Circuito neuronal para autenticación social en el aprendizaje de canciones.

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4442 (2022) Citar este artículo

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Las interacciones sociales son esenciales cuando se aprende a comunicarse. En el habla humana y el canto de los pájaros, los bebés deben adquirir patrones de vocalización precisos y aprender a asociarlos con tutores vivos y no con fuentes miméticas. Sin embargo, el mecanismo neuronal de la realidad social durante el aprendizaje vocal sigue siendo desconocido. Aquí, caracterizamos un circuito neuronal para la autenticación social en apoyo del aprendizaje preciso de canciones en el pinzón cebra. Registramos la actividad neuronal en el centro de control del estado de atención/excitación, el locus coeruleus (LC), de aves juveniles durante el aprendizaje de canciones de un tutor adulto vivo. La actividad de LC aumentó con información social real, no artificial, durante el aprendizaje que mejoró la precisión y la solidez de la canción aprendida. Durante el aprendizaje de canciones sociales en vivo, la actividad de LC reguló la capacidad de respuesta neuronal selectiva de canciones a largo plazo en una región de memoria auditiva, el nidopalio caudomedial (NCM). De acuerdo, la inhibición optogenética de la señalización presináptica de LC en el NCM redujo la capacidad de respuesta neuronal del NCM al canto del tutor en vivo y el aprendizaje de canciones deteriorado. Estos resultados demuestran que el circuito neuronal LC-NCM integra evidencia sensorial de interacciones sociales reales, distintas de las características acústicas de las canciones, para autenticar el aprendizaje de canciones. Los hallazgos sugieren un mecanismo general para validar la información social en el desarrollo del cerebro.

En especies de vertebrados con comunicación vocal, el aprendizaje auditivo temprano es más efectivo cuando el entrenamiento acústico va acompañado de interacciones sociales auténticas con un tutor adulto vivo. La exposición vocal con interacciones sociales reales en bebés humanos desencadena el desarrollo de la detección de fonemas1, mientras que la exposición auditiva pasiva es insuficiente para el desarrollo exitoso del habla2. Del mismo modo, los pájaros cantores juveniles aprenden a cantar de manera efectiva a través de la comunicación vocal con tutores en vivo, pero desarrollan una calidad de canto deficiente después de la exposición pasiva a la reproducción grabada de las canciones del tutor3,4,5. En los pinzones cebra juveniles, el aprendizaje de canciones mejora cuando activan la reproducción de canciones6, lo que sugiere que el estado interno, como la atención o la motivación, mejora el aprendizaje. La evidencia reciente sugiere un papel para la neuromodulación en el aprendizaje de canciones. La sustancia gris periacueductal (PAG) del mesencéfalo facilita la copia vocal para la transmisión cultural a través de la señalización de dopamina5. Se sabe que otro importante centro de comando de neuromodulación para la señalización noradrenérgica (NE), el locus coeruleus (LC), modula la atención y la excitación, transmitiendo información del estado interno a través del cerebro. La actividad neuronal de LC modula procesos conductuales como la memoria a largo plazo, la percepción sensorial y la motivación para facilitar el aprendizaje y la memoria7,8,9,10,11. La exposición de aves juveniles a un tutor de canto vivo aumenta la expresión de genes tempranos inmediatos en las neuronas LC en comparación con los juveniles de control expuestos pasivamente a las mismas canciones a través de un altavoz4. Las neuronas LC se proyectan anatómicamente a la corteza auditiva superior aviar, el nidopalio caudomedial (NCM)12, un locus cerebral propuesto para la formación de la memoria de la canción tutora13,14. Recientemente informamos que un subconjunto de neuronas NCM responde selectivamente al canto del tutor y que las respuestas auditivas de esas neuronas aumentan en presencia de un tutor13,15. Sin embargo, aún se desconoce si la actividad neuronal de NCM puede integrar información social de un tutor, además de las características acústicas de la canción del tutor, a través de LC. En este estudio, registramos y manipulamos la actividad neuronal en el circuito neuronal LC-NCM de pinzones cebra juveniles que aprenden a cantar de un tutor que interactúa socialmente. Observamos una mayor actividad neuronal en el circuito neuronal LC-NCM durante la comunicación vocal con un tutor adulto vivo. Los juveniles, en los que el circuito neuronal LC-NCM se inhibió optogenéticamente durante la exposición a un tutor de canto en vivo, no aprendieron la canción del tutor, lo que sugiere que este mecanismo neuromodulador integra y autentica la información social concurrente con el procesamiento de patrones prosódicos para un aprendizaje preciso de la canción.

Los pinzones cebra juveniles bajo la tutela de un adulto macho vivo que interactúa socialmente desarrollan un aprendizaje de canciones más preciso y robusto en comparación con aquellos expuestos pasivamente a las canciones del tutor, y muestran una expresión génica temprana inmediata en el LC4, que se informa que controla los niveles de atención en los mamíferos8,9 ,10. Aquí registramos la actividad de una sola neurona en el LC o NCM de pinzones cebra juveniles que se movían libremente cuando estaban solos o interactuando socialmente con un tutor para ver si el circuito neuronal LC-NCM codifica información de interacciones sociales con un tutor para permitir el aprendizaje de canciones. Registramos 352 neuronas de LC o NCM durante el período de tutoría (Tabla complementaria 1). El número de neuronas registradas fue relativamente menor que estudios previos en roedores7,9,16,17 o estudios que utilizaron aves anestesiadas12,18,19. Sin embargo, los registros neuronales electrofisiológicos en aves juveniles que se mueven libremente están restringidos debido a su tamaño corporal y su postura erguida. Por lo tanto, nuestros datos fueron comparables con los estudios en los que se registró la actividad de una sola unidad en pájaros cantores que se movían libremente5,13. A las aves se les presentaron ~20 minutos de reproducción pasiva de canciones de cada uno de los cuatro estímulos de canciones diferentes: una canción de tutor futuro (TUT), dos canciones de pinzones cebra adultos conespecíficas (CON1 y CON2) y una canción heteroespecífica de un pinzón bengalí (HET). ). La sesión de reproducción (Reproducción 1) fue seguida por 60 a 120 minutos de exposición a un tutor de canto en vivo (LIVE TUT) con un intervalo de 30 minutos, luego otros 20 minutos de reproducción pasiva (Reproducción 2) con una duración de 30 minutos. largo intervalo de nuevo (Fig. 1a). Evidencia reciente en roedores informó una población neuronal LC heterogénea compuesta por un tipo de células noradrenérgicas y dos GABAérgicas en función de sus formas de onda y modos de activación16, por lo tanto, clasificamos 29 neuronas LC registradas de 12 juveniles en función de su tasa de activación como picos regulares o aumento rápido en función de sus tasas de disparo (Figura complementaria 1a-c). Las neuronas de picos rápidos mostraron duraciones y formas de picos similares (Fig. 1a complementaria a la izquierda, Fig. 1b complementaria). Por el contrario, las neuronas con picos regulares exhibieron una mayor variación tanto en la forma como en la duración de los picos (Fig. 1a complementaria a la derecha, Fig. 1b complementaria), lo que sugiere que las neuronas con picos regulares están compuestas de subtipos neuronales heterogéneos como se sugirió anteriormente en roedores16. Para ver claramente el efecto de la interacción social con un tutor en el aprendizaje de canciones, nos enfocamos en las actividades neuronales registradas en el primer día de tutoría cuando podemos comparar el efecto de la exposición al canto del tutor en vivo sin comprometer los efectos de la tutoría de días anteriores. Trece de las 29 neuronas se perdieron durante la presentación repetida de la canción o la exposición de la canción del tutor que duró algunas horas, de modo que las 16 neuronas restantes (7 de aumento rápido y 9 de aumento regular), que se registraron el primer día de tutoría, fueron analizado más a fondo para la capacidad de respuesta de la canción. Curiosamente, todas las neuronas LC de pico rápido detuvieron su disparo por un momento (1,62 ± 0,25 s, n = 7) en respuesta a la introducción del tutor en la jaula, pero ninguna neurona de pico regular detuvo su disparo (Fig. 1d). Tanto las neuronas LC regulares como las de pico rápido aumentaron su activación en respuesta a la reproducción pasiva de canciones (Fig. 1e complementaria). El aumento en el disparo se mantuvo a lo largo de la reproducción de la canción y el patrón de actividad de las neuronas LC varió a lo largo de las presentaciones repetidas de la misma canción, lo que indica que las respuestas neuronales no estaban asociadas con características o sílabas específicas de la canción. Las respuestas de las neuronas LC al canto LIVE TUT con interacciones sociales fueron mayores en comparación con aquellas con reproducción pasiva de TUT (Fig. 1b, c). En particular, después de una exposición a largo plazo al canto del tutor (~ 60 min), las neuronas LC aumentaron sus respuestas a las reproducciones de todos los estímulos de la canción, en comparación con las respuestas antes de la exposición al canto LIVE TUT (Fig. 1 b-e). Encontramos que algunas neuronas LC, que se registraron más tarde del segundo día de tutoría, mostraron respuestas ligeramente pero significativamente mayores a LIVE TUT que a la reproducción de TUT, pero no mantuvieron respuestas más altas después de escuchar LIVE TUT (Suplementario Fig. 1f). Sin embargo, encontramos que ninguna de las neuronas LC desarrolló respuestas auditivas selectivas a TUT incluso después de la exposición al canto del tutor el primer día de tutoría, ya que los valores d ', comparando las respuestas a TUT y otras canciones, estaban entre -0.5 a 0.5 (Fig. 1f ), y la fuerza de respuesta (RST) a cualquier canción específica no fue significativamente diferente de la de otras canciones antes y después de la exposición LIVE TUT (Reproducción 1 y 2) (ANOVA de dos vías seguido de prueba post hoc de Holm-Sidak, p> 0,05) (Fig. 1d).

