Estrategia de mejora para la regeneración vascular eficaz después de un infarto de miocardio a través de un enfoque dual de células madre

Medicina experimental y molecular volumen 54, páginas 1165–1178 (2022)Citar este artículo

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Dado que un suministro de sangre coronario deteriorado después de un infarto de miocardio (IM) afecta negativamente la función cardíaca, la neovascularización terapéutica se considera una de las principales estrategias terapéuticas para la reparación cardíaca basada en células. Aquí, para lograr una neovascularización terapéutica más eficaz en corazones isquémicos, desarrollamos un enfoque de células madre duales para una regeneración vascular eficaz utilizando dos tipos distintos de células madre, células endoteliales CD31+ derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC-EC) y diseñadas células madre mesenquimales humanas que secretan continuamente el factor 1α derivado del estroma (SDF-eMSC), para promover simultáneamente la vasculogénesis y la angiogénesis natales, dos mecanismos centrales de la neovascularización. Para inducir una regeneración vascular más completa, inyectamos intramiocárdicamente hiPSC-EC para producir vasos de novo, posiblemente a través de vasculogénesis, y un parche cardíaco 3D que encapsula SDF-eMSC (SDF-eMSC-PA) para mejorar la angiogénesis a través de la secreción prolongada de factores paracrinos, que incluyen SDF-1α, se implantó en el epicardio de corazones isquémicos. Verificamos que las hiPSC-EC contribuyen directamente a la formación de vasos de novo en corazones isquémicos, lo que resulta en una función cardíaca mejorada. Además, la implantación concomitante de SDF1α-eMSC-PA mejoró sustancialmente la supervivencia, la retención y el potencial vasculogénico de hiPSC-EC y, en última instancia, logró una neovascularización más completa en los corazones con infarto de miocardio. Es de destacar que los vasos recién formados a través del enfoque de células madre duales fueron significativamente más grandes y más funcionales que los formados por hiPSC-EC solo. En conclusión, estos resultados proporcionan pruebas convincentes de que nuestra estrategia para la regeneración vascular eficaz puede ser un medio eficaz para tratar la cardiopatía isquémica.

Las cardiopatías isquémicas (CI) son una de las principales causas de morbilidad y motilidad en todo el mundo1. En particular, el infarto de miocardio (IM), una forma representativa de IHD, daña excesivamente tanto los músculos cardíacos como los vasos sanguíneos2. Dado que el daño a los vasos coronarios es una de las etiologías fisiopatológicas más críticas en el infarto de miocardio, los enfoques hasta la fecha se han centrado en reconstituir la vasculatura funcionalmente perfusible en el corazón isquémico a través de la neovascularización terapéutica3. A pesar de los resultados alentadores de los estudios preclínicos, los resultados obtenidos de los ensayos clínicos posteriores no produjeron resultados concluyentes consistentes. Una posible explicación de esta discrepancia entre los resultados preclínicos y clínicos es la incapacidad de mantener niveles óptimos de factores angiogénicos dirigidos en el área objetivo durante un período determinado para la estimulación angiogénica prolongada, lo cual es un desafío técnico y se considera prohibitivamente costoso4.

Se ha vuelto más ampliamente aceptado que la vasculatura perfundible puede reconstruirse en el corazón isquémico a través de la neovascularización terapéutica5. Varios estudios previos delinearon que la neovascularización terapéutica generalmente comprende dos procesos distintos, angiogénesis y vasculogénesis. La angiogénesis se define como el crecimiento de vasos sanguíneos preexistentes, y la vasculogénesis se refiere a la generación de novo de vasos a partir de células endoteliales (EC), células progenitoras endoteliales (EPC) u otros tipos de células madre6. Dado que varios estudios previos informaron ampliamente que la inducción de la angiogénesis es efectiva para la regeneración vascular, se han invertido esfuerzos considerables para desarrollar una estrategia eficiente para promover la angiogénesis miocárdica para tratar la cardiopatía isquémica. Por ejemplo, en varios entornos preclínicos, la administración de factores proangiogénicos como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) en forma de proteínas recombinantes, plásmidos de ADN desnudo o Se ha demostrado que el ARN de VEGF modificado mejora sustancialmente la formación de vasos sanguíneos, la función miocárdica y la tasa de supervivencia a largo plazo, lo que indica que la promoción de la angiogénesis es una estrategia terapéutica eficaz para tratar los corazones que fallan.

Si bien se sabe que la angiogénesis ocurre durante la vida embrionaria y adulta, se considera que la vasculogénesis ocurre solo durante el desarrollo embrionario7. Sin embargo, la evidencia reciente sugiere que la vasculogénesis no se limita a la embriogénesis temprana, sino que también puede contribuir a la fisiopatología de las enfermedades vasculares en la vida posnatal8. Este concepto surgió de la observación de que tanto las EC como las EPC coexisten en la circulación y que se desarrollan nuevos vasos sanguíneos durante el crecimiento del tumor. Esta identificación de EPC circulantes en vertebrados adultos sugirió recientemente un papel funcional para varios tipos de células derivadas de la médula ósea en la vasculogénesis posnatal9. Posteriormente, varios estudios informaron que el trasplante de EPC, células mononucleares (MNC) y células madre mesenquimales (MSC) indujo una neovascularización terapéutica en tejidos isquémicos adultos10,11,12. Sin embargo, su potencial para diferenciarse en EC y someterse a vasculogénesis sucesiva es subóptimo porque sus mecanismos principales involucran efectos paracrinos en lugar de vasculogénesis de novo. Más recientemente, las EC derivadas de células madre pluripotentes humanas (hPSC-EC), incluidas las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), se han sugerido como una nueva fuente de células para la vasculogénesis. Aunque las hPSC-EC exhibieron un potencial vasculogénico relativamente mayor que otras células, su capacidad para inducir la vasculogénesis aún es insuficiente e ineficiente13,14,15. Por ejemplo, un estudio reciente que aplicó hPSC-EC en un modelo de isquemia de las patas traseras demostró que tomó varios meses formar vasos sanguíneos funcionales en el tejido isquémico, lo que sugiere el potencial limitado de hPSC-EC en la vasculogénesis. En consecuencia, para que las hPSC-EC se utilicen de manera más eficaz para la neovascularización terapéutica en tejidos isquémicos, se debe desarrollar un método innovador para promover el potencial vasculogénico.

