Caracterización de resistomas antibióticos por bacteriófagos reprogramados

Nature Microbiology volumen 8, páginas 410–423 (2023)Citar este artículo

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La metagenómica funcional es una poderosa herramienta experimental para identificar genes de resistencia a los antibióticos (ARG) en el medio ambiente, pero la gama de especies bacterianas huésped adecuadas es limitada. Esta limitación afecta tanto al alcance de los ARG identificados como a la interpretación de su relevancia clínica. Aquí presentamos una canalización de metagenómica funcional llamada Metagenómica funcional multiespecie asistida por partículas de bacteriófagos reprogramados (DEEPMINE). Este enfoque combina y mejora el uso del bacteriófago T7 con fibras de la cola intercambiadas y mutagénesis dirigida para expandir la especificidad del huésped del fago y la eficiencia para la metagenómica funcional. Estas partículas de fago modificadas se utilizaron para introducir grandes bibliotecas de plásmidos metagenómicos en patógenos bacterianos clínicamente relevantes. Mediante la detección de ARG en microbiomas intestinales y del suelo y genomas clínicos frente a 13 antibióticos, demostramos que este enfoque amplía sustancialmente la lista de ARG identificados. Muchos ARG tienen efectos específicos de especies sobre la resistencia; proporcionan un alto nivel de resistencia en una especie bacteriana pero dan una resistencia muy limitada en una especie relacionada. Finalmente, identificamos ARG móviles contra antibióticos que se encuentran actualmente en desarrollo clínico o han sido aprobados recientemente. En general, DEEPMINE amplía la caja de herramientas de metagenómica funcional para estudiar comunidades microbianas.

La metagenómica permite el análisis exhaustivo de comunidades microbianas, incluidas especies que no se pueden cultivar en condiciones de laboratorio. Mediante la extracción de datos genómicos de muestras ambientales, los investigadores adquieren conocimientos sobre la composición de las especies y la funcionalidad del microbioma en una variedad de entornos naturales1. En particular, la metagenómica funcional se dedica a examinar el ADN metagenómico para detectar la presencia de genes que codifican funciones moleculares específicas2,3,4. La clonación y expresión de ADN metagenómico fragmentado en un huésped bacteriano puede revelar proteínas no descritas anteriormente. Las aplicaciones de la metagenómica funcional incluyen la identificación de enzimas, la exploración de agentes bioactivos y la detección de genes de resistencia a los antibióticos que residen en el medio ambiente5,6,7,8. Las bibliotecas suelen contener millones de fragmentos de ADN, lo que corresponde a una cobertura total de 5 a 100 Gb, del tamaño de miles de genomas bacterianos7,9,10.

Aunque la metagenómica funcional puede ser potencialmente útil para varias áreas de investigación, en su forma actual la metodología está lejos de ser perfecta, lo que limita su aplicabilidad. Dado el enorme tamaño de las bibliotecas de plásmidos, la introducción eficiente de estas bibliotecas en un huésped bacteriano es de vital importancia. Sin embargo, este proceso, generalmente por electroporación, conjugación o transducción de bacteriófagos convencional, es engorroso y solo es eficiente para una gama limitada de cepas de laboratorio11,12. Esta limitación tiene consecuencias de gran alcance sobre la aplicabilidad de las pantallas metagenómicas funcionales y la generalidad de las conclusiones que se pueden extraer13,14. Por ejemplo, dificulta la detección de genes biotecnológica o clínicamente relevantes que son funcionales solo en especies bacterianas específicas 12,15,16. En particular, la mayoría de las pruebas metagenómicas para genes de resistencia a antibióticos (ARG) dependen en gran medida del uso de cepas de laboratorio de Escherichia coli como hospedadores bacterianos5,17,18. Por lo tanto, los ARG que no proporcionan resistencia en estas cepas pero sí en otros patógenos clínicamente relevantes siguen siendo indetectables. De hecho, estudios previos indican que el impacto de las mutaciones de resistencia a los antibióticos en los fenotipos de resistencia depende de los antecedentes genéticos de la bacteria huésped19. Además, las pantallas metagenómicas en múltiples bacterias huésped podrían proporcionar información valiosa sobre la compatibilidad funcional entre especies y la movilidad de los ARG20.

En este artículo, presentamos la metagenómica funcional multiespecie asistida por partículas de bacteriófagos reprogramados (DEEPMINE), que proporciona una solución a estos problemas (Fig. 1a). DEEPMINE se basa en un trabajo anterior que pretendía ampliar la gama de huéspedes de las partículas del fago T7 para la transducción de ADN intercambiando las colas entre diferentes tipos de bacteriófagos21. DEEPMINE emplea tales partículas transductoras de bacteriófagos modificados para entregar grandes bibliotecas de plásmidos metagenómicos en una variedad de especies bacterianas. Además, aplicamos la evolución de laboratorio dirigida para aumentar la eficiencia de dicha entrega de bibliotecas22. Usando este enfoque, realizamos pantallas metagenómicas en patógenos bacterianos clínicamente relevantes de la familia Enterobacteriaceae. Identificamos varios ARG no informados previamente con efectos específicos de especie sobre la susceptibilidad a los antibióticos. Además, estudiamos un conjunto de antibióticos que recientemente se aprobaron para uso clínico o que se encuentran en una etapa avanzada de desarrollo clínico, y demostramos que estos nuevos antibióticos son tan propensos a la formación de resistencia como los antibióticos antiguos después de décadas de uso clínico (Datos extendidos Tabla 1).

a, Resumen esquemático de DEEPMINE. DEEPMINE emplea partículas transductoras de bacteriófagos T7 híbridos y evolución dirigida para alterar la especificidad y la eficiencia del huésped del fago para la metagenómica funcional en cepas clínicas objetivo. El ADN ambiental en forma de biblioteca de plásmidos metagenómicos se empaqueta luego en estas partículas de bacteriófagos y se transduce en los huéspedes de interés. El análisis comparativo de los resultados de la detección se realiza mediante una canalización de secuenciación de fragmentos de ADN sin PCR con código de barras doble. b, la transducción de la biblioteca metagenómica funcional por partículas de bacteriófagos T7 híbridos específicos es al menos tan eficiente como la electroporación (electroporación en E. coli frente a transducción en K. pneumoniae P = 0,010545, prueba t unilateral de dos muestras, n = 3 biológicamente independientes experimentos: electroporación en E. coli frente a transducción en S. enterica P = 0,15, prueba t unilateral de dos muestras, n = 3 experimentos biológicamente independientes, tabla complementaria 2). Media ± sem c,d, longitudes de fragmentos de ADN metagenómico entregados (c) y diversidades (d), determinadas mediante el uso de secuenciación profunda de lectura larga sin PCR justo después de la electroporación y la transducción (Métodos). Las líneas discontinuas representan el tamaño promedio de los fragmentos de ADN. Los índices de diversidad alfa de Shannon (H) se calcularon sobre la base de la frecuencia de fragmentos con secuencias idénticas en las bibliotecas (consulte Métodos, n = 276 899, n = 188 317 y n = 180 497 para E. coli, K. pneumoniae y S. enterica , respectivamente; Tabla complementaria 3). Tenga en cuenta que solo se secuenció una fracción de las bibliotecas entregadas.

Primero probamos si las partículas de bacteriófagos T7 híbridos con proteínas de cola intercambiadas son herramientas adecuadas para entregar bibliotecas de plásmidos metagenómicos funcionales en cultivos bacterianos. En resumen, creamos bibliotecas metagenómicas para obtener resistomas ambientales y clínicos23, incluidas (1) muestras de suelo y sedimentos de ríos de siete sitios industriales contaminados con antibióticos en las inmediaciones de las plantas de producción de antibióticos en la India (es decir, microbioma de suelo antropogénico)24,25 , (2) muestras fecales de 10 individuos europeos que no habían tomado ningún antibiótico durante al menos 1 año antes de la donación de la muestra (es decir, microbioma intestinal) y (3) muestras de un grupo de 68 bacterias resistentes a múltiples fármacos aisladas en centros de atención médica u obtenido de colecciones de cepas (es decir, microbioma clínico; consulte Métodos, Fig. 1a y Tabla complementaria 1).