a Dibujos esquemáticos del diseño experimental y la línea de tiempo (dph = días, después de la eclosión). Fuerza de respuesta media (RST) de las neuronas LC para tutorizar la reproducción de canciones (Reproducción 1 y 2), tutorizar el canto (LIVE TUT) (b) o la reproducción de diferentes canciones antes (Reproducción 1) y después (Reproducción 2) de escuchar LIVE TUT (d) ). Gráficos ráster de actividades de picos para una sola neurona LC antes, durante y después de LIVE TUT (c, barra de escala: 1 s) o de la reproducción de diferentes canciones antes (reproducción 1) y después (reproducción 2) de escuchar LIVE TUT (e, escala barra: 2 s) (los espectrogramas de canciones se muestran en la parte inferior). Recuadro: forma de onda de pico del mismo LC (c, media ± sd, barras de escala: 0,5 ms horizontal, 0,5 mV vertical). f Valores medios de d-prime para TUT sobre otros estímulos de canciones de neuronas LC antes (Reproducción 1) y después (Reproducción 2) de escuchar LIVE TUT. Los cuadros muestran el 25–75%, las líneas centrales están definidas por la mediana y los cuadrados abiertos por la media. Los bigotes incluyen todos los puntos de datos dentro de 1,5 IQR (rango intercuartílico) y los puntos "externos" son los puntos de datos que quedan fuera de la línea de los bigotes. Las áreas grises indican respuestas no selectivas (−0,5 < valor d' < 0,5). N = 8, n = 16 (b, d, f). TUT: canto tutor, CON1: canto conespecífico 1, CON2: canto conespecífico, HET: canto heteroespecífico, N: número de pájaros, n: número de neuronas. Media ± sem, *p = 0,046, ***p < 0,001 o p = 0,0000251 (HET), prueba t de Student bilateral (HET, d) o prueba de suma de rangos de Mann-Whitney bilateral (b, d) . Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Los dibujos de pájaros en a fueron creados por Nicolas Baudoin.

En contraste con la actividad de LC, un subconjunto de neuronas en el NCM aumentó su RST específicamente a la reproducción de TUT, pero no a otras canciones después de la exposición a LIVE TUT (Figuras complementarias 2a, b). Se registraron ochenta neuronas NCM de cinco juveniles en el primer día de tutoría, y 57 de ellas eran neuronas de punta ancha (BS) según su forma de punta y velocidad de activación13. Encontramos que la mayoría de las neuronas BS mostraron mayores respuestas al canto LIVE TUT que a la reproducción de la canción TUT (Fig. 2a, Reproducción l vs LIVE TUT), pero el RST a la reproducción TUT volvió a un nivel similar después de escuchar el canto LIVE TUT (Fig. 2a, Reproducción l vs 2, Fig. 2d complementaria). Sin embargo, encontramos un subconjunto de neuronas BS NCM (n = 12) que mostraron mayores respuestas al canto LIVE TUT mientras mantenían sus patrones de disparo alineados con la canción (Fig. 2b, d, Reproducción l vs LIVE TUT) y mantuvieron sus mayores respuestas a TUT reproducción incluso después de la exposición a LIVE TUT (Fig. 2b, d, Reproducción 2). Esas neuronas respondieron selectivamente a las canciones TUT después de escuchar LIVE TUT y no aumentaron el RST a las reproducciones de otras canciones (Fig. 2c y Fig. 2a complementaria, b). El RST a TUT fue significativamente más alto que el de la reproducción de cualquier otra canción después de escuchar LIVE TUT (Reproducción 2), mientras que no fue antes de LIVE TUT (Reproducción 1) (ANOVA de dos vías seguido de prueba post hoc de Holm-Sidak , p < 0,05) (Fig. 2b complementaria). La proporción de neuronas que muestran respuestas selectivas a la reproducción de TUT, pero no a otras canciones (neuronas selectivas de TUT), aumentó significativamente (de tres a 12 neuronas) después de escuchar LIVE TUT (Fig. 2e, f). Examinamos además si el aumento de la canción RST a TUT y/o las proporciones de neuronas selectivas TUT ocurrieron en los últimos días de tutoría. Encontramos una pequeña cantidad de neuronas (n = 4) que aumentaron su reproducción de RST a TUT y comenzaron a mostrar respuestas selectivas de TUT en el segundo día de tutoría. Pero después del tercer día de tutoría, no encontramos las neuronas que aumentaron la RST o la selectividad a la reproducción de TUT después de escuchar LIVE TUT (Fig. 2f, g). En el tercer o cuarto día de tutoría, algunos tutores no cantaron ninguna canción durante ~2 h de tutoría. En ambos casos, con o sin canto LIVE TUT durante las interacciones sociales con un tutor, no vimos el aumento de la reproducción de canciones RST a TUT o las proporciones de neuronas selectivas TUT (Fig. 2f, g). Descubrimos que la reproducción de RST a TUT de las neuronas BS selectivas de TUT fue significativamente mayor que la reproducción de otras canciones después de LIVE TUT (Reproducción 2), pero no antes (Reproducción 1) en el primer día de tutoría. Por el contrario, el RST a TUT fue significativamente mayor que el de la reproducción de otras canciones tanto antes como después de LIVE TUT después del segundo día de tutoría, independientemente de si un tutor cantó (ANOVA de dos vías seguido de prueba post hoc de Holm-Sidak, p < 0,05) (fig. 2g). Encontramos una fracción de neuronas BS que ya mostraban respuestas selectivas a TUT antes de escuchar LIVE TUT cantando en el tercer y cuarto día de tutoría (Fig. 2f). Esas neuronas no mostraron mayores respuestas al canto LIVE TUT, ni aumentaron su reproducción de RST a TUT después de estar expuestas a LIVE TUT (Fig. 2g y Fig. 2c complementaria). Además, encontramos en el primer día de tutoría que las neuronas NCM de picos más estrechos (NS) respondieron más, pero no significativamente más alto (p = 0.1) al canto LIVE TUT que a la reproducción de canciones TUT (Fig. 2e complementaria). Algunas neuronas del NS mostraron un aumento de la reproducción de RST a TUT después de escuchar el canto LIVE TUT, mientras que ninguna de ellas desarrolló respuestas selectivas a TUT, ya que también aumentaron su RST a otros estímulos de canciones (Figura complementaria 2f, g).