Por lo tanto, en el estudio actual, desarrollamos una estrategia para reconstruir eficazmente la vasculatura en corazones isquémicos utilizando dos tipos distintos de fuentes de células, CD31+ hiPSC-EC y MSC modificadas genéticamente derivadas de la médula ósea humana que secretan continuamente factor 1α derivado del estroma. (SDF-eMSC) dentro de un parche cardíaco tridimensional (3D) implantado en el epicardio de corazones inducidos por IM. Presumimos que las hiPSC-EC inyectadas intramiocárdicamente producirían vasos de novo a través de la vasculogénesis, mientras que los parches SDF-eMSC implantados epicárdicamente (SDF-eMSC-PA) mejorarían simultáneamente la angiogénesis de los vasos del huésped de acuerdo con la secreción de factores paracrinos angiogénicos, particularmente SDF, en corazones inducidos por MI. Dado que la base de la neovascularización nativa no se limita a la angiogénesis, sino que también incluye la vasculogénesis posnatal, razonamos que las estrategias dirigidas a la neovascularización terapéutica deben centrarse en inducir de manera integral todos estos procesos juntos para lograr una verdadera regeneración vascular en corazones isquémicos. Para usar SDF-eMSC-PA como reservorio celular para secretar varias citoquinas beneficiosas, incluida SDF-1α, empleamos un hidrogel de matriz extracelular derivada del corazón (hdECM) para recapitular el microambiente específico del tejido cardíaco lo más cerca posible. Posteriormente, demostramos que nuestro enfoque celular dual con hiPSC-EC y SDF-eMSC-PA condujo a una mejora significativa en la formación de vasos y una función cardíaca mejorada. Estos resultados sugieren implicaciones terapéuticas significativas para la regeneración vascular en corazones isquémicos.

El hdECM se preparó como se describió anteriormente16,17. Brevemente, se compró tejido del corazón de un cerdo doméstico coreano de 6 meses de edad en un mercado de productos ganaderos con la aprobación del proveedor. Disecccionamos el ventrículo izquierdo del corazón porcino completo y lo cortamos en pedazos pequeños. Los pequeños trozos de tejido cardíaco se sumergieron en una solución de dodecilsulfato de sodio al 1 % (Affymetrix, CA) durante 48 h, seguido de un tratamiento con una solución de Triton X-100 al 1 % en PBS (Biosesang, Corea) durante 1 h. A continuación, los tejidos descelularizados se sumergieron en PBS durante 3 días para eliminar el detergente residual. Posteriormente, los tejidos cardíacos descelularizados fueron liofilizados, pulverizados en nitrógeno líquido y digeridos en 10 mL de solución de ácido acético 0,5 M (Merck Millipore, Billerica, MA) a una concentración final de 3,3% p/v (330 mg de polvo de hdECM) con 33 mg de pepsina en polvo. La solución de hdECM digerida se filtró a través de una malla de poro de 40 µm, se dividió en alícuotas de 1 ml y se almacenó a -20 °C para experimentos adicionales. Antes de fabricar los parches cardíacos, la solución de hdECM se ajustó a un pH neutro de 7,4 mediante la adición de solución de NaOH 10 N mientras se mantenía el tubo cónico en un cubo de hielo para evitar la gelificación de hdECM.

Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Católica de Corea (Número de aprobación: CUMC-2020-0051-01). El IACUC y el Departamento de Animales de Laboratorio (DOLA) de la Universidad Católica de Corea, campus de Songeui, acreditaron el Centro de Laboratorio Animal de Excelencia de Corea de la Administración de Drogas y Alimentos de Corea en 2017 y adquirieron la acreditación completa de AAALAC International en 2018. Todos los procedimientos con animales cumplieron con las pautas de Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos o las directrices NIH. Se anestesiaron ratas Fischer 344 (160–180 g, macho, Koatec, Corea) con isoflurano inhalado al 2 % y se intubaron a través de la tráquea con un catéter intravenoso de calibre 18. A continuación, las ratas se ventilaron mecánicamente con un respirador para roedores (55-7058, Harvard Apparatus, Canadá). Los animales se colocaron en una almohadilla térmica a 37 °C para evitar que se enfriaran durante el procedimiento. Después de rasurar el tórax y esterilizarlo con alcohol al 70%, se le realizó una toracotomía izquierda. El IM se indujo atando una sutura con un tubo de polietilenglicol estéril (22 G) colocado en la arteria descendente anterior izquierda (LAD) durante 1 min, y el nudo se ligó de forma permanente con una sutura de prolene 7-0. Para establecer la función ventricular izquierda basal, examinamos la fracción de eyección (EF) después del día de la operación (POD) 7 (criterio de inclusión: EF < 45 % según la evaluación ecocardiográfica). Las ratas fueron anestesiadas nuevamente al día siguiente mediante inhalación de isoflurano, intubadas y ventiladas mecánicamente. Se volvió a abrir el tórax del animal y se extrajo parcialmente el pericardio del corazón infartado. Cinco grupos experimentales de la siguiente manera: (1) control simulado, (2) control MI, (3) epicardio implantado con SDF-eMSC-PA de corazones MI (solo PA, 1 × 106), (4) hiPSC-EC, inyección intramiocárdica ( EC solo, 1 × 106) y (5) plataforma combinada de hiPSC-EC y SDF-eMSC-PA (EC + PA, 1 × 106 en cada uno). Los hiPSC-EC se inyectaron en dos sitios diferentes en la zona límite del corazón infartado y los parches cardíacos 3D (diámetro: 1 cm) se implantaron directamente en el epicardio usando tres suturas. El tórax se cerró asépticamente y se administraron antibióticos y solución salina normal al 0,9%. Todas las ratas recibieron los siguientes inmunosupresores como se describió anteriormente: 18,19 azatioprina, 2 mg/kg; ciclosporina A, 5 mg/kg; y metilprednisolona, 5 mg/kg al día.

Los animales se anestesiaron ligeramente con isoflurano y se mantuvieron a 37 °C usando una almohadilla térmica. La evaluación de la mejoría funcional en los tejidos cardíacos lesionados se realizó con ecocardiografía como describimos previamente20,21. Las ratas se anestesiaron ligeramente con isoflurano inhalado y los datos fisiológicos se registraron utilizando un sistema de ecocardiografía transtorácica equipado con un transductor lineal L15-7io de 15 MHz (Affniti 50 G, Philips). Se realizaron ecocardiogramas en serie antes, 2, 4 y 8 semanas después del tratamiento celular. El operador de ecocardiografía desconocía la asignación de grupos durante el experimento.

Las mediciones hemodinámicas se realizaron 8 semanas antes de la eutanasia. Después de la toracotomía sin sangrado, se punzó el ápice del VI del corazón con una aguja de calibre 26 y se insertó un catéter de conductancia 2 F (SPR-838, Millar) en el VI. Los parámetros de presión-volumen (PV) de LV se registraron continuamente utilizando un sistema de conductancia PV (MPVS Ultra, EMKA Technologies, París, Francia) acoplado a un convertidor digital (PowerLab 16/35, ADInstruments, Colorado Springs, CO). Se obtuvieron mediciones de la función cardíaca independientes de la carga, incluidas las pendientes de la relación de volumen de presión sistólica final (ESPVR) y la relación de volumen de presión diastólica final (EDPVR), con diferentes precargas, que se obtuvieron a través de la vena cava inferior transitoria (IVC) oclusión con un portaagujas. Se inyectó una alícuota de 50 µl de solución salina hipertónica (20% NaCl) en la vena yugular izquierda para calcular la conductancia paralela después de las mediciones hemodinámicas. La sangre se recogió del ventrículo izquierdo en una jeringa heparinizada y se colocó en cubetas para convertir la señal de conductancia en volumen utilizando el catéter. El volumen absoluto de la rata se definió calibrando la conductancia paralela y la conductancia de la cubeta.