Los fragmentos de ADN que oscilaban entre 1,5 y 5 kb de tamaño se clonaron al azar en un plásmido de clonación de pocas copias capaz de replicarse en órdenes seleccionados de la clase Gammaproteobacteria26 (ver Métodos). El ADN del plásmido lleva una secuencia de señal de empaquetamiento que permite la translocación del plásmido en el bacteriófago T7 independientemente del genoma T7 (Fig. 1a). Cada biblioteca construida contenía de 3 a 5 millones de fragmentos de ADN, lo que corresponde a una cobertura total de 25 Gb (es decir, el tamaño de ~5000 genomas bacterianos). Las bibliotecas de plásmidos resultantes se empaquetaron en dos partículas de fago T7 híbridas previamente caracterizadas que muestran proteínas de fibra de cola del fago ΦSG-JL2 de Salmonella y el fago K1121 de Klebsiella. Las tres bibliotecas metagenómicas se transdujeron en Salmonella enterica subsp. enterica serovariedad Typhimurium str. LT2 y K. pneumoniae NCTC 9131, ambos objetivos bacterianos conocidos de estas dos partículas de bacteriófagos T7 híbridos21. Paralelamente, electroporamos las bibliotecas en la bacteria modelo E. coli K12 (Métodos). Finalmente, analizamos si la transducción por partículas del fago T7 introduce algún sesgo en el tamaño y la composición de las bibliotecas (Métodos).

Sorprendentemente, tanto el ΦSG-JL2 como el K11, las partículas híbridas de bacteriófago T7 que muestran la cola, entregaron las bibliotecas de plásmidos a su cepa bacteriana objetivo al menos tan eficientemente como lo hace la electroporación en la cepa modelo de E. coli de laboratorio (Fig. 1b y Tabla complementaria 2). En particular, la cantidad máxima de plásmidos entregados a la bacteria huésped fue al menos dos órdenes de magnitud mayor por transducción que por electroporación (Datos extendidos Fig. 1a y Tabla complementaria 2).

Además, la secuenciación profunda de lectura larga muestra que tanto los tamaños promedio de fragmentos de ADN como las diversidades de fragmentos de las bibliotecas administradas por partículas de fago T7 son comparables a las de la biblioteca administrada por electroporación en E. coli (Fig. 1c, d y Tabla complementaria 3). Esto indica que la transducción por partículas de bacteriófagos reprogramados no tiene un efecto distorsionador serio sobre el tamaño y la diversidad de las bibliotecas metagenómicas entregadas. Finalmente, secuenciamos el contenido de plásmido de 38 clones bacterianos individuales aislados después de la transducción de fagos. De manera tranquilizadora, la cotransducción de dos plásmidos en la misma célula, un fenómeno que da como resultado falsos positivos en autostopistas en una campaña de detección, se detectó en solo el 5 % de las células, mientras que la cotransducción de dos plásmidos en la misma célula mediante electroporación ocurrió en el 10% de las celdas (Datos extendidos Fig. 1b). En general, estos resultados indican que ciertas partículas de bacteriófagos transductores de T7 con fibras de la cola intercambiadas son vehículos de administración adecuados para la metagenómica funcional.

Nuestro siguiente objetivo fue generalizar nuestro enfoque para la participación de especies de patógenos bacterianos adicionales. Las eficiencias de transducción de la mayoría de las partículas de fagos híbridos están muy por debajo del umbral (>107 transductores por ml) requerido para la entrega de bibliotecas metagenómicas funcionales completas en las células bacterianas diana21. Además, la entrega de tales bibliotecas requiere el uso de altas concentraciones de partículas de fago transductor. En tales casos, la contaminación por fagos replicativos, un problema común de la transducción de la generación de partículas de bacteriófagos27, mata una gran fracción de las células diana (Datos ampliados, Fig. 1c).

Para superar estos dos problemas, establecimos un experimento de evolución dirigida para modificar genéticamente las regiones de la fibra de la cola en las partículas del fago T7. Específicamente, nuestro objetivo fue seleccionar mutaciones puntuales en las regiones determinantes del rango del huésped (HRDR) de las fibras de la cola del fago que alteran la especificidad del huésped28,29. Con este fin, primero seleccionamos tres fibras de la cola (fago T7 de Escherichia, fago ΦSG-JL2 de Salmonella y fago Vi06 de Salmonella) con rangos de huéspedes especialmente amplios21. Luego, identificamos HRDR potenciales en el gen de la fibra de la cola gp17 del fago ΦSG-JL2 de Salmonella y vi06_43 del fago Vi06 de Salmonella. La identificación se basó en la homología de secuencia con cuatro HRDR en el dominio de unión al receptor (RBD) del gen gp17 de fibra de cola de fago T7 y T3 bien caracterizado (Métodos y Tabla complementaria 4)28,29. A continuación, introdujimos mutaciones distribuidas aleatoriamente dentro y cerca de los HRDR de los genes de la fibra de la cola derivados de los fagos ΦSG-JL2, Vi06 y T7 utilizando un método de mutagénesis dirigida al sitio de alta frecuencia llamado DIvERGE (Fig. 2a y Métodos)22. En comparación con otros protocolos de mutagénesis, DIvERGE tiene la ventaja de introducir mutaciones aleatorias a lo largo de múltiples sitios de ADN simultáneamente y puede cubrir segmentos de ADN relativamente largos, potencialmente más allá de los HRDR predichos22.

a, Resumen esquemático del experimento de evolución dirigida que consta de los siguientes pasos. (1) Mutagénesis de cola de fago en E. coli utilizando DIvERGE. DIvERGE es una técnica de recombinación que incorpora oligonucleótidos de ADN monocatenario (ss) aleatorizados suaves en múltiples sitios objetivo (Métodos). Las colas de fago están codificadas en plásmidos empaquetables. (2) Infección de E. coli con T7 que carece de los genes de la cola (T7Δ(gp11-12-17)). Este paso genera partículas de fago mutadas, cada una de las cuales contiene el plásmido codificante de cola de fago mutante afín. (3) Selección de variantes de cola de fago que inyectan ADN en las células diana seleccionadas (1–3) con mayor eficiencia. La presión de selección la ejerce un antibiótico frente al cual se codifica un marcador de selección de antibiótico en el plásmido. b, Eficiencias de transducción (tfu ml-1) de las fibras de cola mutantes más eficientes en comparación con las colas WT parentales. Las células diana son Enterobacter cloacae ATCC 23355, Shigella sonnei HNCMB 25021 y E. coli NCTC 13351, así como la cepa modelo de E. coli resistente a los fagos (BW25113ΔtrxAΔwaaR). Media ± sem (n = 3 experimentos biológicamente independientes). Los datos están disponibles en la Tabla complementaria 4.

Usando un protocolo de optimización de transducción21, luego seleccionamos variantes de cola de fago con una capacidad mejorada para entregar bibliotecas de plásmidos en representantes de tres especies bacterianas patógenas: Enterobacter cloacae ATCC 23355, Shigella sonnei HNCMB 25021 y E. coli NCTC 13351 (Métodos, Fig. 2b y Tabla complementaria 4). Simultáneamente, como control positivo, seleccionamos la biblioteca de colas de fagos T7 con el mismo protocolo en presencia de una cepa modelo de E. coli resistente a fagos (BW25113ΔtrxAΔwaaR) con receptores de lipopolisacáridos incrustados en la pared celular deficientes de fagos similares a T730,31.

Como resultado de la evolución dirigida, la eficiencia de transducción de ADN mejoró de uno a siete órdenes de magnitud en las tres cepas bacterianas patógenas probadas (Fig. 2b). Con Shigella sonnei HNCMB 25021, la eficiencia de transducción alcanzó el nivel adecuado para la entrega de bibliotecas completas de plásmidos metagenómicos (Fig. 2b). En el caso de la cepa modelo de control positivo ΔwaaR, los mutantes T7 gp17 HRDR más eficientes tienen combinaciones específicas de mutaciones, el 28 % de las cuales se describieron previamente como mutaciones adaptativas (Datos ampliados Fig. 2a-c). En general, las mutaciones adaptativas aumentaron la eficiencia de transducción (Fig. 2b, datos extendidos, Fig. 2d y tabla complementaria 4), y al menos en un caso (T7 gp17V544G (Mut1 en la Fig. 2b) con Shigella sonnei HNCMB 25021), también minimizó contaminación por fagos replicativos (para obtener una explicación, consulte la figura 3 de datos ampliados y la tabla complementaria 5). De manera tranquilizadora, la transducción de las tres bibliotecas metagenómicas en Shigella sonnei HNCMB 25021 por esta variante de cola de fago T7 resultó en bibliotecas metagenómicas funcionales que son tan grandes y diversas como la biblioteca lograda por electroporación en la cepa E. coli K12 (Datos extendidos Fig. 4 y tablas complementarias 2 y 3). En general, encontramos que la evolución dirigida de la cola del fago mejora la entrega de bibliotecas metagenómicas en cepas bacterianas previamente sin explotar en comparación con la entrega de las mismas bibliotecas por electroporación.