Fuerza de respuesta media (RST) de todas las neuronas BS NCM (a) o neuronas BS selectivas TUT (b, g) para tutorizar la reproducción de canciones (Reproducción 1 y 2), tutorizar el canto (LIVE TUT) (a, b) o reproducción de diferentes canciones antes (Reproducción 1) y después (Reproducción 2) de escuchar LIVE TUT (+) o de estar expuesto a un tutor silencioso (−) durante cuatro días de tutoría (g). c Valores medios de d-prime para TUT sobre otros estímulos de canciones de neuronas BS selectivas de TUT antes (Reproducción 1) y después (Reproducción 2) de escuchar LIVE TUT. Los cuadros muestran el 25–75%, las líneas centrales están definidas por la mediana y los cuadrados abiertos por la media. Los bigotes incluyen todos los puntos de datos dentro de 1,5 IQR (rango intercuartílico) y los puntos "externos" son los puntos de datos que quedan fuera de la línea de los bigotes. Las áreas grises indican respuestas no selectivas (−0,5 < valor d' < 0,5). d Gráficas ráster de la actividad de picos de la neurona BS NCM selectiva de TUT para tutorizar la reproducción de canciones 1 y 2 o LIVE TUT (espectrogramas de canciones que se muestran en la parte inferior) (barra de escala: 1 s). Recuadro: forma de onda de pico de la misma neurona BS selectiva de TUT (media ± sd, barras de escala: 0,5 ms horizontal, 0,5 mV vertical). Proporción de neuronas BS NCM que muestran selectividad a una canción (e, f) o no selectividad (e, Non-select.), antes (Reproducción 1) y después (Reproducción 2) de escuchar LIVE TUT. N = 5, n = 57 (a), n = 12 (b, c), n = 80 (e, f: 1° día+), n = 77 (f: 2° día+), n = 44 (f: 3° día+ ), n = 31 (f: 3er día−), n = 44 (f: 4º día+), n = 30 (f: 4º día−), n = 12 (g: 1er día+), n = 12 (g: 2° día+), n = 7 (g: 3° día+), n = 4 (g: 3° día−), n = 5 (g: 4° día+), n = 3 (g: 4° día−). BS: neurona de punta ancha, TUT: canto tutor, CON1: canto conespecífico 1, CON2: canto conespecífico, HET: canto heteroespecífico, N: número de pájaros, n: número de neuronas. Media ± sem, *p = 0,0242, ***p = 0,0000143, 0,0000518, prueba T de Student bilateral (a, b, g). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Las neuronas LC y NCM en los juveniles mostraron mayores respuestas auditivas a LIVE TUT con interacción social, y una fracción de las neuronas BS NCM desarrollaron respuestas selectivas a las canciones TUT después de la exposición a LIVE TUT. Se informó que las neuronas LC se proyectan anatómicamente al NCM en adultos12,17. Confirmamos la proyección de LC-NCM en juveniles mediante la inyección de vectores virales adenoasociados (AAV2/9-hSyn-Cre, AAV2/9-FLEX-GFP) en la LC. Encontramos axones positivos para GFP en el NCM que en su mayoría eran inmunorreactivos con anticuerpos DBH o TH, pero no con uno para GABA (Fig. 3a complementaria). Luego investigamos el grado en que la actividad neuronal de LC moduló la capacidad de respuesta auditiva de las neuronas en el NCM al inactivar optogenéticamente los terminales de LC en el NCM (Fig. 3a). Dado que encontramos que las neuronas NCM desarrollan respuestas selectivas de TUT en los primeros dos días de tutoría, y que algunos tutores no cantaron a los juveniles después de más de tres días, expusimos aves juveniles a un tutor durante tres días con estimulación optogenética. Inyectamos una mezcla viral (AAV-2/9-hSyn-Cre y AAV-2/9-FLEX-Arch-GFP) para expresar arquerodopsina en la CL (Fig. 3b). Luego, utilizando una optosonda (NeuroNexus, Buszaki16OCM16LP), registramos la actividad neuronal de las neuronas del NCM mientras simultáneamente inhibíamos los axones LC en el NCM, que en su mayoría eran DBH o TH positivos (Fig. 3b), optogenéticamente solo durante el período en que los juveniles escuchaban. LIVE TUT, pero no cuando simplemente interactuaban con un tutor (Fig. 3a). La mayoría de las neuronas BS NCM no respondieron a la reproducción de la canción TUT antes de escuchar LIVE TUT cantando con interacción social en el primer día de tutoría (Fig. 3c, Reproducción 1). No aumentaron su respuesta al canto LIVE TUT cuando las entradas LC en el NCM se inhibieron optogenéticamente (Fig. 3c, Optol + LIVE TUT), ni aumentaron su reproducción RST a TUT después de estar expuestos a LIVE TUT (Fig. 3c, Reproducción 2). Un pequeño subconjunto de neuronas BS NCM (n = 7), que exhibió una respuesta auditiva selectiva a la reproducción de TUT antes de la exposición de LIVE TUT cantando en el primer día de tutoría, no aumentó sus respuestas a LIVE TUT y la selectividad a TUT cuando la inhibición optogenética se aplicó durante LIVE TUT (Fig. 3d-f). La inhibición optogenética de los axones de LC en el NCM no cambió la tasa de disparo espontáneo de esas neuronas (2,63 ± 0,86 frente a 2,31 ± 1,09, Reproducción 1 frente a LIVE TUT+ Optoinhibición). Además, la proporción de neuronas BS selectivas de TUT no aumentó después de estar expuestas al canto LIVE TUT junto con la inhibición optogenética de los axones LC (Fig. 3g), en contraste con el grupo juvenil de control (jóvenes que expresaron GFP en el LC y recibieron la misma aplicación de láser en NCM durante LIVE TUT) en la que tanto la proporción de neuronas tutoras selectivas como la reproducción de RST a TUT aumentaron después de escuchar LIVE TUT (Figura complementaria 3b, c). Encontramos otro subconjunto de neuronas BS (n = 19), que respondieron a TUT pero también a la reproducción de otra canción (Fig. 4a, b, Reproducción 1) antes de ser expuestos al canto LIVE TUT en el primer día de tutoría. Mostraron respuestas significativamente disminuidas a LIVE TUT cuando se aplicó la inhibición optogenética durante LIVE TUT (Fig. 4a, b, Opto+LIVE TUT) y perdieron su capacidad de respuesta a TUT pero no a otras reproducciones de canciones en ambos 30 min (Fig. 4a, b y d, Reproducción 2) y 90 min (Fig. 4c, d, Reproducción 3) después de haber sido expuesto a LIVE TUT cantando con inactivación de LC. RST a TUT todo antes, 30 y 60 minutos después de cantar LIVE TUT no fue significativamente diferente de la reproducción de la otra canción (ANOVA de dos vías seguido de prueba post hoc de Holm-Sidak, p> 0.05) (Fig. 4d). Esos resultados sugieren que la activación de las entradas de LC al NCM por parte de un tutor de canto en vivo permitió que los circuitos neuronales del NCM adquirieran respuestas auditivas selectivas de TUT en neuronas específicas.