Para la determinación de la fibrosis circunferencial y el miocardio viable, se realizó la tinción tricrómica de Masson (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) de la siguiente manera. Brevemente, se preincubaron tres portaobjetos de parafina en un horno seco a 37 °C antes de la desparafinización y la rehidratación. A continuación, las secciones de parafina se volvieron a fijar durante una hora en solución de Bouin a 56 °C. Estas secciones se tiñeron con solución de hematoxilina férrica de Weigert durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se tiñeron con solución de fucsina ácida escarlata de Biebrich durante 20 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, las secciones se contrastaron con azul de anilina durante 15 min, seguido de una incubación con ácido acético al 1% durante 1 min a temperatura ambiente. Se realizaron lavados extensos entre cada paso. Posteriormente, se realizaron imágenes de las secciones del corazón con un escáner de diapositivas (Pannoramic MIDI). La proporción de fibrosis se calculó como el área de fibrosis al área de la circunferencia del VI [(área de infarto/área de la pared del VI) * 100]. Además, la proporción de miocardio viable se cuantificó como el área de miocardio viable dentro del área del infarto donde la pared del VI está dilatada y se exhibe el área fibrótica. [(área de miocardio viable/área de infarto) * 100]. Ambas mediciones se realizaron utilizando el software ImageJ.

Todos los datos cuantitativos se presentan como la media ± SD a menos que se indique lo contrario. Las diferencias significativas entre dos grupos se analizaron mediante pruebas t de Student de dos colas. Las diferencias significativas entre los 4 grupos también se analizaron mediante ANOVA con análisis post-hoc de Bonferroni. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando el valor de p fue inferior a 0,05.

Varios estudios anteriores informaron la generación exitosa de EC a partir de hiPSC (hiPSC-EC) utilizando una combinación de moléculas pequeñas, incluido un inhibidor de GSK322. Según informes anteriores, generamos hiPSC-EC a partir de hiPSC utilizando el inhibidor de GSK3 CHIR99021 (materiales y métodos complementarios, figura complementaria 1a). Para producir hiPSC-EC que expresan proteína de fluorescencia verde (GFP) para facilitar el seguimiento celular en los tejidos del corazón en experimentos adicionales, producimos hiPSC que expresan señales de GFP mediante la transfección de partículas lentivirales de GFP, las enriquecimos con FACS en función de la expresión de GFP y las usamos para diferenciar en EC (Fig. 1b complementaria). Los resultados de qRT-PCR verificaron que el nivel de expresión de OCT4, un marcador de pluripotencia, se redujo significativamente, y el nivel de expresión de CD31, un marcador específico para EC, aumentó significativamente en las hiPSC que se diferencian en el linaje EC (Figura complementaria 1c, Tabla complementaria 1). En el día 7 de diferenciación, observamos que aproximadamente el 25,08 % de las hiPSC-EC de diferenciación eran positivas para el anticuerpo CD31 humano y, posteriormente, enriquecimos estas células CD31+ mediante FACS. Después de FACS, las CD31+ hiPSC-EC enriquecidas se mantuvieron en medio sin suero endotelial humano con citoquinas, incluido VEGF, para mantener sus características como células de linaje EC (Figura 1c complementaria). Las CD31+ hiPSC-EC mostraron una morfología típica de EC similar a un adoquín y expresaron niveles similares de ARNm de marcadores específicos de EC, como el grupo de diferenciación 31 (CD31), la cadherina endotelial vascular (VE-cadherina), el factor Von Willebrand (vWF) y receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), en comparación con las células endoteliales del cordón umbilical humano (HUVEC) (Figuras complementarias 1c, d). Los resultados del análisis de citometría de flujo demostraron además que las CD31+ hiPSC-EC fueron 97,19 % y 85,53 % positivas para CD31 y CD144, respectivamente (Figura complementaria 1e). Además, los resultados de la inmunofluorescencia confirmaron que las CD31+ hiPSC-EC expresaban niveles abundantes de las proteínas CD31 y vWF (Fig. 1f complementaria). A nivel funcional, las CD31+ hiPSC-EC mostraron la capacidad de absorción de Ac-LDL (Figura complementaria 1g) y la formación de una red similar a un capilar sobre Matrigel (Figura complementaria 1h).

Para determinar si las CD31+ hiPSC-EC (hiPSC-EC después) podrían formar vasos de novo a través de un mecanismo dependiente de vasculogénesis en corazones inducidos por IM, inyectamos intramiocárdicamente hiPSC-EC en dos sitios diferentes en la zona fronteriza de la IM inducida. corazones de rata. MI fue generado por la ligadura de la arteria descendente anterior izquierda (LAD) en el corazón. HiPSC-ECs que expresan continuamente la señal de fluorescencia verde (GFP) se utilizaron con fines de seguimiento. Para visualizar los vasos funcionales en los corazones inducidos por MI, realizamos una tinción de perfusión con isolection-B4 (IB4) conjugada con un colorante fluorescente rojo, rodamina, en el corazón antes de la recolección de tejido 8 semanas después de la inyección con hiPSC-EC. Los análisis de imágenes fluorescentes mostraron que la cantidad de capilares IB4+ en los corazones inyectados con hiPSC-EC fue significativamente mayor que la de los corazones de control MI (Fig. 1a).

a Imágenes representativas de vasos sanguíneos teñidos con IB4-rodamina (rojo) en la zona de infarto, zona de borde y zona remota y 8 semanas después de la inyección de hiPSC-EC y su resumen de cuantificación. Para la cuantificación se contó el número de capilares en cinco campos seleccionados al azar (mm2) en cada corazón. n = 5. *p < 0,05. Barras de escala: 100 µm. b Imagen representativa de vasos sanguíneos recién formados por iPSC-ECs-GFP (verde), IB4-rodamina (rojo) y DAPI (azul). Barras de escala: 20 µm. c–j Se inyectaron por vía intramiocárdica hiPSC-EC o células de control a ratas sometidas a IM, seguidas de un análisis de ecocardiografía. c La línea de tiempo esquemática desde el modelado MI y el trasplante de iPSC-EC hasta la medición de la función cardíaca. d Fracción de eyección del ventrículo izquierdo (EF), (e) acortamiento fraccional izquierdo (FS), (f) dimensión diastólica interna del ventrículo izquierdo (LVIDd), (g) dimensión sistólica interna del ventrículo izquierdo (LVID), (h) grosor de la pared septal ( SWT), (i) grosor de la pared posterior (PWT) y (j) grosor relativo de la pared (RWT). n = 6. *p < 0,05. k Imágenes representativas que muestran fibrosis cardíaca después de la tinción con tricrómico de Masson en los corazones recolectados 8 semanas después del tratamiento celular. Resultados de la cuantificación de fibrosis cardíaca (l) y miocardio viable (m). n = 5. *p < 0,05. Barras de escala: 2000 µm.