Nuestro siguiente objetivo era mejorar el muestreo del resistoma antibiótico bacteriano a través de la metagenómica funcional en múltiples huéspedes bacterianos. Con este fin, seleccionamos las tres bibliotecas metagenómicas descritas anteriormente (suelo, intestino, clínica) en tres hospedadores bacterianos patógenos (Salmonella enterica LT2, K. pneumoniae NCTC 9131 y Shigella sonnei HNCMB 25021) y en E. coli BW25113. Las pantallas se realizaron en agar sólido en presencia de uno de los 13 antibióticos seleccionados que cubren cinco clases principales de antibióticos (Tabla 1 de datos ampliados) en concentraciones en las que las cepas huésped de tipo salvaje (WT) son susceptibles. La lista incluye seis antibióticos (doxiciclina (DOX), gentamicina (GEN), cefdinir (CFD), cefoxitina (CEF), meropenem (MER) y moxifloxacino (MOX)) con una larga historia clínica ('viejos'), y otros siete ( eravaciclina (ERA), omadaciclina (OMA), sulfato de apramicina (APS), ceftobiprol (CEF), sulopenem (SUL), delafloxacina (DEL) y gepotidacina (GEP)) que se han introducido recientemente en la clínica (después de 2017) o están actualmente en desarrollo clínico ("reciente", a partir de abril de 2020, tabla de datos ampliados 1). Todos los antibióticos estudiados, incluido CEF32, han demostrado actividad contra patógenos Gram-negativos. Cabe destacar que el APS se ha utilizado en medicina veterinaria durante más de una década, pero actualmente se encuentra en fase de ensayo clínico para tratar infecciones sistémicas por gramnegativos en humanos33.

Los plásmidos que confieren resistencia obtenidos se agruparon y secuenciaron con una canalización de secuenciación de biblioteca de expresión de escopeta de código de barras dual modificada (Datos extendidos, Fig. 5 y Métodos; consulte también la referencia 34). El protocolo evita la amplificación por PCR de fragmentos de ADN que confieren resistencia, preservando así la composición original de las muestras. Al alinear las secuencias de ADN obtenidas con genes de resistencia a antibióticos en bases de datos relevantes35,36, encontramos que el 84 % de los 571 fragmentos mostraban suficiente similitud de secuencia (Métodos) con genes de resistencia conocidos (Tabla complementaria 6). Dado que muchos de los ARG detectados se aislaron en varios fragmentos de ADN diferentes, los ARG se agruparon en un 95 % de identidad y cobertura para reducir la redundancia de secuencias en el conjunto de datos37. Para cuantificar la reproducibilidad de la tubería, repetimos el protocolo completo (entrega de una biblioteca, detección y secuenciación) con K. pneumoniae. De manera tranquilizadora, el 83,3% de los ARG se aislaron en ambas réplicas biológicas (Fig. 3a).

a, Reproducibilidad de la tubería. El diagrama de Venn muestra el número de ARG detectados en dos pantallas replicadas biológicas con K. pneumoniae. La intersección representa los ARG aislados en ambas réplicas, lo que corresponde a una reproducibilidad del 83% (Tabla complementaria 6). b, Diagrama de Venn que muestra el número de ARG aislados utilizando E. coli y el resto de especies hospedantes. Cuando se usó E. coli como único huésped, el 43 % del total de 114 ARG permaneció sin detectar (Tabla complementaria 6). c, Mapa de calor que muestra las familias de genes de los ARG identificados utilizando las cuatro especies huésped. El código de colores cuantifica el número de ARG identificados que pertenecen a la familia de genes (Tabla complementaria 7). d, Número de ARG identificados en los cuatro hosts en los tres resistomas usados ​​(Tabla complementaria 6). e, Número de ARG móviles (representados como HGT para indicar la detección de participación en la transferencia horizontal de genes) y no móviles (representados como no HGT para indicar la falta de participación en la transferencia horizontal de genes) presentes en contigs múltiples y únicos en el bibliotecas metagenómicas (prueba exacta de Fisher bilateral, P = 1,058 × 10−5, n = 114; Tabla complementaria 6).

En total, se detectaron 114 ARG, muchos de los cuales estaban presentes en múltiples fragmentos de ADN (Tablas complementarias 6 y 7). El análisis también reveló diferencias sustanciales en los repertorios ARG identificados en las cuatro especies bacterianas huésped examinadas. En particular, cuando el análisis se restringió a E. coli como huésped bacteriano, el 43 % del total de 114 ARG permaneció sin detectar (Fig. 3b–d y Datos extendidos, Fig. 6). Esto indica que DEEPMINE permite un muestreo más completo de los resistomas bacterianos mediante la utilización de múltiples bacterias huésped. Las bombas de eflujo, sus reguladores transcripcionales correspondientes y las enzimas que inactivan antibióticos eran comunes entre los ARG detectados (Fig. 3c y Datos extendidos, Fig. 7a). Una fracción sustancial de los ARG aislados del intestino, el suelo y los microbiomas clínicos se originaron a partir de proteobacterias, que son parientes filogenéticamente cercanos de las especies bacterianas huésped en nuestras pantallas (Datos extendidos Fig. 7b).

Luego, determinamos si los ARG detectados en nuestra pantalla son propensos a la transferencia horizontal de genes en la naturaleza. Los ARG que se han movilizado en el pasado en entornos asociados con humanos pueden representar un mayor peligro para la salud, ya que tienen el potencial de generalizarse entre los patógenos humanos38. Para investigar este problema, generamos un catálogo de genes móviles sobre la base de la identificación de genes casi idénticos que son compartidos por genomas bacterianos relacionados de forma distante37,39,40. Específicamente, llevamos a cabo la alineación por pares de 2794 genomas de especies bacterianas relacionadas con humanos filogenéticamente diversas (Tabla complementaria 8). Este conjunto de datos se amplió con una base de datos de secuencias de 27 939 plásmidos naturales derivados de diversos entornos (ref. 41, Métodos). Era especialmente probable que los ARG transportados por plásmidos se transfirieran entre especies bacterianas, con una concordancia del 91 % entre los dos conjuntos de datos sobre ARG móviles (Tabla complementaria 7). Sorprendentemente, los ARG presentes en múltiples fragmentos de ADN en nuestra pantalla se sometieron con mayor frecuencia a la transferencia horizontal de genes en la naturaleza en comparación con los ARG que solo están presentes en un solo fragmento de ADN (Fig. 3e).

A continuación, preguntamos cómo se puede explicar la variación en los repertorios ARG detectados en los cuatro huéspedes bacterianos. La primera hipótesis fue que ciertos ARG permanecen sin ser detectados debido a la pérdida estocástica de plásmidos. Esto puede ocurrir durante la transducción de la biblioteca metagenómica en sus nuevos huéspedes o durante el proceso de selección. Alternativamente, los ARG transferidos pueden no ser funcionalmente compatibles con la fisiología de todos los huéspedes bacterianos20. Por lo tanto, varios ARG proporcionan resistencia solo en especies bacterianas específicas. Si bien la primera hipótesis es ciertamente relevante, varias líneas de evidencia indican diferencias sustanciales en el fenotipo de resistencia de los ARG entre especies bacterianas.

Para probar estas hipótesis, primero examinamos cómo los fragmentos de ADN que proporcionan resistencia a los antibióticos en E. coli dan forma a la susceptibilidad a los antibióticos en las otras tres especies bacterianas huésped. Analizamos un conjunto representativo de 13 fragmentos de ADN que confieren resistencia derivados de nuestras pantallas midiendo los niveles de resistencia a los antibióticos que proporcionan en los huéspedes bacterianos. Como se han detectado ciertos ARG en múltiples exámenes de antibióticos, estudiamos 20 combinaciones de fragmentos de ADN-antibiótico en total (Fig. 4a). En siete de los 20 casos estudiados, el fragmento de ADN no proporcionó cambios en el nivel de resistencia en al menos una de las otras tres especies bacterianas (utilizando un cambio doble en las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) como punto de corte). Por lo tanto, en promedio, solo el 80% de los ARG funcionales se superpusieron entre los pares de E. coli y las otras tres especies. Además, observamos una variación sustancial, de hasta 256 veces, en el nivel de resistencia proporcionado por los fragmentos de ADN específicos (Fig. 4a y Tabla complementaria 9). Las bombas de eflujo, las proteínas reguladoras de la transcripción y las enzimas modificadoras de antibióticos mostraron una variación tan importante en los niveles de resistencia entre las especies bacterianas estudiadas (Fig. 4a).

a, Mapa de calor que muestra una variación sustancial en los niveles de resistencia proporcionados por los 13 fragmentos de ADN que confieren resistencia en las cuatro especies huésped. El código de color cuantifica los cambios de pliegue MIC. El color blanco significa que no hay cambios en el nivel de resistencia, utilizando un cambio doble en MIC como punto de corte. Los datos están disponibles en la Tabla complementaria 9. b, Coeficientes de similitud de Jaccard ajustados que representan las superposiciones de conjuntos ARG funcionales entre pares de especies huésped después de controlar el ruido de medición (consulte Métodos y datos extendidos, Fig. 8). Los números entre paréntesis representan intervalos de confianza del 95 % (Métodos).