a Dibujos esquemáticos del diseño experimental y la línea de tiempo. b Arriba a la izquierda: Secciones parasagitales del LC que muestran que las neuronas del LC que expresan Arch-GFP son dopamina beta-hidroxilasa (DBH) positivas (magenta). Sección parasagital en el NCM que muestra terminales axonales de LC que expresan Arch-GFP son DBH positivo (magenta; arriba a la derecha) o tirosina hidroxilasa (TH) positivo (rojo) pero no GABA positivo (azul; abajo a la izquierda) (barras de escala 100 um: arriba a la izquierda) , 20 um arriba a la derecha y abajo a la izquierda). Abajo a la derecha: Proporción de terminales de axón Arch-GFP que son doblemente positivas para DBH, TH o GABA. Fuerza de respuesta media (RST) de todas las neuronas BS NCM (c) o TUT selectivas BS (d) para tutorizar reproducciones de canciones (Reproducción 1 y 2) o tutorar canto con inactivación optogenética de entradas LC (Opto+LIVE TUT). e Valores medios de d-prime para TUT sobre otros estímulos de canciones de neuronas BS selectivas de TUT antes (Reproducción 1) y después (Reproducción 2) del tutor auditivo cantando con inactivación optogenética de entradas LC. Los cuadros muestran el 25–75%, las líneas centrales están definidas por la mediana y los cuadrados abiertos por la media. Los bigotes incluyen todos los puntos de datos dentro de 1,5 IQR (rango intercuartílico) y los puntos "externos" son los puntos de datos que quedan fuera de la línea de los bigotes. Las áreas grises indican respuestas no selectivas (−0,5 < valor d' < 0,5). f Gráficos ráster de actividad de picos en una neurona NCM BS selectiva de TUT para tutorizar la reproducción de canciones 1 y 2 u Opto+LIVE TUT (barra de escala: 1 s). Recuadro: forma de onda de pico de la misma neurona BS selectiva de TUT (media ± sd, barras de escala: 0,5 ms horizontal, 0,5 mV vertical). g Proporción de neuronas BS NCM que muestran selectividad a una canción o ninguna selectividad (Non-select.) antes (Reproducción 1) y después (Reproducción 2) Opto+LIVE TUT. N = 6 (b–e, g), n = 83 (c), n = 7 (d, e), n = 110 (g). BS: neurona de punta ancha, TUT: canto tutor, CON1: canto conespecífico 1, CON2: canto conespecífico, HET canto heteroespecífico, N: número de pájaros, n: número de neuronas. Media ± sem b–d Prueba t de Student bilateral (c), prueba de suma de rangos de Mann-Whitney bilateral (d). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Los dibujos de pájaros en a fueron creados por Nicolas Baudoin.

a, c Gráficos ráster de actividad de picos en una neurona BS NCM no selectiva para tutorizar la reproducción de canciones 1 y 2, o tutorizar el canto con inactivación optogenética de entradas LC (Opto+LIVE TUT) (a, barra de escala: 1 s) o para reproducciones de diferentes canciones antes (reproducción 1) y después (reproducción 3) Opto+LIVE TUT (c, barra de escala: 2 s, espectrogramas de canciones mostrados en la parte inferior). Recuadro: forma de onda de pico de la misma neurona BS no selectiva (a, media ± sd, barras de escala: 0,5 ms horizontal, 0,5 mV vertical). b Izquierda, d fuerza de respuesta media (RST) de neuronas BS NCM no selectivas para tutorizar la reproducción de canciones (Reproducción 1 y 2), Opto+LIVE TUT (b) o reproducción de diferentes canciones antes (Reproducción 1) y después (Reproducción 3 ) Opto+LIVE TUT (d). b Derecha, valores medios de d-prime para TUT sobre otros estímulos de canciones de neuronas BS no selectivas antes (Reproducción 1) y después (Reproducción 2) Opto+LIVE TUT. Los cuadros muestran el 25–75%, las líneas centrales están definidas por la mediana y los cuadrados abiertos por la media. Los bigotes incluyen todos los puntos de datos dentro de 1,5 IQR (rango intercuartílico) y los puntos "externos" son los puntos de datos que quedan fuera de la línea de los bigotes. Las áreas grises indican respuestas no selectivas (−0,5 < valor d' < 0,5). N = 6, n = 19 (b, d). e Proporción de neuronas de NCM que muestran un aumento o disminución en su RST para tutorizar la reproducción de canciones después de escuchar LIVE TUT con inhibición optogenética de LC (Optoinhibición, izquierda) o estimulación con láser de control (Control, derecha) en el NCM. N = 6 y 6 (Optoinhibición y Control, respectivamente), n = 110 y 138 (Optoinhibición y Control, respectivamente). BS: neurona de punta ancha, TUT: canto tutor, CON1: canto conespecífico 1, CON2: canto conespecífico, HET: canto heteroespecífico, N: número de pájaros, n: número de neuronas. Media ± sem, *p = 0,023, ***p < 0,001, Prueba bilateral de suma de rangos de Mann-Whitney (b, d). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Durante el período de tres días de tutoría, la mayoría (76,4%, 84/110 neuronas) de las neuronas NCM no mostraron cambios significativos en su reproducción de RST a TUT en juveniles donde la exposición a LIVE TUT se combinó con la inactivación del axón LC. Otro 17,3 % (n = 19) de las neuronas NCM, predominantemente neuronas BS (68,4 %, n = 13), disminuyó su reproducción de RST a TUT (Fig. 4e, optoinhibición, izquierda). Por el contrario, en los juveniles de control que expresaron GFP en el LC y fueron expuestos al canto del tutor junto con la aplicación de láser, aproximadamente la mitad de las neuronas NCM (51,5 %, 71/138 neuronas) aumentaron su reproducción de RST a TUT, la mitad (45,1 % , n = 32) de las cuales eran neuronas BS (Fig. 4e, Control, derecha). Si bien el número era pequeño, un subconjunto de neuronas NS silenciosas (n = 9) se activó solo cuando los terminales LC se inhibieron optogenéticamente (alineados con el láser en lugar del inicio de la canción, Fig. 4a, b complementaria). Estos resultados sugieren que la comunicación vocal con un tutor es esencial para modular la actividad del circuito neuronal en el NCM a través de entradas funcionales del LC para adquirir una capacidad de respuesta auditiva selectiva de canciones en el circuito neuronal LC-NCM.

