 murina, https://doi.org/10.2210/pdb2BPD/pdb)48 se completaron con dos cadenas más en MOLREP, y las 6 cadenas se reinterpretaron manualmente como 4 cadenas NKR-P1 y como 2 cadenas LLT1. El refinamiento se realizó con REFMAC567 y la edición manual en COOT68. El último ciclo de refinamiento se completó utilizando todos los reflejos. Los parámetros finales de procesamiento y estructura de datos se describen en la Tabla 1.

NKR-P1_glico: la estructura, que comprende un dímero del NKR-P1 CTLD humano glicosilado, está bien definida en general en el mapa de densidad de electrones, lo que corresponde a la alta resolución de la estructura (1,8 Å). La glicosilación en la interfaz de dimerización no muestra las características superpuestas observadas en las estructuras de NKR-P1 desglucosilado (abajo). GlcNAc se modeló en Asn116 con ocupación total en ambas cadenas, mientras que la glicosilación en Asn157 no se observó en el mapa de densidad de electrones. Todas las cadenas de glicosilación modeladas (GlcNAc2Man5 en A/Asn169, GlcNAc2Man3 en B/Asn169 y GlcNAc en los residuos Asn116 en ambas cadenas) están bien localizadas en el mapa de densidad electrónica.

NKR-P1_deglyco: la unidad asimétrica consta de cuatro dímeros del NKR-P1 CTLD humano desglicosilado después de la primera unidad GlcNAc. La longitud de la parte localizada de la cadena proteica varía desde las cadenas más cortas A, F y G, con residuos modelados Leu91–Leu214, hasta la cadena más larga H, con residuos Gly90–Arg218. GlcNAc en el residuo Asn169 está bien localizado, mientras que las unidades GlcNAc unidas a Asn116 y Asn157 en la interfaz de dimerización están presentes en posiciones alternativas y superpuestas; el residuo Asn116 también muestra confórmeros alternativos. Las unidades GlcNAc adjuntas a Asn157 y Asn116 se modelaron con 0,5 ocupaciones, y solo se modelaron las unidades más distintas de cada par superpuesto (Tabla 1).

NKR-P1:LLT1: la unidad asimétrica contiene dos dímeros del NKR-P1 CTLD humano y un dímero del LLT1 CTLD. La estructura tiene un mapa de densidad de electrones bien definido y todas las cadenas de proteínas se pueden asignar sin ambigüedades. Los picos de diferencia más distintos corresponden a ligandos pequeños no interpretables. LLT1 tiene unidades GlcNAc bien localizadas en los residuos Asn95 y Asn147. Las unidades de GlcNAc localizadas de NKR-P1 son las mismas que las identificadas en la estructura NKR-P1_deglyco (párrafo anterior).

Los espectros de dicroísmo circular (CD) de tipo salvaje y S159A NKR-P1 y de tipo salvaje y SIM LLT1 se registraron utilizando un espectropolarímetro Chirascan Plus CD con software Pro-Data Chirascan (Fotofísica aplicada) y una celda de cuarzo de 0,1 cm de longitud de trayectoria. Los espectros se registraron en el rango de longitud de onda de 195 a 260 nm en pasos de 1 nm a temperatura ambiente. Las concentraciones de muestra fueron de 0,2 mg/ml y 0,3 mg/ml para muestras de proteína NKR-P1 y LLT1, respectivamente, en tampón de muestra HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. La señal de CD se expresó como elipticidad, y los espectros resultantes se restaron del tampón. La composición de la estructura secundaria se analizó utilizando el software CDNN 2.1 (Fotofísica aplicada).