Finalmente, volvimos a investigar todos los fragmentos de ADN que confieren resistencia detectados en las pantallas metagenómicas. Agrupamos los plásmidos correspondientes y volvimos a introducir la biblioteca de plásmidos preseleccionada resultante en cada una de las cuatro especies nativas de bacterias huésped. Posteriormente, realizamos nuevas pantallas de selección de antibióticos con esta biblioteca en agar sólido, como se describió anteriormente. Para controlar la pérdida estocástica de plásmidos durante la transducción, secuenciamos la nueva biblioteca de plásmidos antes y después de la selección de antibióticos. De los ARG, el 70 % (80 de 114) estaban representados por al menos un plásmido en las cuatro especies hospedadoras bacterianas después de la transducción, pero antes de la selección del antibiótico (Tabla complementaria 10). Después de la selección de antibióticos, se detectó que 63 de estos ARG mostraban actividad antibacteriana en al menos una de las cuatro especies bacterianas huésped (Tabla complementaria 10). En particular, 16 de los 17 ARG perdidos durante la selección de antibióticos fueron codificados por un solo fragmento de ADN que confiere resistencia (Datos extendidos Fig. 8a). Después de ajustar las superposiciones con la precisión de la pantalla (Datos extendidos Fig. 8b), en promedio, el 70 % de los ARG se superpusieron entre pares de especies (Fig. 4b y Datos extendidos Fig. 8c). En total, solo ~46 % de los ARG (~29 de 63) proporcionaron resistencia en las cuatro especies bacterianas huésped (Datos ampliados, Fig. 8d). Claramente, el trabajo futuro en conjuntos de datos metagenómicos más grandes debería revelar las características bioquímicas, celulares y filogenéticas exactas que dan forma a los perfiles de especificidad de especie de los ARG.

Juntos, estos resultados indican que los ARG, cuando se transfieren a nuevos huéspedes bacterianos, con frecuencia tienen efectos específicos de especie sobre la susceptibilidad a los antibióticos.

A continuación, estimamos cuán propensos son los antibióticos "recientes" a la movilización de ARG en comparación con los antibióticos "antiguos". Descubrimos que los números generales de ARG son estadísticamente iguales para los dos grupos de antibióticos (Fig. 5a, Tabla 1), independientemente de los microbiomas que se consideraron (Datos extendidos Fig. 9a). Además, cuando el análisis se restringió a los ARG con eventos de transferencia horizontal de genes establecidos, los resultados anteriores se mantuvieron (Fig. 5b y Datos extendidos, Fig. 9b). Como era de esperar, los mecanismos de resistencia se superponen en gran medida entre los antibióticos "antiguos" y "recientes" que pertenecen a las mismas clases de fármacos (Fig. 5c), lo que sugiere que la resistencia cruzada podría ser frecuente. CEF, una cefalosporina de quinta generación que recientemente ha sido aprobada para el tratamiento de la neumonía adquirida en el hospital y la comunidad42,43 destaca este punto. Tanto la frecuencia general de ARG (por ejemplo, β-lactamasas) como la frecuencia de ARG móviles fueron excepcionalmente altas frente a CEF (Tabla 1), incluso cuando se comparan con los antibióticos β-lactámicos "antiguos" con décadas de uso clínico (Fig. 5a–c). De hecho, las β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) generalmente hidrolizan el ceftobiprol44, por lo que su utilidad clínica frente a patógenos gramnegativos multirresistentes que producen dichas BLEE es limitada45.

a, el número total de ARG es estadísticamente el mismo para antibióticos "recientes" y "antiguos" (prueba de suma de rangos de Wilcoxon bilateral, P = 0,8051, n = 107 para "antiguos" y n = 114 para "recientes"; Tabla complementaria 7). b, Lo mismo es cierto para los ARG con eventos de transferencia de genes horizontales establecidos (P = 0,6106, prueba de suma de rangos de Wilcoxon bilateral, n = 27 y 23 para antibióticos "antiguos" y "recientes", respectivamente; Tabla complementaria 7). c, Los mecanismos de resistencia se superponen en gran medida entre los antibióticos "antiguos" y "recientes" que pertenecen a las mismas clases de fármacos. El mapa de calor muestra la agrupación de los antibióticos en función de los perfiles ARG. La codificación por colores cuantifica el número de ARG detectados que se agrupan por mecanismo. Los datos están disponibles en la Tabla complementaria 7.

Una notable excepción a esta tendencia es APS, un antibiótico en ensayo clínico para su aplicación en humanos. Solo se detectó un único ARG contra este antibiótico en el resistoma intestinal y ninguno en la colección agrupada de aislados clínicos (Tabla complementaria 7). Sin embargo, de acuerdo con el uso extensivo de APS en medicina veterinaria durante décadas, se detectaron múltiples ARG contra APS en el microbioma del suelo (Fig. 5c). Los ARG identificados son en su mayoría aminoglucósidos acetiltransferasas que son funcionalmente compatibles en múltiples huéspedes patógenos (Tabla 1, Tabla complementaria 7 y Fig. 5c). Esto sugiere que estos genes pueden tener un riesgo clínico potencial en el futuro. De acuerdo con esta expectativa, una de estas aminoglucósidos acetiltransferasas, AAC(3)-IV, ya ha sido detectada en bacterias clínicas resistentes a APS46. En general, DEEPMINE podría ser una herramienta útil para predecir ARG actualmente solo detectables en microbiomas no asociados a humanos con posibles implicaciones para la salud.

En este trabajo, presentamos DEEPMINE, un enfoque que amplía la gama de especies bacterianas huésped aplicables en metagenómica funcional. Trabajos anteriores demostraron que la gama de huéspedes de bacteriófagos se puede ampliar intercambiando la fibra de la cola del fago T7 de E. coli o generando mutaciones aleatorias en los genes que codifican la fibra de la cola de T721. DEEPMINE emplea tales partículas transductoras de bacteriófagos reprogramadas con fibras de cola intercambiadas y/o mutagenizadas para entregar grandes bibliotecas de plásmidos metagenómicos en una variedad de especies bacterianas (Fig. 1). La principal ventaja de DEEPMINE frente a las técnicas existentes de metagenómica funcional, como la electroporación o la conjugación, es su mayor eficiencia. En particular, descubrimos que DEEPMINE es más adecuado para introducir bibliotecas de plásmidos metagenómicos de inserción pequeña (1,5 kb–5 kb) en los hospedadores bacterianos seleccionados que la electroporación (Fig. 1 y Datos extendidos Fig. 1)4,47. Si bien la conjugación se usa con frecuencia para entregar bibliotecas con insertos de gran tamaño (10 kb–40 kb) que normalmente contienen 104–105 clones, es muy difícil obtener más de 106–107 transconjugantes con esta técnica48,49. Por otro lado, una biblioteca metagenómica de inserción pequeña (1,5 kb–5 kb) como la utilizada en este estudio generalmente requiere más de > 108 plásmidos para entregar bibliotecas con suficiente cobertura.

Usando nuestro enfoque, realizamos 156 pantallas metagenómicas con todas las combinaciones posibles de 13 antibióticos, tres bibliotecas metagenómicas (aisladas del suelo, intestino y microbiomas clínicos) y cuatro especies de Enterobacteriaceae relacionadas. Demostramos que al estudiar múltiples especies huésped, el resistoma bacteriano se expande sustancialmente; El 43% de los ARG que no se superponen permanecen sin detectar cuando se consideró una sola especie (E. coli) (Fig. 3). En consecuencia, DEEPMINE permite la identificación de ARG que brindan resistencia solo en patógenos específicos clínicamente relevantes. De hecho, identificamos un gran conjunto de ARG contra antibióticos desarrollados recientemente con potencial para convertirse en futuros riesgos para la salud (Fig. 5). En base a estos resultados, anticipamos que DEEPMINE será una herramienta útil para predecir la futura difusión de los ARG por los que existe un creciente interés general6,16,37,38,50. Sin embargo, la limitación actual de DEEPMINE es que requiere mucho tiempo y recursos diseñar partículas de fago adecuadas para permitir que las bacterias huésped de interés se utilicen para la metagenómica funcional.

En resumen, nuestro trabajo proporciona una visión más profunda de las fuerzas que dan forma al resistoma móvil. El trabajo futuro debería expandir las bibliotecas metagenómicas involucradas para clasificar la movilidad y la compatibilidad funcional de los ARG detectados de una manera más completa y probar en una gama más amplia de aislamientos clínicos.