A continuación, para evaluar el potencial y la magnitud de la contribución de las hiPSC-EC a la vasculogénesis en los corazones con infarto de miocardio, rastreamos las señales GFP y RFP de las hiPSC-EC dentro de los tejidos cardíacos. Las imágenes de microscopía confocal demostraron una cantidad considerable de vasos, doblemente positivos para las señales IB4 y GFP de hiPSC-EC, en la región del infarto de los tejidos cardíacos que recibieron hiPSC-EC 8 semanas después de la inyección. Curiosamente, una cantidad sustancial de hiPSC-EC se incorporó a la red capilar del huésped y muchas de ellas se ubicaron en el área perivascular (Fig. 1b). Los resultados sugieren claramente que las hiPSC-EC podrían reconstruir vasos de novo en corazones isquémicos.

Dado que la regeneración vascular mejorada a través de la vasculogénesis conduce a la recuperación funcional del infarto de miocardio, planteamos la hipótesis de que la inyección intramiocárdica de hiPSC-EC en corazones con infarto de miocardio puede promover la función cardíaca. Posteriormente, realizamos ecocardiografías seriadas para evaluar la función del ventrículo izquierdo (VI) y la remodelación cardíaca de PRE (1 semana después del IM y antes del tratamiento celular), y 2, 4 y 8 semanas después del tratamiento celular. En este estudio, empleamos un modelo de IM en el que las células se trasplantaron una semana después de la inducción del IM para imitar la situación clínica de los pacientes con IM lo más cerca posible. Los resultados de la ecocardiografía demostraron que tanto la fracción de eyección (EF) como el acortamiento fraccional (FS) en todos los grupos experimentales fueron significativamente más bajos en comparación con el grupo simulado que no recibió ninguna intervención. (Fig. 2a-g complementaria). De importancia, los corazones que recibieron hiPSC-EC mostraron EF y FS significativamente más altos que los del grupo de control MI hasta 8 semanas después del tratamiento celular (Fig. 1c-d). Entre varios parámetros para la remodelación cardíaca, como la dimensión diastólica interna del ventrículo izquierdo (LVIDd), la dimensión sistólica interna del ventrículo izquierdo (LVISd), el grosor de la pared septal (SWT), el grosor de la pared posterior (PWT) y el grosor relativo de la pared (RWT), el LVIDd y LVID en los corazones tratados con hiPSC-EC fueron significativamente más bajos que los de los corazones de control con MI, lo que indica que hiPSC-EC protegió a los corazones de la remodelación cardíaca adversa. (Fig. 1e-i y Fig. 2h complementaria). De manera similar, los resultados de la tinción tricrómica de Masson obtenidos usando tejido cardíaco recolectado 8 semanas después del tratamiento celular mostraron que el área de fibrosis (%) en el grupo inyectado con hiPSC-EC fue considerablemente menor y el miocardio viable (%) fue mayor que que en el grupo de control MI (Fig. 1j-m). Con base en estos resultados, confirmamos que las hiPSC-EC pueden contribuir directamente a la formación de vasos de novo in vivo en corazones expuestos a IM, lo que da como resultado una función cardíaca mejorada.

Posteriormente, investigamos nuestra hipótesis central de si la inducción simultánea de vasculogénesis y angiogénesis podría conducir a una regeneración vascular integral y una mejora funcional en los corazones MI. Dado que ya verificamos que las hiPSC-EC lograron con éxito la vasculogénesis en los corazones con infarto de miocardio, buscamos identificar una fuente celular adicional que pueda inducir la angiogénesis complementaria de los vasos sanguíneos en el corazón del huésped y finalmente decidimos probar células madre mesenquimales humanas modificadas genéticamente diseñadas para liberar continuamente proteína SDF-1α humana (SDF-eMSC)23. Los SDF-eMSC no se distinguían de los BM-MSC normales. Los SDF-eMSC exhibieron una morfología celular homogénea en forma de huso, que representa hMSC (materiales y métodos complementarios, Fig. 3a complementaria). Las SDF-eMSC tenían un alto potencial proliferativo basado en el aumento gradual en los niveles de duplicación de la población (PDL) durante los tiempos de cultivo en comparación con las BM-MSC normales24 (Fig. 3b complementaria). Las SDF-eMSC expresaron varios marcadores específicos para las MSC humanas, como CD90, CD44, CD105 y CD73, sin la expresión de CD34, CD11b, CD19, CD45 y HLA-DR (Fig. 3c complementaria). Los SDF-eMSC secretaron de manera estable la proteína SDF-1α humana, según lo determinado por el análisis de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) SDF-1α humano (Fig. 3d complementaria). Los resultados del cariotipo SDF-eMSC revelaron un cariotipo humano normal de las SDF-eMSC sin anomalías cromosómicas, lo que sugiere la estabilidad genética de las SDF-eMSC (Fig. 3e complementaria).

Para investigar si las SDF-eMSC podrían aumentar el potencial angiogénico de las EC, realizamos varios tipos de análisis experimentales in vitro con SDF-eMSC. Entre los primeros, para determinar si las SDF-eMSC influían en la expresión génica asociada con las EC y las propiedades angiogénicas, tratamos un 30 % de medios acondicionados (CM) recolectados de SDF-eMSC o BM-MSC cultivadas en las hiPSC-EC cultivadas durante 3 días y realizó análisis qRT-PCR. Los niveles de expresión del factor 1 alfa derivado del estroma (SDF-1α), tirosina quinasa con Ig y dominio de homología del factor de crecimiento epidérmico 2 (Tie-2), vWF, E-selectina (CD62) y molécula de adhesión intercelular-1 ( ICAM-1) fueron significativamente mayores en las hiPSC-EC tratadas con SDF-eMSC-CM que en las hiPSC-EC expuestas a BM-MSC-CM (Fig. 2a). En particular, se sabe que el aumento de la expresión de E-selectina e ICAM-1 está implicado en la angiogénesis en presencia de EC activadas25,26,27,28,29. A continuación, en los ensayos de migración de EC, como se muestra en la Fig. 2, la adición de medios acondicionados de SDF-eMSC (SDF-eMSC-CM) mejoró significativamente la migración de hiPSC-EC o HUVEC en comparación con la migración de EC tratadas con CM de MSC derivadas de médula ósea humana (BM-MSC-CM), lo que sugiere que las citocinas liberadas de SDF-eMSC refuerzan la movilidad de las EC (Fig. 2b y Fig. 4a complementaria). Además, para probar si las SDF-eMSC promueven directamente el potencial angiogénico de las EC, realizamos ensayos de formación de tubos Matrigel, un experimento representativo para evaluar el potencial de formación de vasos de las células. Los resultados de los ensayos de formación de tubos de Matrigel demostraron que el número de ramificaciones formadas tanto en las hiPSC-EC como en las HUVEC tratadas con 30 % de CM recolectadas de las SDF-eMSC cultivadas fue significativamente mayor que en las EC tratadas con BM-MSC-CM. (Fig. 2c y Fig. 4b complementaria). Curiosamente, el tratamiento con SDF-eMSC-CM no solo promovió la formación de tubos por parte de las hiPSC-EC, sino que también contribuyó al mantenimiento de los vasos formados a partir de las hiPSC-EC. A diferencia de los vasos generados por hiPSC-EC expuestos a BM-MSC-CM que comenzaron a alterar la estructura del vaso dentro de las 24 h posteriores a la formación del vaso, el tratamiento con SDF-eMSC-CM apoyó la integridad de los vasos hasta por 48 h.