La formación del complejo NKR-P1:LLT1 y la dimerización del mutante NKR-P1 S159A se analizaron en una ultracentrífuga analítica ProteomeLab XL-I (Beckman Coulter)69. Para el experimento de velocidad de sedimentación, muestras de NKR-P1 glicosilado, LLT1 y sus mezclas equimolares con concentraciones crecientes en tampón SEC se centrifugaron en el rotor An-50 Ti (Beckman Coulter) a 48 000 rpm a 20 °C y 150 exploraciones con Se registró una resolución espacial de 0,003 cm en pasos de 5 minutos usando óptica de absorbancia. La centrífuga se hizo funcionar usando el software ProteomeLab (Beckman Coulter). La densidad del tampón y los volúmenes específicos parciales de proteína se estimaron en SEDNTERP (http://www.jphilo.mailway.com). Los datos se analizaron con SEDFIT70 utilizando el modelo de distribución continua c(s). Las isotermas de unión (y las figuras que ilustran los datos de AUC) se prepararon en GUSSI71 y luego se ajustaron mejor en SEDPHAT72 usando modelos de heteroasociación A + B ⇔ AB o A + B ⇔ AB + B ⇔ ABB, donde A es el dímero LLT1 y B es monómero NKR-P1, respectivamente. Solo KD y los coeficientes de sedimentación de AB o ABB flotaron en el ajuste; los demás parámetros se mantuvieron constantes en valores conocidos.

Para las mediciones de termoforesis a microescala (MST) de las interacciones NKR-P1:LLT1 y NKR-P1:LLT1SIM, el NKR-P1 se marcó fluorescentemente con Atto 488 NHS-éster (Merck) a pH 6,5; el exceso de marcador se eliminó por cromatografía de exclusión por tamaño. Se mezcló NKR-P1 100 nM marcado con fluorescencia con series de dilución de LLT1 o LLT1SIM y se analizó en capilares estándar en un monolito NT.115 utilizando el software MO.Control (NanoTemper), potencia de excitación LED al 30 % y potencia MST al 60 %. Los datos sin procesar se analizaron en PALMIST73; las isotermas exportadas se ajustaron mejor en SEDPHAT72 y las cifras se prepararon en GUSSI71.

Los datos de SEC-SAXS para el complejo NKR-P1:LLT1 se recopilaron en Diamond Light Source (Didcot, Reino Unido) en la línea de luz 21 utilizando un sistema HPLC Agilent 1200 con una columna Superdex 200 de 2,4 ml (GE Healthcare), un detector Pilatus P3-2M , radiación de 12,4 keV y distancia de muestra a detector de 4,014 m. Los ectodominios humanos NKR-P1 y LLT1 con glucanos GlcNAc2Man5 diluidos en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, NaN3 10 mM, pH 7,5 se mezclaron en una proporción molar de 1:1. Los datos se recogieron a 293 K para muestras de tampón y proteína a una concentración de carga de 15 mg/ml. Los datos en intervalos seleccionados (fotogramas 355–367, 368–378, 379–388, 388–399, 431–440, 481–491) se restaron con solvente en SCÅTTER (desarrollado por Robert Rambo en Diamond Light Source, https: //www.bioisis.net/tutorials/9) y luego en los intervalos combinados y caracterizados por separado usando el paquete ATSAS74. Como prueba de la calidad de los datos, la gráfica de dispersión, la gráfica de Kratky y la función de distribución de distancias de pares P(r) se muestran en la Fig. 5 para los intervalos 389–399 (un rango de datos de muestra desde el primer pico) y 481–491 (una rango de datos de la muestra desde el segundo pico). Los diagramas de dispersión y Guinier para todos los rangos de datos se muestran en la figura complementaria 5. La concordancia entre los datos SAXS y nuestra estructura cristalina 3D del complejo NKR-P1:LLT1 se evaluó utilizando OLIGOMER75. La biblioteca de modelos estructurales NKR-P1 y LLT1 que representan monómeros, dímeros y sus multímeros que interactúan en varias permutaciones de modos de interacción primarios y secundarios se generó en PyMOL a partir de las estructuras cristalinas resueltas en este documento mediante la aplicación de operaciones de simetría (en total, 49 modelos diferentes). Luego, se dejó que el algoritmo OLIGOMER seleccionara sus combinaciones para ajustarse mejor a todas las curvas de dispersión individuales y las curvas resultantes de los seis intervalos de datos combinados seleccionados (Datos complementarios 1 y Figura complementaria 5).