Esta investigación cumple con todas las normas éticas pertinentes aprobadas por la Junta de Revisión de Investigaciones Humanas del Centro Clínico Albert Szent-Györgyi de la Universidad de Szeged y la Autoridad Nacional de Biodiversidad (NBA) de la India. Se obtuvo permiso para la recolección de muestras fecales de la Junta de Revisión de Investigación Humana del Centro Clínico Albert Szent-Györgyi, Universidad de Szeged (registrado bajo 72/2019-SZTE). Los participantes voluntarios fueron seleccionados sobre la base de criterios estrictos de que (1) no tomaron ningún antibiótico durante al menos un año antes de la donación de la muestra y (2) gozan de buena salud. Estos requisitos son estándar en el campo y aseguran una comparación sin sesgos de los resistomas antibióticos en el microbioma intestinal humano sano. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes. La recolección de muestras de sedimentos de ríos y suelos de los alrededores de la ciudad de Hyderabad y Lucknow fue aprobada por la Autoridad Nacional de Biodiversidad (NBA), India (número de solicitud: NBA/Tech Appl/9/1822/17/18-19/3535). No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de muestra, pero nuestros tamaños de muestra son similares a los informados en publicaciones anteriores18,51,52. Las muestras no se asignaron a los grupos experimentales. Las muestras para cada experimento individual fueron manejadas por una persona a cargo. La recopilación y el análisis de datos no se realizaron a ciegas de las condiciones de los experimentos. No se excluyeron datos del análisis. A menos que se indique lo contrario, cuando usamos un kit, seguimos las instrucciones del fabricante.

Se creó un plásmido personalizado a partir del vector de expresión pZE21 (Tabla complementaria 11) para compatibilidad con la transducción T7 y las canalizaciones de secuenciación. Específicamente, el origen de replicación se cambió de ColE1 a p15A y se introdujo la señal de empaquetamiento del bacteriófago T7 (las enzimas y los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla complementaria 11). Posteriormente, el vector pZE21_p15A se amplificó mediante PCR utilizando una mezcla de cebadores que contenían códigos de barras aleatorios de 10 nt de largo (Tabla complementaria 11), seguido de digestión y autoligado.

Para la biblioteca de microbiomas intestinales, recolectamos muestras fecales de 10 individuos sanos no emparentados sin antecedentes de haber tomado antibióticos en el año anterior a la donación de muestras. Para el microbioma del suelo antropogénico, se recolectaron muestras de áreas industriales altamente contaminadas con antibióticos en la India53. El ADN metagenómico de las muestras intestinales y de suelo se extrajo con el kit DNeasy PowerSoil (Qiagen, 47016). El ADN genómico de aislados bacterianos clínicos (Tabla complementaria 1) se aisló utilizando el kit de ADN genómico bacteriano Sigma GenElute (Sigma, NA2110-1KT).

De cada muestra, se digirieron 40 µg de ADN extraído con enzima MluCI (NEB, R0538L) (10 min, 37 °C), seguido de inactivación (20 min, 85 °C). Se varió la cantidad de la enzima MluCI para obtener ADN en el rango de tamaño objetivo de 1 a 5 kpb. El ADN se aisló con electroforesis en gel de campo pulsado (Sage Science, PB02901) con un cassette de gel de agarosa al 0,75 % y una definición de cassette marcador S1 de bajo voltaje de 1–6 kpb. Los fragmentos de ADN metagenómico se ligaron en el plásmido pZE21_p15A en el sitio EcoRI usando una proporción de masa de inserto:vector de 3:1. La mezcla de ligación pura se sometió a electroporación en 40 µl de células E. coli MegaX (Invitrogen, C640003) o E. coli 10G ELITE (Lucigen, 60080-2). Después de una hora de incubación a 37 °C, los transformantes se sembraron en placas de agar Luria Bertani (LB) con 50 µg ml-1 de kanamicina en diluciones de 101X, 102X y 103X para la determinación de unidades formadoras de colonias. El resto de las células recuperadas se cultivaron durante la noche en placas de agar LB suplementadas con kanamicina. Al día siguiente, se aislaron los plásmidos. La distribución del tamaño del inserto se estimó mediante la amplificación por PCR de regiones de plásmidos relevantes de 10 a 20 clones seleccionados al azar. Se determinó que el tamaño de inserción promedio era de 2 a 3 kbp.

La preparación de bacteriófagos híbridos transductores se adaptó de la ref. 21. En resumen, las células de E. coli BW25113 que contenían plásmidos que codifican la cola de fago (Tabla complementaria 11) se cultivaron hasta una densidad óptica (DO) de 600 nm ~ 0,7 (250 rpm a 37 °C), luego se colocaron en hielo durante 15 min. A continuación, los cultivos se centrifugaron (2200 × g, 4 °C, 10 min), se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en la misma cantidad de medio (LB o Terrific Broth (TB)). Posteriormente, se utilizaron bacteriófagos T7 que carecen de regiones codificantes de fibra T7 (T7∆(gp11-12-17)) para infectar células con una multiplicidad de infección (MOI) 2–3. Después de 2 h de incubación (100 rpm, 37 °C), las células se trataron con cloroformo al 2 % y se agitaron. A continuación, la mezcla se centrifugó con los mismos parámetros que antes. Finalmente, se recogió el sobrenadante que contenía partículas de fago.

Las eficiencias de transducción se midieron como se describió previamente21. En resumen, las células bacterianas diana se cultivaron hasta una DO600 ~0,5 (250 rpm a 37 °C), seguido de una incubación de 15 minutos en hielo, durante la cual se prepararon diluciones de las partículas de fago transductor con pasos de dilución de diez veces. Luego, se mezclaron 50 µl de células diana con 50 µl de partículas de fago de cada dilución. Las placas se incubaron a 37 °C a 180 rpm durante 1 h. Luego, las muestras se colocaron en placas de agar provistas de antibióticos. Las unidades formadoras de transductor por ml (tfu ml-1) se calcularon sobre la base de los recuentos de colonias.

La cepa E. coli K12 BW25113 que contiene plásmidos que codifican la cola del fago se sometió a electroporación con 30 ng de cada biblioteca de plásmidos en cinco paralelos para lograr números de colonias adecuados, luego se colocaron en placas de agar LB que contenían antibióticos y se cultivaron durante la noche. Después del crecimiento, las células se almacenaron en glicerol al 20 % a -80 °C. A continuación, las células congeladas que contenían la biblioteca se cultivaron en 40 ml de LB suplementado con kanamicina 50 y estreptomicina 100 mediante agitación a 230 rpm a 37 °C hasta una DO600 de 0,7. Las células se enfriaron en hielo, se centrifugaron a 2000 × g (4 °C, 10 min) y se resuspendieron en medio LB. Luego, se usó el bacteriófago T7∆(gp11-12-17) para infectar células en MOI 2–3. Después de 2 h de incubación (100 rpm a 37 °C), las células se trataron con cloroformo al 2 % y se agitaron. A continuación, la mezcla se centrifugó y se recogió el sobrenadante.

Los cultivos durante la noche de las cepas bacterianas correspondientes se diluyeron a OD600 0,1 en 50 ml de medio LB para crecer a 230 rpm a 37 °C hasta OD600 0,5. A continuación, añadimos 20 ml de biblioteca que contenía partículas transductoras a las células, seguido de una hora de incubación con los mismos parámetros. A continuación, las células se centrifugaron a 2200 × g durante 10 min a 4 °C, se resuspendieron en 1–5 ml de medio LB, se sembraron en LB + kanamicina 50 y se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, las células se recolectaron y almacenaron con glicerol a -80 °C. De cada biblioteca, se electroporaron 50 ng en E. coli K12 BW25113 en cinco paralelos. Las células se recuperaron en medio SOC durante una hora a 37 °C y se sembraron en placas LB + kanamicina50 y se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, las células se recolectaron y almacenaron en glicerol al 20 % a -80 °C.

Para ubicar los HRDR de los genes de la fibra de la cola, utilizamos la alineación de secuencias por pares, donde los HRDR recientemente identificados de gp17 del colifago29 T3 se alinearon con las secuencias de la fibra de la cola del fago T7 gp17 de Escherichia, el fago ΦSG-JL2 gp17 de Salmonella y el fago Vi06 gp43 de Salmonella. . Los sitios determinados y las regiones proximales luego se sometieron a mutagénesis dirigida por DIvERGE22, una técnica basada en la incorporación dirigida de carga mutacional portadora de oligos 90-mer. En resumen, las células de E. coli BW25113 que llevan el plásmido que codifica la cola del fago que se va a mutar y el plásmido que media en la mutagénesis22 se cultivaron hasta ~OD600 0,3–0,4 en TB (250 rpm a 37 °C) con los antibióticos apropiados. A continuación, se añadió ácido m-toluico (concentración final 1 mM) para inducir la expresión génica y, después de una hora de incubación, las células se transfirieron a hielo durante 15 minutos. El cultivo celular se volvió electrocompetente mediante lavado y centrifugación repetidos (2200 × g, 4 ° C, 10 min, tres veces), luego se sometió a electroporación con oligos 2,5 µM (Tabla complementaria 11). Después de la recuperación en TB (250 rpm, 37 °C, una h), las células se transfirieron a 19 ml de TB provistos de los antibióticos apropiados y se dejaron crecer durante la noche. El ciclo de mutagénesis se repitió si se consideró necesario.