un análisis qRT-PCR de la expresión relativa de ARNm asociada con las CE y la angiogénesis en las hiPSC-EC tratadas con los medios condicionados (CM) de células madre mesenquimales de médula ósea cultivadas (BM-MSC-CM) o MSC modificadas con SDF (SDF-eMSC- CM) durante 3 días. El eje y representa la expresión relativa de ARNm de genes diana para gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). n = 3. *p < 0,05. b Ensayo de migración de EC. Imágenes representativas de hiPSC-EC migradas y cuantificación del área migrada (%). Los hiPSC-EC se colocaron en transpocillos (arriba), y los medios regulares (EGM, EBM) o los medios acondicionados (CM) recolectados de diferentes fuentes de células (BM-MSC-CM y SDF-eMSC-CM) se colocaron en transpocillos ( inferior) durante 7 h. n = 3. *p < 0,05. c Ensayo de formación de tubos. Las hiPSC-EC se cultivaron en placas de 24 pocillos recubiertas con Geltrex™ con medios regulares (EGM, EBM) o medios acondicionados (CM) (BM-MSC-CM y SDF-eMSC-CM) durante 9, 24 o 48 h. . Imágenes representativas de la formación de tubos y resumen de cuantificación del número de uniones. n = 3. *p < 0,05.

Para proporcionar un reservorio celular en el que los SDF-eMSC-PA puedan liberar constantemente SDF-1α a los corazones MI, producimos un parche que encapsula SDF-eMSC (SDF-eMSC-PA) al mezclar SDF-eMSC con un 2 % de extracelular descelularizado derivado del corazón. biotinta basada en matriz (hdECM) y la cargó en la malla de policaprolactona (PCL) (Fig. 3 y Fig. 5 complementaria). Posteriormente, para confirmar si SDF-eMSC-PA son funcionales y pueden liberar SDF-1α de manera eficiente, cultivamos SDF-eMSC-PA in vitro durante 28 días (Fig. 5a complementaria) y recolectamos sobrenadantes en varios puntos de tiempo durante tres días para generar la cinética de liberación de los SDF1α-eMSC-PA utilizando el kit ELISA SDF-1α. La curva de liberación acumulada mostró que, aunque la concentración inicial de SDF-1α fue mayor en los SDF-citoquinas-PA (300 ng/ml) que en los SDF-eMSC-PA el día 0, no se detectó SDF-1α en el SDF. -cytokine-PAs desde el día 7. Sin embargo, la expresión de SDF-1α liberada de SDF-eMSC-PA aumentó constantemente hasta el día 21 (Fig. 5b complementaria), lo que sugiere que SDF-eMSC secretaron continuamente SDF-1α dentro del parche.

a Procedimientos para la fabricación de un parche cardíaco que encapsula MSC con ingeniería SDF (SDF-eMSC-PA) con una plataforma de policaprolactona (PCL) producida por un sistema de impresión 3D. b Imagen óptica dentro del parche hdECM. Los SDF-eMSC-PA se marcaron previamente con el colorante de fluorescencia rojo DiI para el rastreo. Barras de escala: 1 mm. c Imagen de SDF-eMSC-PA trasplantados epicárdicamente en el corazón inducido por IM. d Vista macroscópica de corazones a las 8 semanas después del trasplante de PA.

Para determinar finalmente si la inducción simultánea de vasculogénesis y angiogénesis mediante el uso de hiPSC-EC y SDF-eMSC-PA podría conducir a una regeneración vascular integral y una mejora funcional en corazones inducidos por MI, indujimos MI mediante ligadura LAD después de la formación de cinco grupos experimentales de la siguiente manera: (1) control MI, (2) epicardio implantado SDF-eMSC-PA de corazones MI (PA solo, 1 × 106), (3) hiPSC-EC, inyección intramiocárdica (EC solo, 1 × 106), y (4) plataforma combinada de hiPSC-ECs y SDF-eMSC-PA (EC + PA, 1 × 106 en cada uno) (Fig. 4). Primero realizamos ecocardiografías en serie para todos los grupos experimentales antes, 2, 4 y 8 semanas después del tratamiento celular. Todos los grupos experimentales se redujeron significativamente en comparación con el grupo simulado (Figura complementaria 6a-g). De interés, la función cardíaca en el grupo EC + PA se conservó significativamente hasta 8 semanas en comparación con su función cardíaca en el pre, pero la función cardíaca en otros grupos, como el control, los grupos hiPSC-EC solo y SDF-eMSC-PA solo, disminuyó continuamente hasta las 8 semanas. (Fig. 4a-d). La remodelación cardíaca adversa determinada por LVIDd, LVIDs, SWT, PWT y RWT se redujo notablemente en el grupo EC + PA en comparación con los otros grupos (Fig. 4e-i y Fig. 6h complementaria). Para evaluar aún más la función cardíaca con mayor precisión, realizamos mediciones hemodinámicas del LV utilizando un catéter de presión-volumen (PV) invasivo, que puede medir la presión hemodinámica y el volumen del LV. Los resultados del bucle PV a las 8 semanas posteriores al tratamiento con células mostraron que el grupo EC + PA había mejorado significativamente la función cardíaca y prevenido la remodelación cardíaca adversa en comparación con los otros grupos (Fig. 5). Los dos parámetros de la función cardíaca general, el volumen sistólico (SV) y el gasto cardíaco (CO), fueron significativamente más altos (Fig. 5a-c), y el volumen máximo (V max), que es el índice de remodelación cardíaca medido en el máximo diástole, fue significativamente menor en el grupo EC + PA que en los otros grupos (Fig. 5d). Aunque la presión máxima (P max) medida en la sístole máxima no difirió significativamente entre los grupos, la tasa máxima de cambio de presión (dP/dtmax) y la tasa mínima de cambio de presión (dP/dtmin), que indican el cambio de presión en LV por segundo, se incrementaron en el grupo EC + PA. (Fig. 5e-f y Fig. 7a complementaria). Se utilizó la variación temporal de la vena cava inferior (VCI) ocluida para evaluar la contractibilidad cardíaca intrínseca independiente de la carga. La relación presión-volumen al final de la diástole (EDPVR), que indica la ausencia de disfunción diastólica, no difirió entre los grupos, mientras que la pendiente de la relación presión-volumen al final de la sístole (ESPVR), que indica la contractibilidad cardíaca, mejoró significativamente en el grupo EC + PA en comparación con los otros grupos (Fig. 5g-h y Fig. 7b complementaria). En conjunto, estos resultados de las mediciones hemodinámicas del VI demuestran consistentemente que el tratamiento con la plataforma combinada con hiPSC-EC y SDF-eMSC-PA mejora la reparación cardíaca en corazones con infarto de miocardio.