Nuestros hallazgos demuestran que las neuronas NCM no pudieron desarrollar respuestas auditivas selectivas a TUT si las entradas LC-NCM se desactivaron durante la exposición de un menor al canto de un tutor en vivo. A continuación, examinamos si las entradas de LC al NCM son necesarias para que los jóvenes aprendan canciones interactuando socialmente con un tutor. Las aves juveniles a las que se les habían realizado registros electrofisiológicos con inhibición optogenética (o aplicación de láser en el grupo control) se criaron de forma aislada hasta la edad adulta. Luego grabamos su canto adulto y medimos la similitud con el canto de su tutor (Fig. 5a)20. Las canciones de las aves cuyas entradas de LC al NCM se desactivaron durante el canto del tutor con interacción social en vivo fueron significativamente menos similares a las canciones del tutor en comparación con las canciones de las aves de control (Fig. 5b, c). La comparación adicional de la similitud de la canción entre las canciones del pinzón cebra adulto y otros estímulos de canciones a los que estuvieron expuestos en el período juvenil, mostró poca similitud en cualquiera de las canciones tanto en el control como en las aves inactivadas con LC, lo que indica un aprendizaje deficiente de los estímulos de reproducción de canciones (Fig. 5c ). En conjunto, esos resultados sugieren que la exposición pasiva a la reproducción de canciones no condujo a un aprendizaje sustancial, mientras que la exposición social a un pájaro cantor vivo solo tuvo un efecto si el circuito neuronal LC-NCM estaba activo durante el aprendizaje. Para investigar si las similitudes menores con las canciones del tutor fueron causadas por la pérdida de la capacidad de cambiar los patrones motores vocales con la inactivación de LC, rastreamos la similitud de las canciones juveniles con su forma adulta final. Las aves juveniles de control aumentaron gradualmente la similitud de su canto con su canto adulto final, lo que indica un aprendizaje flexible de su canto a su forma adulta (Fig. 5d). Además, las aves de control desarrollaron sílabas menos variables, mientras que las aves que escucharon el canto del tutor durante la inactivación del circuito LC-NCM siguieron cantando sílabas ruidosas en adultos (mayor valor de entropía y bondad de tono, Fig. 5e), similar a la de las aves aisladas. poco después de la eclosión21. Sin embargo, la inactivación de LC no cambió la estructura acústica de los patrones vocales innatos, las llamadas Tets, Stacks y Cackle, ya que el valor de entropía y la bondad de tono de esas llamadas no fueron diferentes durante el desarrollo entre los juveniles de control y los inactivados con LC (Figura complementaria 5a, b), lo que sugiere que la inactivación de LC no condujo a déficits motores. Juntos, estos resultados indican que las entradas de LC al NCM son necesarias para que los jóvenes aprendan la calidad adecuada de la canción a partir de la comunicación vocal con un tutor, que proponemos como un mecanismo subyacente para el aprendizaje efectivo de canciones a través de interacciones sociales auténticas.

una línea de tiempo experimental sobre el desarrollo. b Espectrogramas de canto del canto tutor (arriba), cantos adultos de dos pájaros hermanos. Hermano 1 (optoinhibición): las entradas de LC se inhibieron optogenéticamente al escuchar el canto del tutor. Hermano 2 (control): las neuronas NCM se estimularon con láser al escuchar el canto del tutor (barra de escala: 0,2 s). c Puntuación media de similitud de canto de adultos con cada estímulo de canto en aves cuyas entradas de LC se inhibieron optogenéticamente (optoinhibición) o en aves cuyas neuronas NCM recibieron estimulación con láser (control) durante el canto del tutor. Los cuadros muestran el 25–75%, las líneas centrales están definidas por la mediana y los cuadrados abiertos por la media. Los bigotes incluyen todos los puntos de datos dentro de 1,5 IQR (rango intercuartílico). d Puntuación de similitud del canto con el canto adulto cristalizado de un ave en cada punto durante el desarrollo del canto después de escuchar el canto del tutor en aves cuyas entradas de LC se inhibieron optogenéticamente (optoinhibición) o en aves cuyas neuronas NCM recibieron estimulación con láser (control) durante el canto del tutor . e Gráficos de dispersión de la entropía media de las sílabas y la bondad de tono medio a lo largo del desarrollo del canto en aves con optoinhibición de LC (izquierda) y en aves de control (derecha), donde cada punto indica una sola sílaba. N = 6 y 6 (Optoinhibición y Control, respectivamente, c–e). TUT: canto tutor, CON1: canto conespecífico 1, CON2: canto conespecífico, HET: canto heteroespecífico, N: número de aves, dph: día posteclosión, "***" indica diferencias dentro del mismo grupo, "#" indica diferencias entre dos grupos de animales, media ± sem, #p = 0,00000533, ***p = 0,0000000514, 0,0000000277, 0,00000108, prueba t de Student bilateral. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Aquí, demostramos la modulación de la actividad del circuito neural LC-NCM en pinzones cebra juveniles expuestos al canto de tutor vivo pero no artificial. La inactivación de la proyección de LC a NCM durante el canto del tutor impidió que NCM desarrollara una capacidad de respuesta neuronal selectiva de canciones y que los juveniles aprendieran canciones. Llamamos a este mecanismo "autenticación social" para describir el requisito de codificación neuronal para un tutor adulto vivo que interactúa socialmente, por ejemplo, "auténtico". Funcionalmente, proponemos que un circuito de autenticación no procesa información vocal acústica de alta resolución, como la corteza auditiva, sino que, por el contrario, monitorea o "autentica" el contexto social en vivo durante el aprendizaje, como indica nuestro análisis de la actividad neuronal de LC.

Se sabe que la LC noradrenérgica modula la actividad sináptica en los circuitos neuronales involucrados en el aprendizaje de la comunicación social. En los mamíferos, la LC se ha relacionado con la neuromodulación del estado cerebral basada en la atención situacional (p. ej., lucha o huida) y la excitación, y las neuronas LC transmiten señales NE a través de la corteza en ratones, ratas, monos, humanos y pinzones cebra, y modulan percepción de una variedad de estímulos sensoriales7,8,9,10,11,16,17,22. La exposición a un tutor en vivo es una experiencia multisensorial que involucra modalidades auditivas, visuales, táctiles y olfativas. Nuestros datos actuales plantean la interesante pregunta de cómo el LC integra y autentica la información social multisensorial para la transmisión cortical al NCM. Descubrimos que el LC y el NCM reciben entradas anatómicas comunes de una región talámica auditiva, el núcleo ovoidalis (Fig. 6 complementaria), lo que sugiere que el circuito del NCM recibe entradas de avance, posiblemente neuromoduladoras, a través del LC cuando los jóvenes mantienen comunicación social con un tutor. . Como las respuestas neuronales de LC a la canción de un tutor no dependían de las características acústicas de la canción, mientras que, por el contrario, las neuronas en el área auditiva aguas arriba de NCM, como Field L, responden a las características acústicas de la canción23, sugerimos que NCM es un área candidata. que podría integrar tanto la información social como la acústica del canto de tutor en vivo para la memoria de canciones.