Para seleccionar mutantes de cola con capacidad de entrega mejorada, aplicamos un protocolo de optimización de transducción. En resumen, elegimos tres cepas bacterianas patógenas (Enterobacter cloacae ATCC 23355, Shigella sonnei HNCMB 25021 y E. coli NCTC 13351) en función de la infectividad inicial del bacteriófago T7 débil. Estas células bacterianas diana se cultivaron a ~OD600 0,5 (250 rpm a 37 °C) en LB, las células se colocaron en hielo durante 15 min, se mezclaron con 2 ml de partículas de fago en una proporción de volumen de 1:1 y se incubaron a 37 ° C y 100 rpm durante una h. A continuación, la mezcla se sembró en placas y se colocó a 37 °C para que creciera durante la noche. Se llevó a cabo el mismo protocolo con partículas portadoras de cola de fago de tipo salvaje no mutagenizadas. Las colonias se agruparon al día siguiente y el ADN del plásmido se aisló usando el kit de minipreparación de plásmido GeneJET (Thermo Fisher), luego se purificó más usando DNA Clean y Concentrator-5 (Zymo Research kit, D4004). De los plásmidos, se electroporaron 100 ng en células de E. coli BW25113. Después de la recuperación, se suministraron a las células los antibióticos apropiados, se extendieron sobre placas de agar después de una hora de incubación y se dejaron crecer durante la noche. Al día siguiente, las células se agruparon en 4 ml de LB, 250 µl se transfirieron a 40 ml de TB suministrados con los antibióticos apropiados y se cultivaron hasta ~OD600 0,7 (250 rpm a 37 °C). Después del crecimiento, las células se colocaron en hielo durante 15 min, se centrifugaron (2200 × g, 4 °C, 10 min) y se resuspendieron. A continuación, los cultivos celulares se infectaron con bacteriófagos T7∆(gp11-12-17). Después de dos horas (100 rpm a 37 °C), las células se trataron con cloroformo al 2 % y se agitaron. Después de la centrifugación a los parámetros anteriores, se recogieron los fagos presentes en el sobrenadante. La transducción de la cepa bacteriana investigada se repitió hasta que fue observable la saturación en el número de células transducidas (~ dos o tres rondas). Finalmente, se secuenciaron plásmidos de colonias individuales para revelar mutaciones en la cola.

Se infectaron células de E. coli que contenían plásmidos MGP4240 o MGP4240_gp17V544G y pZE21_p15A con el fago T7Δ(gp11-12-17) para empaquetar el plásmido pZE21_p15A. Las partículas de fago resultantes se usaron para generar lisados ​​de fago en E. coli BW25113 y S. sonnei HNCMB 25021 que albergaban MGP4240 o MGP4240_gp17V544G. La presencia de los plásmidos que codifican la cola del fago en las células diana era necesaria para que la contaminación por fagos replicativos formara placas. Para los ensayos de placas, se prepararon 4 ml de top agar y se complementaron con 100 µg ml−1 de estreptomicina (Sigma, S6501-25G) y 400 µl de los cultivos de toda la noche. Finalmente, de cada stock de fago, se dejaron caer 10 µl sobre el agar superior en diluciones de 1 a 1010 veces.

Para la entrega de la biblioteca metagenómica funcional, la mutación identificada en la variante de la cola del fago T7 gp17V544G se introdujo en el plásmido MGP424021 mediante el uso de la amplificación del plásmido completo con cebadores que portaban la mutación correspondiente, seguida de un tratamiento con DpnI (Thermo Fisher, ER1701) para eliminar la plantilla metilada original. ADN plasmídico y posterior electroforesis en gel, extracción en gel y autoligado. A continuación, los plásmidos se sometieron a electroporación en células de E. coli BW25113. Los transformantes que portaban las construcciones deseadas se identificaron mediante PCR y se validaron mediante secuenciación.

Las selecciones funcionales para la resistencia se realizaron en placas de agar Mueller Hinton Broth (Sigma, 90922) que contenían un gradiente de concentración de un antibiótico dado (adaptado de la referencia 54). Los antibióticos se adquirieron de Sigma o MedChem Express. El número de células en placas cubría al menos 10 veces el tamaño de la biblioteca metagenómica correspondiente. Las placas se incubaron a 37 °C durante 24 h. Para cada selección funcional, se preparó una placa de control con el mismo número de células que contenían el plásmido vacío (es decir, el plásmido sin fragmento de ADN clonado en el sitio de clonación múltiple) que mostraba la zona inhibitoria del compuesto antimicrobiano para las células sin fragmento de ADN clonado. cualquier plásmido de resistencia. Los clones resistentes de las bibliotecas se aislaron lavando juntas las colonias esporádicas de la región de la placa (distal a la zona de inhibición y con mayor concentración de antibiótico), definida por inspección visual en comparación con la zona de inhibición de la placa de control. La mitad del cultivo suspendido en LB se utilizó para el aislamiento del plásmido (GeneJET plasmid miniprep kit; Thermo Fisher, PLN70-1KT), y el resto se congeló con glicerol y se almacenó a -80 °C.

Los plásmidos que confieren resistencia obtenidos se secuenciaron con una tubería de secuenciación híbrida (datos extendidos, Fig. 5) basada en la ref. 34. La secuenciación de lectura larga identifica los fragmentos de ADN metagenómico (insertos) y los dos códigos de barras aleatorios de 10 nt de longitud preclonados aguas arriba y abajo (etiqueta ascendente y descendente, respectivamente) de cada fragmento de ADN metagenómico. Las alícuotas de las preparaciones de ADN de plásmido obtenidas de cada pantalla se agruparon en una proporción equimolar. La contaminación del ADN genómico se eliminó de la mezcla mediante digestión doble con exonucleasa lambda y exonucleasa I. La muestra resultante se limpió (DNA Clean and Concentrator-5, Zymo Research kit) y se cuantificó. A continuación, la mezcla de plásmidos se linealizó mediante la adición de 5 U de endonucleasa de restricción SrfI (NEB, R0629S) por cada 1 µg de ADN de plásmido (una hora a 37 °C, seguida de inactivación a 65 °C durante 20 minutos), y el ADN se cuantificado con el kit de ensayo de amplio rango Qubit dsDNA (Thermo Fisher, Q33266) antes de aplicarlo a la secuenciación de lectura larga Oxford Nanopore. Se aplicó una secuenciación profunda de lectura corta multiplexada en paralelo en cada preparación de ADN de plásmido metagenómico funcional (agrupación anterior) para asociar cóntigos de nanoporos con muestras de cribado (Datos ampliados, Fig. 5). Con este fin, amplificamos los códigos de barras de etiqueta hacia arriba y hacia abajo en las preparaciones de plásmidos de cada experimento de selección por separado, utilizando pares de cebadores directos e inversos específicos de Illumina. Cada par de cebadores contenía secuencias adaptadoras P5 y P7, respectivamente, y códigos de barras de 8 nt de largo para sitios de multiplexación y hibridación de plásmidos (Tabla complementaria 11). Realizamos la PCR con ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (Thermo Fisher, F530S) con la siguiente mezcla de reacción: 15 ng de ADN plásmido molde, 4 µl de tampón GC 5x, 0,2 µl de ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion, 0,6 µl de DMSO (dimetil sulfóxido), dNTP 0,2 mM, cebadores directo e inverso 0,5–0,5 µM y agua en un volumen final de 20 µl. Se utilizaron las siguientes condiciones del termociclador: 95 °C por cinco min, 30 ciclos de 95 °C por 30 s + 59 °C por 30 s + 72 °C por 5 s, 72 °C por siete min. Después de medir la concentración de cada reacción de PCR, mezclamos las muestras en una proporción de masa de 1:1. A continuación, aislamos la mezcla de fragmentos de 137 pb de longitud del gel de agarosa al 0,75 %.