Se generaron transfectantes estables de NKR-P1 de longitud completa en la línea celular HEK293S GnTI– utilizando el sistema basado en transposones piggyBac con expresión de proteína inducible por doxiciclina76. Se prepararon muestras microscópicas a partir de células tratadas con 5 ng/ml de doxiciclina durante la noche. Las células se lavaron con PBS y se incubaron durante 1 hora a 37 °C con 8,4 mg/ml de LLT1 o LLT1SIM en PBS o PBS solo. Después de la incubación, se permitió que las células se asentaran en la superficie de portaobjetos de vidrio recubiertos con PLL durante 25 min a 37 °C. A continuación, las células se fijaron con PFA al 4 % y GA al 0,2 % durante 10 min a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con PBS. Para la tinción de anticuerpos, las células se bloquearon primero con BSA al 5 % durante 30 min y se tiñeron con el anticuerpo anti-CD161 humano Alexa Fluor® 647 (clon HP-3G10; BioLegend) a 10 µg/ml en solución de bloqueo durante 60 min. Las muestras se lavaron cinco veces con PBS antes de la fijación posterior con PFA al 4 % y AG al 0,2 % durante 10 min. Finalmente, las células se trataron con NH4Cl 15 mM y se lavaron dos veces con PBS. Las imágenes dSTORM se adquirieron con Elyra PS.1 utilizando el software de edición Zen Black (Carl Zeiss). Los marcadores fiduciales (FluoSpheres F8801; Thermo Fisher) se diluyeron en PBS y se dejaron reposar en la muestra durante 1 hora (la dilución final de la solución madre de perlas fue 100 000x). Antes de cada medición, el tampón se cambió por un tampón de imágenes basado en glucosa oxidasa/catalasa/MEA, y la muestra se selló con una cubierta de vidrio y silicona para evitar la oxidación del tampón. Para cada celda, se adquirieron 2 × 104 imágenes sin procesar en modo de iluminación HP TIRF con un tiempo de exposición de 15 ms, utilizando el 100 % de la potencia del láser de 642 nm y 100 ×, 1,46 de apertura numérica, objetivo de inmersión en aceite. Usamos el mismo lote y la misma concentración del anticuerpo para garantizar un etiquetado consistente dentro de las mediciones individuales para todos los experimentos. Además, siempre medimos las condiciones con y sin el ligando soluble en cada serie de mediciones individuales para garantizar una calidad general uniforme de los datos en todo el estudio.

Las imágenes dSTORM de súper resolución se reconstruyeron a partir de secuencias de imágenes sin procesar con el complemento ThunderSTORM77 para el software de procesamiento ImageJ78. La localización de subpíxeles de las moléculas se realizó ajustando modelos de función de dispersión de puntos gaussianos integrados utilizando el método de ajuste de estimación de máxima verosimilitud79. Las imágenes dSTORM reconstruidas se corrigieron para la deriva utilizando marcadores fiduciales y para múltiples localizaciones de una sola fuente mediante la fusión de eventos dentro de 20 nm que aparecían en fotogramas posteriores (con una brecha de 5 fotogramas). El análisis de conglomerados de teselación de Voronoi se realizó en ClusterViSu80 en una superficie celular interna completa (los bordes de las células y otras regiones concentradas de la membrana se excluyeron del análisis). Se eligió un valor de umbral de 250 comparando la distribución de los valores de la superficie del polígono de Voronoi entre localizaciones en las áreas experimentales y regiones aleatorias de la misma densidad de eventos. Los grupos que contenían menos de dos eventos fluorescentes se descartaron del conjunto de datos. Las medias múltiples se compararon con el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la corrección de Bonferroni en OriginPro 2018. Los gráficos muestran los valores medios y las barras de error representan la DE. Los valores de p > 0,05 se indican como no significativos; los valores de p estadísticamente significativos se indican con asteriscos (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