Nuestra observación de los efectos a largo plazo de la modulación NE en la activación de NCM es notable. La inactivación optogenética de LC durante el canto del tutor en vivo, pero no para otras interacciones sociales, alteró la capacidad de respuesta auditiva en el NCM que fue selectivo al canto del tutor autenticado durante varias horas. Los mecanismos sinápticos para la señalización de NE sobre la plasticidad a corto plazo en las neuronas corticales postsinápticas24 o LTP25,26 son bien conocidos, y se ha sugerido que la señalización de NE/DA derivada de LC en el hipocampo mejora la consolidación de la memoria a través de LTP. Aquí mostramos que la inhibición directa de la actividad de LC durante la audición de LIVE TUT evita el aprendizaje de canciones del tutor y sugiere además una contribución de LC a la formación de memoria a largo plazo. Las neuronas NCM del pinzón cebra cambian sus patrones de activación y la capacidad de respuesta auditiva a la infusión de NE o de un antagonista de los receptores adrenérgicos α12,17,27,28 principalmente al disminuir su tasa de activación espontánea y aumentar la precisión de las respuestas auditivas a las canciones12,28. Mostramos que la comunicación social con un tutor modula la respuesta auditiva cortical de larga duración (NCM) en los dos primeros días de aprendizaje social de un tutor, probablemente a través de las entradas de LC, pero no influyó en las neuronas que ya adquirieron una respuesta auditiva selectiva. Por el contrario, las neuronas LC no adquirieron la capacidad de respuesta selectiva de TUT y mostraron mayores respuestas a LIVE TUT incluso más tarde que el segundo día de tutoría. Esos sugieren que las experiencias de la canción del tutor social desencadenan la liberación de NE de las neuronas LC constantemente durante el desarrollo, mientras que la liberación de NE de LC podría causar plasticidad a largo plazo para formar un recuerdo de la canción del tutor en un subconjunto específico de neuronas postsinápticas (NCM) que podrían expresar receptores NE específicos en fase de aprendizaje auditivo durante el desarrollo. Nuestro estudio actual no aclara qué tipo o patrón de neuronas en el proyecto LC al NCM. Estudios adicionales sobre la conexión anatómica entre LC-NCM y la liberación de NE, la expresión del receptor en varios tipos neuronales en el NCM y la plasticidad sináptica en el NCM ayudarían a dilucidar el mecanismo del circuito neuronal subyacente de cómo la neuromodulación de NE da como resultado la adquisición de una respuesta auditiva selectiva en neuronas específicas.

Nuestros hallazgos complementan y amplían un estudio reciente sobre pinzones cebra que demuestra que la señalización por dopamina (DA), otro neuromodulador de monoamina, desde el PAG del cerebro medio hasta un área sensoriomotora, HVC, durante la tutoría de canciones en vivo y no artificial facilita la copia de canciones5. Ambos estudios muestran el requisito de un tutor en vivo para el aprendizaje vocal, pero en diferentes escalas de tiempo y etapas anatómicas de la vía sensoriomotora auditiva ascendente: DA a través del circuito PAG-HVC media la percepción aguda en HVC de acuerdo con su papel en la producción vocal, mientras que NE en el circuito LC-NCM modula la percepción de larga duración para la memoria auditiva de la canción. Juntos, los dos estudios sugieren la evolución de un sistema subcortical para la autenticación social, con señalización DA y NE trabajando en paralelo para monitorear continuamente la calidad del aprendizaje social para el refinamiento de las características acústicas de una canción para la memoria precisa de la canción y la transmisión cultural.

La literatura reciente describe una red cortical distribuida para la comunicación social en primates29,30. Nuestros resultados en pájaros cantores anotan este marco emergente, al explorar un circuito neuronal específico para autenticar la información social en el aprendizaje vocal. Desde una perspectiva evolutiva, los animales como los pájaros cantores que se comunican en entornos naturales complejos y ruidosos pueden haber desarrollado mecanismos neuronales para validar las interacciones sociales con tutores individuales específicos de la especie para garantizar una transmisión precisa del canto para la supervivencia y la reproducción. Por ejemplo, la hipótesis de "compartir el canto" sugiere que las hembras prefieren cantos simples y precisos con un linaje bien definido o un área geográfica31 donde la autenticación del tutor durante el canto puede ser un mecanismo de adaptación. Los estudios futuros deben abordar si la autenticación social dependiente de NE en el circuito LC-NCM facilita la codificación de la memoria a largo plazo de un tutor individual y su canción única, y si se pueden aplicar mecanismos similares en la adquisición del habla humana.

Los experimentos se realizaron siguiendo los protocolos experimentales aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad de Graduados del Instituto de Ciencia y Tecnología de Okinawa (OIST). Treinta y cuatro pinzones cebra machos nacidos y criados en nuestra colonia (14L: 10D condiciones de luz/oscuridad) se utilizaron en estos experimentos. Todas las aves se criaron en jaulas con sus padres y hermanos hasta 10 a 12 días después de la eclosión (dph), cuando se retiraron a sus padres. Posteriormente, los juveniles se criaron con sus madres y hermanos en una jaula colocada en una cámara de atenuación de sonido hasta los 54–56 dph cuando se sometieron a cirugía para la implantación del electrodo en el NCM o LC, o hasta los 33–35 dph cuando se inyectaron vectores virales. en la CL. Los juveniles, a los que se inyectaron vectores virales, se criaron con una madre y hermanos hasta el 54–56 dph cuando se sometieron a cirugía para la implantación de optoelectrodos en el NCM. Los juveniles a los que se les implantó un electrodo o un optoelectrodo, se alojaron individualmente en una cámara de atenuación de sonido hasta la edad adulta (después de 120 dph) cuando fueron sacrificados. Después de recuperarse de la cirugía (después de ~24–48 h), se registró la actividad neuronal de una sola unidad durante la exposición a estímulos de reproducción de canciones durante tres o cuatro días consecutivos, luego, durante los siguientes tres días, se introdujo un tutor en la jaula y los juveniles fueron expuestos al canto de un tutor en vivo (LIVE TUT) seguido de la reproducción de los mismos estímulos de la canción. Los juveniles a los que se les implantó un optoelectrodo en el NCM recibieron estimulación de pulso láser cuando un tutor estaba cantando.

La mezcla viral de pENN-AAV-hSyn-Cre-hGH (preparación viral addgene n.° 105555-AAV9, obsequio de James M. Wilson) y AAV-FLEX-Arch-GFP (preparación viral addgene n.° 22222-AAV9, obsequio de Edward Boyden) o AAV-pCAG-FLEX-EGFP-WPRE (addgene viral prep #51502-AAV9, un obsequio de Hongkui Zeng; en una proporción de 1:3) se inyectó unilateralmente en el LC (100-180 nL) de forma aislada. pinzón cebra macho juvenil (33-35 dph) a través de una pipeta conectada a un inyector de presión (Nanoject II; Drummond Scientific Company, Broomall, PA, EE. UU.) con coordinación estereotáxica (LC: ángulo de la cabeza: 27°, AP: −0,3 mm, ML: 0,9 mm, Profundidad: 5,8–6 mm, en relación con el centro del seno en Y) bajo anestesia con isoflurano (2,5–2,7 %). Después de aproximadamente 3 semanas (54–56 dph), los juveniles inyectados con AAV se sometieron a experimentación.