Fracción de eyección (FE) del ventrículo izquierdo. b Cambio delta de EF a las 8 semanas después del tratamiento celular. c Acortamiento fraccional izquierdo (FS). d Cambio delta de FS a las 8 semanas después del tratamiento celular. e Dimensión diastólica interna del ventrículo izquierdo (LVIDd). f Dimensión sistólica interna del ventrículo izquierdo (LVID). g Grosor de la pared septal (SWT). h Grosor de la pared posterior (PWT). i Espesor de pared relativo (RWT). n = 6–11. * p < 0,05.

a Imágenes representativas de la curva de presión y volumen hemodinámicos (PV) en estado estacionario a las 8 semanas posteriores al tratamiento celular. b Volumen sistólico (SV). c Gasto cardíaco (GC). d Volumen máx. (V máx.) que define la cantidad de volumen de sangre en el VI al final de la diástole. e dP/dtmax se refiere a la tasa máxima de cambios de presión durante la sístole. f La tasa mínima de cambios de presión durante la diástole (dP/dtmin). g Pendiente de la relación presión volumen sistólica final (ESPVR) que indica la contractibilidad cardíaca intrínseca medida por la oclusión transitoria de la vena cava inferior (VCI). h Pendiente de la relación presión-volumen telediastólica (EDPVR). n = 4. *p < 0,05.

A continuación, investigamos el comportamiento in vivo de las hiPSC-EC implantadas intramiocárdicamente en presencia o ausencia de SDF-eMSC-PA. Dado que hiPSC-ECs expresan constantemente GFP, pudimos rastrear su destino en secciones de tejido cardíaco. El examen microscópico confocal de los tejidos cardíacos recolectados 8 semanas después del tratamiento celular demostró que la implantación de SDF-eMSC-PA mejoró significativamente la retención y el injerto de las hiPSC-EC positivas para GFP inyectadas intramiocárdicamente. Cuantitativamente, la proporción de hiPSC-EC positivas para GFP en el grupo EC + PA fue sustancialmente mayor que en el grupo EC (Fig. 6a). De interés, mientras que las hiPSC-EC en el grupo hiPSC-EC solo se localizaron cerca de los sitios de inyección, las hiPSC-EC en el grupo EC + PA se distribuyeron por todas las regiones del ventrículo izquierdo. Dada la capacidad de SDF-eMSC-PA para mejorar la supervivencia y la retención de hiPSC-EC inyectadas, buscamos examinar si SDF-eMSC-PA ejercía efectos citoprotectores directos en hiPSC-EC in vitro. La lesión isquémica se simuló exponiendo hiPSC-EC a H2O2 (500 µM). La administración de CM de SDF-eMSC (SDF-eMSC-CM) mejoró significativamente la viabilidad de hiPSC-EC y HUVEC según lo determinado por el ensayo LIVE / DEAD y el ensayo CCK-8 (Fig. 8a-f complementaria). El tratamiento con SDF-eMSC-CM aumentó sustancialmente el número de células viables, lo que sugiere que SDF-eMSC-CM ejerce efectos citoprotectores directos en las CE contra las agresiones isquémicas. Posteriormente, realizamos análisis histológicos exhaustivos utilizando tejidos cardíacos recolectados 8 semanas después del tratamiento celular para examinar si SDF-eMSC-PA podría promover simultáneamente la vasculogénesis dependiente de hPSC-EC, así como la angiogénesis de los vasos sanguíneos del huésped. Se inyectó sistemáticamente IB4 conjugado con rodamina para identificar el endotelio funcional en estos experimentos. Inicialmente, las imágenes confocales demostraron que el número total de capilares positivos para IB4 (IB4+) tanto en la zona límite como en la zona de infarto de los corazones en el grupo EC + PA era sustancialmente mayor que en los otros grupos, incluido el grupo EC (Fig. 6b). El número de vasos que fueron GFP negativos pero positivos para IB4 (GFP-/IB4+) también fue significativamente más alto que en otros grupos, incluido el grupo solo de EC (Fig. 6c). Estos resultados sugieren que el enfoque combinado promovió significativamente la angiogénesis de los vasos del huésped en los corazones con infarto de miocardio. Más importante aún, el número de vasos de novo formados por hiPSC-ECs-GFP+ fue sustancialmente mayor en el grupo EC + PA que en el grupo solo EC, lo que indica que SDF-eMSC-PAs facilita la vasculogénesis dependiente de hiPSC-EC (Fig. 6d-e y Fig. 9a complementaria). En particular, el número de vasos sanguíneos más grandes (rango de diámetro: >5 μm), uno de los indicadores de vasos sanguíneos funcionales en el grupo EC + PA, fue significativamente mayor que en el grupo EC. De interés, muchos de esos vasos más grandes en el grupo EC + PA mostraron una expresión abundante de α-SMA, un marcador para las células del músculo liso, lo que sugiere que estos vasos más grandes (CD31+/α-SMA+) pueden ser vasos similares a las arteriolas, lo que indica que SDF-eMSC-PA desempeñó ciertos roles en el crecimiento y maduración vascular (Fig. 6e-g y Fig. 9b complementaria).

una imagen representativa de hiPSC-ECs-GFP dentro del área del infarto a las 8 semanas después del tratamiento celular y su resumen de cuantificación. n = 3. *p < 0,05. Barras de escala: 1000 µm. b Imágenes representativas de vasos sanguíneos teñidos con IB4-rodamina (rojo) en la zona de infarto (IZ), zona de borde (BZ) y zona remota a las 8 semanas después del tratamiento celular y un resumen de su cuantificación. n = 5–7. * p < 0,05. Barras de escala: 100 µm. c Imágenes representativas de vasos sanguíneos negativos para GFP pero positivos para IB4 (GFP-/IB4+) en el área infartada y su resumen de cuantificación. hiPSC-ECs-GFP (verde), IB4-rodamina (rojo) y DAPI (azul). n = 5. *p < 0,05. Barras de escala: 20 µm. d, e Imágenes representativas de vasos sanguíneos positivos para GFP e IB4 (GFP+/IB4+) en el área infartada y su cuantificación. hiPSC-ECs-GFP (verde), IB4-rodamina (rojo) y DAPI (azul). n = 5. *p < 0,05. Barras de escala: 20 µm. f, g Diámetro de vasos sanguíneos positivos para GFP derivados de hiPSC-EC en el área infartada y la zona del borde. n = 5. *p < 0,05.