La influencia de LLT1 o LLT1SIM en la inhibición de la actividad citotóxica de las células NK primarias se evaluó mediante citometría de flujo. Se compraron capas leucocitarias para el aislamiento de células NK humanas del Instituto de Hematología y Transfusión de Sangre (IHBT, Praga, República Checa) como material para uso en investigación. El IHBT dispuso el consentimiento de los donantes. Las células NK primarias se aislaron mediante selección negativa usando un kit de aislamiento de células NK (Miltenyi Biotec) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células NK purificadas se cultivaron durante la noche a 1 × 106 células/ml en RPMI 1640 suplementado con FCS al 10 %, 100 unidades/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y 80 ng/ml de IL-2 (Sigma-Aldrich) para su activación. . Las células diana K562 se tiñeron con el kit de proliferación CellTrace Violet (Thermo Fisher). Después de la tinción, se mezclaron 1 × 104 células diana con células NK activadas en una proporción de 40:1 (E:T) y se añadieron proteínas LLT1 o LLT1SIM, manteniendo el volumen de reacción final en 20 μl (6,5 μl de K562 y 6,5 µl de suspensiones de células NK y 7 µl de soluciones madre concentradas de proteína en PBS, hasta una concentración final de proteína de 50 o 250 µM). Después de 4 h de incubación, la mezcla de células se centrifugó a 300 × g y se tiñó con 1 μg/ml de 7-AAD. Las células se analizaron con un citómetro de flujo BD LSR II y el software BD FACSDiva (BD Biosciences) en tres ensayos de citotoxicidad independientes realizados con células NK de tres donantes sanos diferentes por triplicado. Los datos se analizaron en el software FlowJo (BD Biosciences). La estrategia de activación para el análisis de citometría de flujo se muestra en la Fig. 7 complementaria. Los datos se presentan como una media de las mediciones con SD. Cuando corresponda, los datos se evaluaron estadísticamente mediante ANOVA unidireccional con valores de p < 0,05 considerados estadísticamente significativos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los archivos de factor de estructura y coordenadas refinados para las estructuras cristalinas de rayos X informadas en este estudio han sido validados por el Protein Data Bank (https://www.wwpdb.org) y depositados allí con los números de acceso de https://doi .org/10.2210/pdb5MGR/pdb (NKR-P1_glico), https://doi.org/10.2210/pdb5MGS/pdb (NKR-P1_deglico) y https://doi.org/10.2210/pdb5MGT/pdb (NKR- P1:LLT1). Los enlaces a las otras entradas de PDB en este documento son https://doi.org/10.2210/pdb2BPD/pdb, https://doi.org/10.2210/pdb2CL8/pdb, https://doi.org/10.2210/pdb3FF7/ pdb, https://doi.org/10.2210/pdb3T3A/pdb, https://doi.org/10.2210/pdb4IOP/pdb, https://doi.org/10.2210/pdb4QKI/pdb, https://doi. org/10.2210/pdb5J2S/pdb y https://doi.org/10.2210/pdb6E7D/pdb. Los datos de difracción se han depositado en el banco de datos SBGrid con los códigos 778 (NKR-P1_glyco; https://doi.org/10.15785/SBGRID/778); 779 (NKR-P1_deglico, https://doi.org/10.15785/SBGRID/779) y 780 (NKR-P1:LLT1; https://doi.org/10.15785/SBGRID/780). Los datos de difracción del experimento SEC-SAXS se depositaron en Mendeley Data (https://doi.org/10.17632/268ww2m4j31)81. El resultado total del análisis OLIGOMER de los datos SEC-SAXS está disponible como Datos complementarios 1. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Este estudio fue apoyado por las subvenciones de la Fundación Checa para la Ciencia 15-15181 S y 18-10687 S a OV, la subvención LTC17065 del Ministerio de Educación, Juventud y Deportes de la República Checa a OV (en el marco de la Acción COST CA15126 MOBIEU), los proyectos de la Agencia de Subvenciones de la Universidad Charles 161216 y 1378219 para JB y BK, y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000447). La microscopía se realizó en el Laboratorio de Microscopía Confocal y de Fluorescencia, cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional y el presupuesto estatal de la República Checa (proyectos no. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 y CZ.2.16/3.1.00 /21515) y apoyado por el gran proyecto de RI de Czech-BioImaging LM2018129. Los recursos computacionales fueron suministrados por el proyecto "e-Infrastruktura CZ" (e-INFRA LM2018140) proporcionado dentro del programa Proyectos de Grandes Infraestructuras de Investigación, Desarrollo e Innovación. Reconocemos el uso de métodos biofísicos CF de CMS, CIISB, Instruct-CZ Centre, respaldados por MEYS CR (LM2018127). Los autores desean agradecer al Dr. Carlos V. Melo por la revisión crítica del manuscrito. Los autores también agradecen el apoyo y el uso de recursos de Instruct-ERIC a través del programa piloto de I+D APPID 56 y 286 para OV y JB, y del proyecto BioStruct-X EC FP7 283570. El Wellcome Center for Human Genetics cuenta con el apoyo de la Bienvenida Trust (subvención 090532/Z/09/Z). Agradecemos a Diamond Light Source por el tiempo de haz (propuesta MX10627) y al personal de las líneas de luz I03 y 21 por su ayuda con la recopilación de datos.