La actividad neuronal de una sola unidad se registró a partir de la LC en 12 pinzones cebra juveniles machos que se comportan libremente. Se implantó un único electrodo de tungsteno (WE3PT32.0A3, MicroProbes) conectado a un microimpulsor con coordinación estereotáxica (ángulo de la cabeza: 27°, AP: −0,3 mm, ML: 0,9 mm, DV: 5,7–5,9 mm, relativo al centro de seno en Y) y fijado al cráneo con cemento dental (kit Super-Bond C&B, Sun Medical, JAPÓN) bajo anestesia con isoflurano (2,5–2,7 %). A otro subconjunto de juveniles de pinzón cebra (n = 5) se le implantó una sonda de silicona de 16 canales (Buzsaki16-CM16LP, NeuroNexus) en el NCM con coordinación estereotáxica (ángulo de la cabeza: 45° interno, AP: 0,2 mm, ML: 0,5 mm , DV: 1,5–1,9 mm, en relación con el centro del seno en Y) de la misma manera descrita anteriormente. Después de la recuperación de la cirugía (~24–48 horas), el menor se colocó en una arena de grabación y se conectó a un escenario frontal (HST/8o25-GEN2-10P-G1-xR para LC o HST/16o25-GEN2-18P-2GP- G1 para NCM, (Plexon)) para registros de actividad neuronal (56–60 dph). Durante la presentación de la reproducción de la canción, se realizaron grabaciones neuronales ~1 h por día, 3 × 20 min para 10 repeticiones de cada canción, durante cuatro días consecutivos. Durante el canto del tutor en vivo, se realizaron grabaciones neuronales de 3 a 4 h por día, 20 min para 10 repeticiones de cada canción seguida de un descanso de 30 min y luego 1 a 2 h de un tutor presente en la arena con canto ocasional (10–2). 20 min) seguido de otro descanso de 30 min y una presentación de reproducción de canciones de 20 min, durante cuatro días consecutivos. Los estímulos de reproducción de canciones se editaron usando un código MATLAB personalizado (MATLAB 2018b, MathWorks) y se presentaron en un orden pseudoaleatorio usando un código LabVIEW personalizado (LabVIEW 2016 versión de 64 bits, National Instruments) y un dispositivo de adquisición de datos (NI USB-6341, National Instruments) que se utiliza para dividir la información de los estímulos de reproducción y enviarla a un canal de entrada analógica del sistema OmniPlex (Plexon) y al amplificador del altavoz (Miniamplificador Topping TP21 T-Amp Class T).

Las señales neuronales se amplificaron de 10 000 a 20 000 veces, se filtraron con paso de banda a 0,5 a 9 kHz y se digitalizaron (40 kHz) con el sistema OmniPlex (OmniPlex Software, PlexControl, Plexon). Los estímulos de las canciones se reprodujeron desde un altavoz ubicado en la parte superior de la arena, y toda la actividad vocal se registró a través de un micrófono (micrófono de solapa, C417 PP, AKG) junto con las grabaciones neuronales.

Después de completar los registros electrofisiológicos y el posterior registro del canto, se realizaron lesiones eléctricas (10 mA durante 10 s) y los sitios de registro se confirmaron histológicamente.

Para el registro de NCM combinado con optogenética, implantamos en el NCM una sonda de silicona de 16 canales (Buzsaki16-CM16LP, NeuroNexus). Las fibras ópticas se unieron a los cables de conexión (FCMH2-FCL, acoplador de 2 × 2 MM 50:50 200um 0.39NA FC/PC-LC férula, Thorlabs) durante las grabaciones de actividad neuronal (56–60 dph). Las grabaciones neuronales se realizaron de 5 a 6 h por día, 20 min para 10 repeticiones de cada reproducción de la canción, seguidas de un descanso de 30 min y luego de 1 a 2 h de presencia del tutor con canto ocasional combinado con pulsos de láser (10 a 15 mW, 589 nm). Yellow DPSS Laser with Fiber Coupled, Shanghai Laser & Optics Century Co.), seguido de otro descanso de 30 minutos, una presentación de reproducción de canciones de 20 minutos, un descanso de 90 minutos y una presentación de reproducción de canciones de 20 minutos, durante tres días consecutivos. Para inhibir optogenéticamente las actividades neuronales de los terminales axónicos de LC en el NCM durante el canto del tutor en vivo, cuando un tutor comenzaba a cantar con las primeras notas introductorias (comienzo de un combate), se aplicaba manualmente un pulso láser de 3 s utilizando Master 8 (Eight Channel Estimulador de pulso programable, MicroProbes) conectó el láser DPSS y una entrada digital del sistema OmniPlex. Si el tutor continuaba cantando cuando finalizaba un pulso láser de 3 s, se aplicaba otro pulso de 3 s, y así sucesivamente. El momento de la aplicación del pulso láser se registró junto con los datos electrofisiológicos. El comportamiento y las vocalizaciones de las aves se registraron y monitorearon continuamente usando una cámara y un micrófono instalados dentro de la jaula y conectados al software Ulead Video Studio y Avisoft-RECORDER (Avisoft Bioacoustics), respectivamente.

Las canciones de los juveniles experimentales se grabaron en una cámara de atenuación de sonido utilizando un Avisoft-RECORDER (Avisoft Bioacoustics) a través de un micrófono (micrófono lavalier, C417 PP, AKG) conectado a una interfaz de audio (Fast Track Ultra 8R, M-AUDIO) luego a un ORDENADOR PERSONAL. Las canciones TUT, CON1, CON2 y HET también se grabaron y editaron para usar como estímulos de canciones en los experimentos electrofisiológicos, utilizando el software Avisoft-SASLab Pro (Avisoft Bioacoustics). Para evaluar el grado de aprendizaje vocal después de la tutoría, se grabaron canciones de juveniles experimentales a 80, 100 y 120 dph (durante 2 o 3 días), y se midieron las similitudes de sus canciones y las canciones de un tutor (% de similitud) usando Sound Analysis Pro 201120. Para cada ave, se midieron 10 motivos de canciones de canciones en cada momento para determinar las similitudes con el motivo de la canción del tutor y se promedió la reproducción de la canción durante las grabaciones electrofisiológicas. Los motivos de las canciones primero se segmentaron en sílabas separadas en función de los cambios de amplitud y frecuencia. Se cuantificaron varias características acústicas: tono, frecuencia media de tono, frecuencia máxima y bondad; Entropía de Wiener y duración del intervalo entre sílabas y sílabas. La similitud con la canción del tutor se midió entre los motivos de la canción del tutor y del alumno siguiendo un procedimiento automatizado en Sound Analysis Pro 2011 que cuantifica la similitud acústica entre dos motivos de la canción en función del tono, la bondad del tono, FM, AM y la entropía de Wiener. Utilizando la configuración predeterminada de Sound Analysis Pro 2011, como comparaciones asimétricas de valores medios, duración mínima (de 10 ms) y comparaciones de 10 × 10, se calculó la similitud de la canción y se utilizó el porcentaje de similitud para un análisis estadístico adicional. Para evaluar la estabilidad de cada sílaba de la canción por separado o cada llamada diferente (tets, stacks o cacareos) a 80, 100 y 120 dph, medimos la entropía media de las sílabas o llamadas y la bondad del tono medio utilizando Sound Analysis Pro 2011.