Para investigar más a fondo si la regeneración vascular lograda por la plataforma combinada (EC + PA) fue suficiente para salvar el miocardio del daño isquémico, cuantificamos el miocardio viable mediante inmunotinción para el anticuerpo de troponina T cardíaca (cTnT) utilizando los tejidos cardíacos recolectados de todos los experimentos. grupos a las 8 semanas post-tratamiento celular. El número de cardiomiocitos cTnT+ viables en el grupo EC + PA fue significativamente mayor que en los otros grupos (Fig. 7a). Estos resultados de los análisis histológicos que utilizan tejidos cardíacos nos motivaron a probar si las SDF-eMSC (Fig. 10a complementaria) podrían conferir efectos citoprotectores directos en los cardiomiocitos contra las agresiones isquémicas in vitro. La lesión isquémica se simuló exponiendo los cardiomiocitos a H2O2 (500 µM). Los resultados del ensayo LIVE/DEAD y del ensayo de colecistoquinina-8 (CCK-8) demostraron que la administración de medios acondicionados (CM) con SDF-eMSC mejoró significativamente la viabilidad de los cardiomiocitos cultivados aislados de ratas neonatales (NRCM) contra H2O2 tratamiento en comparación con otros tratamientos. Estos resultados también sugieren que las SDF-eMSC tienen efectos citoprotectores directos contra las agresiones isquémicas (Fig. 11a-c complementaria).

a Imágenes representativas de inmunotinción de miocardio teñido con cTnT (verde) y DAPI (azul) 8 semanas después del tratamiento celular y cuantificación del número de cardiomiocitos positivos para cTnT. SDF-eMSC etiquetados con DiI dentro del parche cardíaco (rojo) n = 5. *p < 0,05. Barra de escala: 300 µm. b Imágenes representativas de la tinción tricrómica de Masson usando tejidos cardíacos recolectados 8 semanas después del tratamiento celular. c, d Resumen de cuantificación de un porcentaje de fibrosis y miocardio viable. n = 5. *p < 0,05. Barras de escala: 2000 µm.

En consecuencia, el grupo de tratamiento combinado mostró una disminución significativa de la fibrosis cardíaca. Los resultados de la tinción tricrómica de Masson utilizando tejido cardíaco recolectado a las 8 semanas mostraron un área de fibrosis (%), que fue significativamente menor en los grupos de tratamiento combinado que en los otros grupos (Fig. 7b-d). En conjunto, nuestros resultados sugirieron claramente que el tratamiento combinado resultó en una reparación cardíaca integral a través de una regeneración vascular mejorada y que las SDF-eMSC contribuyeron, al menos en cierta medida, a la protección indirecta del miocardio contra la lesión isquémica a través de la secreción constante de citocinas SDF citoprotectoras.

En el presente estudio, buscamos desarrollar una estrategia multifacética para lograr una neovascularización terapéutica eficaz mediante el uso de hiPSC-EC y SDF-eMSC, posiblemente a través de la inducción simultánea de vasculogénesis y angiogénesis postnatales (Fig. 8). Observamos que las hiPSC-EC inyectadas intramiocárdicamente dieron como resultado la formación exitosa de vasos de novo a través de un mecanismo de vasculogénesis posnatal, mientras que las SDF-eMSC-PA implantadas epicárdicamente promovieron de manera efectiva la angiogénesis de los vasos del huésped existentes del corazón MI, así como los vasos recién formados de las hiPSC-EC inyectadas a través de la secreción continua de citoquinas proangiogénicas, particularmente SDF-1α.

La mejora de la función cardíaca y la regeneración vascular integral lograda por la plataforma combinada con hiPSC-EC y SDF-eMSC-PA.

Aparentemente, los SDF-eMSC-PA proporcionaron un microambiente favorable para los hiPSC-EC inyectados por vía intramiocárdica, lo que mejoró su supervivencia, migración y retención en los corazones isquémicos. Más importante aún, los SDF-eMSC-PA indujeron sustancialmente la maduración vascular posterior desde el estado primitivo de los vasos de novo formados por los hiPSC-EC a vasos funcionalmente perfundibles más grandes. En conjunto, estos efectos sinérgicos de hiPSC-EC y SDF-eMSC-PA lograron finalmente una regeneración vascular completa en los corazones expuestos a IM. De hecho, numerosos estudios previos han intentado la neovascularización terapéutica dirigida a la vasculogénesis o la angiogénesis por separado con múltiples tipos de células, incluidas las EPC, las hMSC o las células progenitoras cardíacas11,30,31,32,33. En comparación con estudios anteriores, este estudio, hasta donde sabemos, es el primero en inducir la neovascularización inclusiva a través de la inducción de la vasculogénesis y la angiogénesis juntas mediante el uso de dos tipos de células madre principales distintas que se administraron a través de dos rutas diferentes.

Para lograr la vasculogénesis posnatal en corazones con infarto de miocardio, empleamos hiPSC-EC principalmente debido a su potencial vasculogénico relativamente mayor y similitudes con las EC primarias humanas en términos de expresión de genes específicos del endotelio y proteínas estructurales, así como características fisiológicas como la formación de tubos, Captación de LDL y formación de capilares in vivo. Varios estudios preclínicos han demostrado que las hPSC-EC se pueden usar para injertar, alinear y acoplar con éxito con los capilares del huésped para aumentar la vascularización34,35. Lo que es más importante, las hPSC-EC restauraron la perfusión en modelos de isquemia de las patas traseras y aceleraron la cicatrización de heridas, lo que representa una fuente ideal de células para tratar enfermedades vasculares36,37,38. Aunque se ha sugerido que las hPSC-EC poseen un potencial vasculogénico comparativamente más alto que otros tipos de células investigados previamente, el estudio actual y otros demuestran consistentemente que el tratamiento solo con hPSC-EC puede ser insuficiente para generar una cantidad adecuada de nuevos vasos sanguíneos en el isquémico. corazón debido al ambiente extremadamente hostil en el corazón MI que sugiere la necesidad de apoyo adicional. Por lo tanto, para promover la vasculogénesis basada en hiPSC-EC e inducir la angiogénesis de los vasos del huésped, fabricamos un parche cardíaco encapsulando SDF-eMSC modificados genéticamente para liberar continuamente SDF-1α.

SDF-1α fue seleccionado como un importante inductor de la angiogénesis miocárdica porque esta molécula está estrechamente involucrada en múltiples fenómenos fisiológicos en las CE, como la proliferación celular, la supervivencia, la migración, la angiogénesis y los efectos antiapoptóticos39,40. No obstante, el uso terapéutico de SDF-1α está limitado por su corta vida media41. Por lo tanto, diseñamos BM-MSC humanos para facilitar la liberación continua de SDF-1α utilizando un vector lentiviral que codifica factores de reprogramación hTERT y c-Myc. Demostramos que el tratamiento de medios acondicionados de SDF-eMSC con hiPSC-EC cultivadas y HUVEC mejoró significativamente su potencial angiogénico, como una expresión mejorada de varios genes relacionados con la angiogénesis, proliferación de EC, migración y formación de tubos. Para garantizar la secreción persistente de SDF-1α y otros factores paracrinos favorables hacia el miocardio lesionado, generamos parches cardíacos derivados de hdECM para que sirvieran como reservorio celular dentro del área infartada. Para diseñar los parches cardíacos, desarrollamos una estrategia innovadora que involucra la preparación de hdECM porcina liofilizada optimizada para un almacenamiento conveniente y fácil transporte de ECM sin células mezcladas con SDF-eMSC como biotinta. Nuestros resultados mostraron que las SDF-eMSC parecían sobrevivir mejor dentro del parche hasta 8 semanas después del tratamiento, como lo demuestra el mayor número de MSC positivas para DiI. Los SDF-eMSC sobrevivientes secretaron constantemente factores paracrinos beneficiosos y promovieron la regeneración vascular al promover la vasculogénesis y la angiogénesis dependientes de hiPSC-EC y, en última instancia, rejuvenecieron el miocardio lesionado.