jan blaha

Dirección actual: EMBL, Unidad de Hamburgo c/o DESY, Notkestrasse 85, 22607, Hamburgo, Alemania

Barbora Kalousková

Dirección actual: Instituto de Física Aplicada – Grupo de Biofísica, TU Wien, Getreidemarkt 9, 1060, Viena, Austria

Denis Cmunt

Dirección actual: Departamento de Oncología, Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, Universidad de Lausana, Chemin des Boveresses 155, 1066, Epalinges, Suiza

Samuel Pazicky

Dirección actual: Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Tecnológica de Nanyang, Nanyang Drive 60, 637551, Singapur, Singapur

Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad Charles, Hlavova 2030, 12800, Praga, República Checa

Jan Bláha, Barbora Kalousková, Ondřej Skořepa, Denis Cmunt, Samuel Pazicky, Edita Poláchová, Celeste Abreu & Ondřej Vaněk

Instituto de Biotecnología, Academia Checa de Ciencias, Centro BIOCEV, Průmyslova 595, 25250, Vestec, República Checa

Tereza Skálová, Jan Stránský, Tomáš Kovaľ, Jarmila Dušková, Jindřich Hašek & Jan Dohnálek

Departamento de Biología Celular, Facultad de Ciencias, Universidad Charles, Viničná 7, 12800, Praga, República Checa

Valeria Grobarová

División de Biología Estructural, Centro Wellcome de Genética Humana, Universidad de Oxford, Roosevelt Drive, OX3 7BN, Oxford, Reino Unido

Yuguang Zhao y Karl Harlos

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JB, OS, BK, SP, EP y CA contribuyeron a la expresión y purificación de proteínas; JB y YZ realizaron la cristalización de proteínas; YZ y KH realizaron las mediciones de difracción de rayos X; JB, TS, JS, TK, J.Du. y J.Do. contribuyó al procesamiento de datos y refinamiento del modelo; OS realizó la medición de datos SEC-SAXS; JB y TS realizaron el análisis de datos SAXS; OV realizó las mediciones y análisis analíticos de ultracentrifugación; JB y BK adquirieron y analizaron los datos de dSTORM; BK, VG y DC realizaron el ensayo de citotoxicidad NK; JB, TS, J.Do. y OV diseñaron los experimentos y escribieron el manuscrito con aportes críticos de JH

Correspondencia a Ondřej Vaněk.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Bláha, J., Skálova, T., Kalousková, B. et al. La estructura del complejo NKR-P1:LLT1 receptor:ligando de la célula NK humana revela un agrupamiento en la sinapsis inmunitaria. Nat Comun 13, 5022 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32577-6

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Recibido: 06 noviembre 2021

Aceptado: 05 agosto 2022

Publicado: 26 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32577-6

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