La subunidad B de la toxina del cólera (CTB) Alexa Fluor 488 o 555 conjugados (Thermo Fisher Scientific) se inyectó unilateralmente en el NCM o LC (0,2% p/v, 50–100 nL), respectivamente, de tres juveniles de pinzón cebra macho aislados (52 –55 dph) a través de una pipeta conectada a un inyector a presión (Nanoject II; Drummond Scientific Company, Broomall, PA, EE. UU.) con coordinación estereotáxica bajo anestesia con isoflurano (2,5-2,7%). Después de 3 a 5 días, las aves se anestesiaron y se sometieron al protocolo histológico.

Después de la experimentación, las aves se anestesiaron profundamente con Somnopentyl y se perfundieron con solución salina y luego con paraformaldehído al 4%. Se realizaron secciones de cerebro parasagital (50 μm de espesor) utilizando un micrótomo (RETORATOME REM-710, Yamato). Para la inmunotinción, los cortes se incubaron con anticuerpos primarios de un anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa de ratón (1:1500, #22941, Immunostar), anticuerpo anti-dopamina beta-hidroxilasa de conejo (1:1500, #22806, Immunostar) o anticuerpo anti-dopamina beta-hidroxilasa de conejo (1:1500, #22806, Immunostar). anticuerpo anti-GABA (1:500, #A2052, Sigma-Aldrich) en PBS-T (que contiene Triton-X al 0,3 % en PBS) durante 48 h a 4 °C. Después de lavar con PBS, los cortes se incubaron con anticuerpos secundarios de un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con Alexa 568 (1:400, A11031, Thermo Fisher) o un anticuerpo de cabra anti-conejo IgG conjugado con Alexa 568 (1:400, A11036 , Thermo Fisher), durante 48 h a 4 °C. Los cortes se montaron (Fluoromount, Diagnostic BioSystem) y luego se sometieron a imágenes por microscopía confocal (LSM 780, Zeiss).

Las terminales de axón positivas para Arch-GFP/GFP se cuantificaron en las primeras seis a ocho secciones mediales: cada sección impar se inmunoetiquetó con el anticuerpo de conejo antidopamina beta-hidroxilasa (DBH), mientras que cada sección par se inmunoetiquetó con la combinación de anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa (TH) de ratón y anticuerpo anti-GABA de conejo. Se tomaron imágenes de microscopio con un aumento de 40x de cuatro campos dentro del área de NCM de cada sección y se usaron para cuantificar el porcentaje de DBH, TH o GABA-terminales de axón doblemente marcados dentro de los Arch-GFP/GFP-positivos, usando Fiji ( paquete de software ImageJ). Esos números se promediaron dentro de una sección y entre aves dentro de un grupo de comparación, seis aves en optoinhibición y seis en el grupo de control.

La clasificación de picos se realizó fuera de línea con Offline Sorter v3 (Plexon), y las unidades individuales bien aisladas se enviaron a análisis posteriores con paquetes de software NeuroExplorer v5 y códigos MATLAB personalizados (MATLAB 2018b, MathWorks). Las neuronas LC se clasificaron en neuronas de picos regulares y rápidos en función de su forma de onda y tasa de disparo. Para cada unidad, calculamos el ancho total a la mitad del máximo de las porciones de valle del pico promedio y la duración del pico definida por el tiempo desde el pico hasta el valle21. Calculamos la tasa de disparo espontáneo promediando el número de picos durante un período de 50 minutos cuando no se presentó ningún estímulo sensorial. Las neuronas LC con tasas de disparo espontáneo < 20 Hz se clasificaron como picos regulares, mientras que las neuronas > 20 Hz se contaron como picos rápidos. Las neuronas NCM se clasificaron en neuronas de punta ancha o estrecha en función del ancho medio de la punta y la duración del pico negativo al positivo16. Tanto para las neuronas NCM como para las LC, cuantificamos las respuestas auditivas de cada neurona por la fuerza de la respuesta (RST): la diferencia en la tasa de activación media durante el estímulo de la canción (FRstim) y la tasa de activación durante el mismo período de duración con el estímulo de la canción justo antes del estímulo. (FRbase) con la siguiente fórmula:

Para medir el sesgo de respuesta entre dos estímulos de canciones, calculamos los valores d-prime usando la ecuación:

donde \(\overline{{{{{{\rm{RST}}}}}}}\) es la fuerza de respuesta media al estímulo y σ2 es la varianza del RST25. Se utilizó un valor D-prime > 0,5 como criterio de respuesta sesgada. Si las comparaciones de valores d-prime entre la canción TUT y todas las demás canciones eran superiores a 0,5, la neurona se clasificaba como selectiva para la canción TUT.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete de software SigmaPlot 13.0. Después de transmitir las pruebas de normalidad e igualdad de varianza para todos los grupos comparados, realizamos una prueba T de Student o una prueba de suma de rangos de Mann-Whitney. Además, para los datos que consisten en Reproducción 1, 2 y 3 y diferentes estímulos auditivos como TUT, CON1, CON2 y grupos HET, se realizó el ANOVA de dos vías seguido de la prueba post hoc de Holm-Sidak, utilizando 'Reproducción' como el primero y 'Estímulo auditivo' como el segundo factor con comparaciones All Pairwise. Todas las comparaciones se consideraron significativamente diferentes si p < 0,05. Para la visualización de datos se utilizó el software Origin 2019b.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de origen se proporcionan con este documento. Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio se incluyen en la Tabla complementaria 1. Los conjuntos de datos generados durante este estudio y cualquier información adicional requerida para volver a analizar los datos informados en este documento están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Los códigos personalizados empleados para la recopilación y el análisis de datos durante el presente estudio están depositados y disponibles en: https://doi.org/10.5281/zenodo.6630127, https://doi.org/10.5281/zenodo.6630093 y https:/ /doi.org/10.5281/zenodo.6630340.

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Damos las gracias al Dr. C. Yokoyama por su valiosa ayuda en la preparación del manuscrito, y los Dres. R. Mooney y SC Woolley por la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos al Dr. M. Araki por la asistencia en la codificación de MatLab y a la Sra. A. Kuneji por cuidar de los animales de experimentación. También agradecemos al Sr. Nicolas Baudoin por proporcionar imágenes de pájaros para las figuras. Esta investigación fue apoyada por OIST Graduate University y las subvenciones JSPS KAKENHI JP: #19K16302 a JK y #18H02531 y #20H05075 a YY-S.

Unidad de Mecanismos Neuronales para el Periodo Crítico, Universidad de Graduados del Instituto de Ciencia y Tecnología de Okinawa (OIST), Okinawa, Japón

Jelena Katic, Yuichi Morohashi y Yoko Yazaki-Sugiyama

WPI-IRCN, Universidad de Tokio, Tokio, Japón

Yoko Yazaki-Sugiyama

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YY-S., JK y YM diseñaron los experimentos; JK realizó los experimentos y analizó los datos; YY-S. y JK escribieron el artículo.

Correspondencia a Yoko Yazaki-Sugiyama.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Aditya Singh, Todd Troyer y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Katic, J., Morohashi, Y. & Yazaki-Sugiyama, Y. Circuito neuronal para la autenticación social en el aprendizaje de canciones. Nat Comun 13, 4442 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32207-1

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Recibido: 26 Septiembre 2021

Aceptado: 20 de julio de 2022

Publicado: 16 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32207-1

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