De hecho, la muerte celular significativa y las bajas tasas de injerto después del trasplante en el miocardio huésped son algunos de los obstáculos más críticos que limitan la regeneración vascular basada en células en el corazón isquémico. Curiosamente, nuestros análisis histológicos revelaron un aumento considerable en la retención y el injerto de hiPSC-EC inyectados por vía intramiocárdica, lo que indujo una regeneración vascular robusta y estable cuando se combinó con SDF-eMSC-PA epicárdicos. Por el contrario, la ausencia de SDF-eMSC-PA resultó en una rápida disminución en el número de hiPSC-EC durante 8 semanas. Por el contrario, su presencia aumentó en gran medida el número de hiPSC-EC supervivientes para la posterior formación de vasos. Por lo tanto, los factores paracrinos secretados por SDF-eMSC-PA inicialmente facilitaron la rápida estabilización de hPSC-EC inyectados y mejoraron la supervivencia y el injerto de hiPSC-EC, particularmente durante la etapa temprana de implantación. La mayor tasa de injerto es particularmente importante porque el éxito de la regeneración vascular basada en células depende en gran medida del número de células que sobreviven y se injertan dentro del corazón42.

Además, los SDF-eMSC-PA no solo promueven la regeneración vascular, sino que también contribuyen al agrandamiento vascular, así como a la transición a vasos sanguíneos funcionales, que se puede definir como una etapa inicial en la maduración de los vasos sanguíneos. El análisis histológico mostró que el número de vasos sanguíneos con un diámetro de > 5 μm, que es fisiológica y funcionalmente importante, tanto en el infarto como en las zonas fronterizas, en el corazón del grupo EC + PA fue sustancialmente mayor que en otros grupos experimentales. grupos, incluido el grupo hiPSC-EC solo. Como evidencia adicional, los resultados del ensayo de tapón de Matrigel in vitro sugirieron que el tratamiento con medios acondicionados derivados de SDF-eMSC mantuvo la integridad de los vasos derivados de hiPSC-EC durante más de 48 h en comparación con los vasos de control no tratados. Más interesante aún, los SDF-eMSC-PA parecían inducir la arterialización de los vasos sanguíneos, posiblemente al estimular la migración y el reclutamiento de células de músculo liso, ya que la cantidad de vasos positivos tanto para CD31 como para α-SMA fue significativamente mayor en EC + PA. grupo que en los otros grupos experimentales. En conjunto, estos resultados indican claramente que SDF-eMSC-PA contribuyó sustancialmente a la estabilidad e integridad vascular.

En resumen, proponemos una nueva estrategia para la regeneración vascular en corazones isquémicos a través de la inducción de hiPSC-ECs y SDF-eMSC-PA que no solo promueve la vasculogénesis basada en hiPSC-EC, sino que también estimula la angiogénesis de los vasos en los corazones infartados del huésped. Por tanto, nuestra novedosa estrategia terapéutica basada en un sistema dual puede utilizarse para la regeneración vascular y la reparación cardíaca.

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Esta investigación fue financiada por el Ministerio de Salud y Bienestar (#HI20C0184 para SHM), el Fondo de Medicina Regenerativa de Corea (#21A0403L1 para SJP y #NRF-2021M3E5E5096524 para JJ), el Ministerio de Seguridad de Alimentos y Medicamentos (#18172MFDS182 para HJP ) y la subvención del Programa de desarrollo de tecnología biomédica (#NRF-2017M3A9B3061954 para HJP). Este estudio también fue apoyado por el Consejo de Subvenciones de Investigación de Hong Kong (21100818 a KB), la Subvención de Investigación Aplicada de CityU (ARG a KB) y el fondo de proyecto TFBC (KB).

Estos autores contribuyeron por igual: Hyeok Kim, Soon-Jung Park, Jae-Hyun Park.

Departamento de Biomedicina y Ciencias de la Salud, Facultad de Medicina, Universidad Católica de Corea, Seúl, Corea del Sur

Hyeok Kim, Jae-Hyun Park, Bong-Woo Park, Ji-Won Hwang, Jin-Ju Kim, Woo-Sup Sim y Hun-Jun Park

División de Cardiología, Departamento de Medicina Interna, Hospital St. Mary de Seúl, Universidad Católica de Corea, Seúl, Corea del Sur

Hyeok Kim, Bong-Woo Park, Ji-Won Hwang, Jin-Ju Kim, Woo-Sup Sim y Hun-Jun Park

Instituto de Investigación, T&R Biofab Co., Ltd., Siheung, Corea del Sur

Parque Soon-Jung y Luna Sung-Hwan

Departamento de Ciencias Biomédicas, Universidad de la Ciudad de Hong Kong, Kowloon Tong, Hong Kong

Jae Hyun Park, Sunghun Lee y Kiwon Ban

SL BIGEN, Inc., Seongnam, Corea del Sur

Soon Min Lee y Hyo-Jin Kim

Departamento de Ingeniería TI Creativa y Escuela de Biociencia Interdisciplinaria y Bioingeniería, Universidad de Ciencia y Tecnología de Pohang, Pohang, Corea del Sur

Byeongmin Kang y Jinah Jang

Departamento de Urología, Facultad de Medicina, Universidad Católica de Corea, Seúl, Corea del Sur

Seung Hwan Jeon

División de Cardiología, Departamento de Medicina Interna, Universidad Católica de Corea, Seúl, Corea del Sur

Dong Bin Kim

Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad de Ciencia y Tecnología de Pohang, Pohang, Corea del Sur

Dong Woo Cho

Departamento de Biotecnología Animal, Universidad Sangji, Wonju, Corea del Sur

Luna Sung-Hwan

Centro de Investigación de Enfermedades de Muerte Celular, Facultad de Medicina, Universidad Católica de Corea, Seúl, Corea del Sur

Parque Hun-Jun

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Correspondencia con Sung-Hwan Moon, Hun-Jun Park o Kiwon Ban.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Kim, H., Park, SJ., Park, JH. et al. Estrategia de mejora para la regeneración vascular eficaz después de un infarto de miocardio a través de un enfoque dual de células madre. Exp Mol Med 54, 1165–1178 (2022). https://doi.org/10.1038/s12276-022-00827-8

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Recibido: 07 Diciembre 2021

Revisado: 08 de marzo de 2022

Aceptado: 21 de marzo de 2022

Publicado: 16 agosto 2022

Fecha de emisión: agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s12276-022-00827-8

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