Las bibliotecas se prepararon utilizando un kit de secuenciación de ligación (Oxford Nanopore Technologies, SQK-LSK109) con 1 µg de ADN plasmídico. Se preparó el extremo del ADN con NEBNext FFPE Repair (M6630S) y el kit Ultra II End Prep (E7546S), se purificó con Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63882) y luego se ligó el adaptador con NEBNext Quick T4 DNA ligase (E6056S). Finalmente, la biblioteca adaptada se purificó con Agencourt AMPure, se cuantificó con Qubit 3.0, se mezcló con el tampón de ejecución ONT y las perlas de carga, se cebó con la celda de flujo FLO-MIN106 9.4.1 SpotON conectada a un dispositivo MinION y se ejecutó durante 72 h. Se utilizó el algoritmo Guppy (v8.25) con ajustes de configuración de alta precisión para la llamada base. Las lecturas sin procesar se filtraron en función del valor de calidad (QC ≥ 7) y la longitud (4000–8000 pb) utilizando NanoFilt v2.7.155. Las lecturas se asignaron a la secuencia de referencia con minimap2 (v2.17)56; Los archivos SAM se convirtieron en BAM ordenados; se extrajeron las secuencias de inserción y se identificaron y agregaron códigos de barras a los nombres de lectura/inserción aplicando el subcomando 57 de samtools tview (1.11-9-ga53817f); los archivos FASTQ individuales se crearon utilizando SEQTK (v0.13.2)58; las secuencias consenso se generaron usando SPOA (v4.0.2)59 con los siguientes parámetros: -l 0 -r 0 -g -2. Finalmente, las inserciones de consenso sin procesar se pulieron utilizando el conjunto relevante de secuencias de inserción de minimap2 y racon (v1.4.19)56 para crear las inserciones de consenso finales con una cobertura de al menos 100x. Las longitudes y diversidades de los fragmentos de ADN metagenómico entregados se determinaron mediante secuenciación profunda de lectura larga justo después de la electroporación en E. coli BW25113 y la transducción en Salmonella enterica subsp. enterica serovariedad Typhimurium str. LT2, K. pneumoniae NCTC 9131 y S. sonnei HNCMB 25021. Los índices de diversidad alfa de Shannon (H) se calcularon sobre la base de la frecuencia de cada uno de los contigs de todos los huéspedes utilizando el paquete R vegano (2.5-7)60.

Las bibliotecas de secuenciación agrupadas se desnaturalizaron con NaOH 0,1 M, se diluyeron a 12 pM con tampón de hibridación HT1 (Illumina) y se mezclaron con una biblioteca de control de secuenciación PhiX Control v3 (Illumina) al 40 %. Los grupos de secuenciación desnaturalizados se cargaron en el kit de reactivos MiSeq V2-300 (Illumina) y se generaron lecturas de secuencia de 2 × 70 pb con un instrumento Illumina MiSeq con cebadores de secuenciación personalizados de lectura 1, lectura 2 e índice 1 añadidos en las posiciones de cartucho adecuadas (12, 14 y 13, respectivamente) a una concentración final de 0,5 µM.

Los conjuntos de plásmidos resistentes recogidos de la selección metagenómica se mezclaron y retransformaron o reelectroporaron en los cuatro huéspedes. Los experimentos de selección se realizaron en placas de agar en gradiente como se describió anteriormente (ver 'Selección funcional de resistencia a antibióticos' más arriba). Se recogieron colonias resistentes y, después de la preparación del plásmido, se secuenciaron los códigos de barras de los plásmidos mediante secuenciación Illumina (métodos complementarios). Para calcular las superposiciones entre conjuntos ARG funcionales entre especies, primero estimamos la precisión de la pantalla comparando los resultados con los de las mediciones MIC de los 13 fragmentos de ADN seleccionados que confieren resistencia. Sobre la base de estas comparaciones, estimamos las tasas de verdaderos positivos, falsos positivos, verdaderos negativos y falsos negativos de la pantalla. A continuación, calculamos un índice de Jaccard ajustado para cada par de especies, que tiene en cuenta la precisión de la pantalla de la siguiente manera. Para cada especie, reemplazamos el vector original de presencia/ausencia de instancias de resistencia detectada con un nuevo vector donde los valores originales de presencia (ausencia) se mantuvieron aleatoriamente con una probabilidad igual al valor predictivo positivo (negativo) (es decir, la proporción de verdaderos positivos entre todos los casos positivos y la proporción de verdaderos negativos entre todos los casos negativos). El procedimiento se repitió 50.000 veces y se calcularon las medianas y los intervalos de confianza del 95% de los índices de Jaccard entre pares de especies.

Medimos cómo los fragmentos de ADN que proporcionan resistencia a los antibióticos de E. coli influyen en la susceptibilidad de Shigella sonnei HNCMB 25021, K. pneumoniae NCTC 9131 y Salmonella enterica subsp. enterica serovariedad Typhimurium str. LT2. Para este propósito, usamos un conjunto representativo de 13 plásmidos que se aislaron en nuestras pantallas de selección de antibióticos. Para cada cepa, los niveles de resistencia proporcionados (es decir, la MIC) se midieron con un método estándar de microdilución de 12 pasos en placas de 96 pocillos, y el cambio de MIC se determinó comparándolos con la MIC del vector vacío correspondiente que albergaba controlar las cepas. Las CIM se determinaron sobre la base del crecimiento celular (OD600) después de 24 h de incubación (37 °C, 180 rpm).

Cada secuencia de inserción de consenso de la secuenciación de nanoporos se asoció con muestras de detección (huésped, resistoma, antibiótico) mediante la combinación de los conjuntos de datos de Nanopore e Illumina a través de códigos de barras únicos de etiqueta ascendente y descendente con un script R personalizado. Para identificar los ARG en los cóntigos metagenómicos, se utilizaron dos enfoques paralelos: (1) Predicción del marco de lectura abierto (ORF) con pródigo 61, seguido de anotación con búsqueda BLASTP en las bases de datos CARD35 y ResFinder36, con cobertura >50 pb a valor e < 10-5 y (2) búsqueda BLASTX con los mismos parámetros pero sin predicción de ORF para disminuir el riesgo de ORF truncados debido a errores de secuenciación por cambio de marco. Para eliminar los datos de secuenciación de baja fidelidad del conjunto de datos, se filtraron los fragmentos de ADN metagenómico respaldados por <10 secuencias de inserción de consenso en el conjunto de datos de nanoporos y <9 lecturas en el conjunto de datos de código de barras uptag y downtag de Illumina.

Si un fragmento de ADN metagenómico contenía más de un ARG predicho, se filtraron los ARG que se sabe que actúan en una clase de antibiótico (según las bases de datos de referencia CARD y ResFinder) que no sea el que usamos en el experimento de selección. Las secuencias ARG que tenían al menos un 95 % de identidad y cobertura en el nivel de secuencia de ADN se colapsaron en grupos ARG37. Cada grupo estuvo representado por el golpe más cercano a los ARG conocidos en las bases de datos Card35 y ResFinder36 (Tabla complementaria 6). Los organismos donantes a partir de los cuales se originaron las secuencias de contig de ADN ensambladas se identificaron mediante una búsqueda de similitud de secuencia de nucleótidos utilizando los contigs de ADN como consulta en la base de datos de procariotas de referencia NCBI (RefProk, descargada el 21 de marzo de 2021) con un valor e de umbral de 10-10. La jerarquía taxonómica (reino, phylum, clase, orden, familia, género, especie) se adquirió utilizando el paquete taxonomizr en R (v0.8.0).

Para crear el catálogo de genes móvil (es decir, una base de datos de secuencias de ADN recientemente transferidas entre especies bacterianas40), descargamos 1377 genomas de diversas especies bacterianas relacionadas con humanos de la base de datos Integrated Microbial Genomes and Microbiomes como se hizo anteriormente40 y 1417 genomas de Gram- Patógenos ESKAPE negativos de la base de datos NCBI RefSeq (Tabla complementaria 8). Usando NCBI blastn 2.10.1+62, buscamos las secuencias de nucleótidos compartidas entre genomas pertenecientes a diferentes especies. Los parámetros para filtrar los resultados de blast de NCBI blastn 2.10.1+ fueron los siguientes: porcentaje mínimo de identidad, 99%; longitud mínima de alineación, 500; longitud máxima de alineación, 20.000. Los golpes de explosión se agruparon por cd-hit-est 4.8.163,64, con un umbral de identidad de secuencia del 99%. Predijimos los ORF en los impactos de explosión con pródigo v2.6.361, manteniendo solo aquellos de más de 500 nt. Luego, para generar el catálogo de genes móviles, los comparamos con las bases de datos combinadas CARD 3.1.035 y ResFinder (d48a0fe)36 usando diamond v2.0.4.14265. Finalmente, las secuencias de plásmidos naturales se identificaron mediante la descarga de 27 939 secuencias de plásmidos completas de la base de datos PLSDB (v2020-11-19)41. Luego, las secuencias representativas de los 114 grupos ARG aislados se buscaron con BLASTN tanto en el catálogo de genes móviles como en secuencias de plásmidos naturales, con un umbral de identidad y cobertura del 90 %. Los ARG que estaban presentes en el catálogo de genes móviles y/o en las secuencias de plásmidos naturales se consideraron móviles.

El análisis estadístico se realizó utilizando R (v4.1.1). Se utilizó la prueba t paramétrica de dos muestras para evaluar las diferencias entre las medias de los grupos de muestras. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para determinar asociaciones significativas entre dos variables. El índice de diversidad alfa de Shannon se utilizó para caracterizar la diversidad de contigs de ADN en las bibliotecas utilizando el paquete vegano (v2.5–7) en R66. Se asumió que la distribución de datos era normal, pero esto no se probó formalmente.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las lecturas de Illumina y los contigs de Nanopore para este estudio se han depositado en el Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) en EMBL-EBI con el número de acceso PRJEB54063 (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB54063). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Los scripts y otros archivos necesarios para reproducir el análisis están disponibles en https://github.com/stitam/Apjok-et-al-DEEPMINE-NatMicrobiol.

Tringe, SG & Rubin, EM Metagenómica: secuenciación de ADN de muestras ambientales. Nat. Rev. Genet. 6, 805–814 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Coughlan, LM, Cotter, PD, Hill, C. & Alvarez-Ordóñez, A. Aplicaciones biotecnológicas de la metagenómica funcional en las industrias alimentaria y farmacéutica. Frente. Microbiol. 6, 672 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Daniel, R. La metagenómica del suelo. Nat. Rev. Microbiol. 3, 470–478 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lorenz, P. & Eck, J. Metagenómica y aplicaciones industriales. Nat Rev Microbiol 3, 510–516 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Colin, P.-Y. et al. Descubrimiento de rendimiento ultraalto de enzimas promiscuas mediante metagenómica funcional de picogotas. Nat. común 6, 10008 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Crofts, TS, Gasparrini, AJ & Dantas, G. Enfoques de próxima generación para comprender y combatir el resistoma antibiótico. Nat. Rev. Microbiol. 15, 422–434 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Forsberg, KJ et al. Descubrimiento guiado por metagenómica funcional de potentes inhibidores de cas9 en el microbioma humano. eLife 8, e46540 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

van der Helm, E., Genee, HJ & Sommer, MOA La interfaz en evolución entre la biología sintética y la metagenómica funcional. Nat. química Biol. 14, 752–759 (2018).

Artículo PubMed Google Académico

Boolchandani, M., Patel, S. & Dantas, G. Metagenómica funcional para estudiar la resistencia a los antibióticos. En Sass, P. (ed) Antibióticos. Methods in molecular biology, vol 1520, 307-329 (Humana Press, Nueva York, 2017).

dos Santos, DFK, Istvan, P., Quirino, BF & Kruger, RH La metagenómica funcional como herramienta para la identificación de nuevos genes de resistencia a antibióticos en entornos naturales. Microbio. Ecol. 73, 479–491 (2017).

Artículo PubMed Google Académico

Lam, KN, Martens, EC y Charles, TC Desarrollo de un sistema Bacteroides para la detección de ADN basada en funciones del microbioma intestinal humano. mSystems 3, e00195-17 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Taupp, M., Mewis, K. & Hallam, SJ El arte y el diseño de pantallas metagenómicas funcionales. actual Opinión Biotecnología. 22, 465–472 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ngara, TR & Zhang, H. Avances recientes en la detección metagenómica basada en funciones. genoma Proteoma. Bioinformar. 16, 405–415 (2018).

Artículo Google Académico

Uchiyama, T. & Miyazaki, K. Metagenómica funcional para el descubrimiento de enzimas: desafíos para la detección eficiente. Curr Opin Biotechnol 20, 616–622 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lammens, EM, Nikel, PI & Lavigne, R. Exploración del potencial de biología sintética de los bacteriófagos para la ingeniería de bacterias no modelo. Nat Comun. 11, 5294 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sommer, MOA, Church, GM y Dantas, G. El microbioma humano alberga una reserva diversa de genes de resistencia a los antibióticos. Virulencia 1, 299–303 (2010).

Artículo PubMed Google Académico

Pehrsson, CE y col. Microbiomas y resistomas interconectados en hábitats humanos de bajos ingresos. Naturaleza 533, 212–216 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sommer, MOA, Dantas, G. & Church, GM Caracterización funcional del reservorio de resistencia a antibióticos en la microflora humana. Ciencia 325, 1128–1131 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Apjok, G. et al. Conservación evolutiva limitada de los efectos fenotípicos de las mutaciones de resistencia a los antibióticos. mol. Biol. Evol. 36, 1601-1611 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Porse, A., Schou, TS, Munck, C., Ellabaan, MMH y Sommer, MOA Los mecanismos bioquímicos determinan la compatibilidad funcional de los genes heterólogos. Nat Comun. 9, 522 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Yosef, I., Goren, MG, Globus, R., Molshanski-Mor, S. y Qimron, U. Ampliación de la gama de huéspedes de partículas de bacteriófagos para la transducción de ADN. mol. Celda 66, 721–728.e3 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Nyerges, Á. et al. La evolución dirigida de múltiples loci genómicos permite predecir la resistencia a los antibióticos. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 115, E5726–E5735 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wright, GD Resistomas antibióticos ambientales y clínicos, lo mismo solo que diferente. actual Opinión Microbiol. 51, 57–63 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bengtsson-Palme, J., Boulund, F., Fick, J., Kristiansson, E. y Joakim Larsson, DG La metagenómica de la escopeta revela una amplia gama de genes de resistencia a los antibióticos y elementos móviles en un lago contaminado de la India. Frente. Microbiol. 5, 648 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Lübbert, C. et al. La contaminación ambiental con agentes antimicrobianos de las industrias de fabricación de medicamentos a granel en Hyderabad, sur de la India, está asociada con la diseminación de patógenos productores de betalactamasas y carbapenemasas de espectro extendido. Infección 45, 479–491 (2017).

Artículo PubMed Google Académico

Bakermans, C., Sloup, RE, Zarka, DG, Tiedje, JM y Thomashow, MF Desarrollo y uso de un sistema genético para identificar los genes necesarios para el crecimiento eficiente a baja temperatura de Psychrobacter arcticus 273-4. Extremófilos 13, 21–30 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tridgett, M., Ababi, M., Osgerby, A., Garcia, RR & Jaramillo, A. Ingeniería de bacterias para producir partículas puras similares a fagos para la administración de genes. Sintetizador ACS. Biol. 10, 107–114 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Huss, P., Meger, A., Leander, M., Nishikawa, K. y Raman, S. Mapeo del paisaje funcional del dominio de unión al receptor del bacteriófago t7 mediante exploración mutacional profunda. eLife 10, e63775 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yehl, K. et al. Modificación de la gama de huéspedes del fago y supresión de la resistencia bacteriana a través de la mutagénesis de la fibra de la cola del fago. Celda 179, 459–469.e9 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Holtzman, T., Globus, R., Molshanski-Mor, S., Ben-Shem, A., Yosef, I. y Qimron, U. Un sistema de evolución continua para contraer la gama de huéspedes del bacteriófago T7. Sci Rep. 10, 307 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qimron, U., Marintcheva, B., Tabor, S. & Richardson, CC Genomewide Screens para genes de Escherichia coli que afectan el crecimiento del bacteriófago T7. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 103, 19039–19044 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lupia, T., Pallotto, C., Corcione, S., Boglione, L. & De Rosa, FG Perspectiva de ceftobiprole: indicaciones actuales y potenciales futuras. Antibióticos 10, 170 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sou, T. et al. Desarrollo de fármacos basado en modelos para antimicrobianos: modelado PK y PK/PD traslacional para predecir una dosis humana eficaz de apramicina. clin. Farmacol. El r. 109, 1063–1073 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mutalik, VK et al. Secuenciación de la biblioteca de expresión de escopeta con código de barras doble para la caracterización de alto rendimiento de rasgos funcionales en bacterias. Nat. común 10, 308 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Alcock, BP et al. CARD 2020: vigilancia del resistoma antibiótico con la base de datos integral de resistencia a los antibióticos. Ácidos Nucleicos Res. 48, D517–D525 (2020).

CAS PubMed Google Académico

Zankari, E. et al. Identificación de genes adquiridos de resistencia antimicrobiana. J. Antimicrobiano. Quimioterapia. 67, 2640–2644 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ellabaan, MMH, Munck, C., Porse, A., Imamovic, L. & Sommer, MOA Pronóstico de la diseminación de genes de resistencia a antibióticos a través de genomas bacterianos. Nat Comun. 12, 2435 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, AN et al. Un marco basado en ómicas para evaluar el riesgo para la salud de los genes de resistencia a los antimicrobianos. Nat Comun. 12, 4765 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, Y. et al. La red de transferencia de resistoma móvil bacteriano que conecta los microbiomas animal y humano. aplicación Reinar. Microbiol. 82, 6672–6681 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Smillie, CS et al. La ecología impulsa una red global de intercambio de genes que conecta el microbioma humano. Naturaleza 480, 241–244 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Galata, V., Fehlmann, T., Backes, C. & Keller, A. PLSDB: un recurso de plásmidos bacterianos completos. Ácidos Nucleicos Res. 47, D195–D202 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cillóniz, C., Dominedò, C., Garcia-Vidal, C. & Torres, A. Ceftobiprole para el tratamiento de la neumonía. Rev. Esp. Quimioter 32, 17–23 (2019).

PubMed PubMed Central Google Académico

Torres, A., Liapikou, A. & Cilloniz, C. Ceftobiprole para el tratamiento de la neumonía: una perspectiva europea. Drogas Des. desarrollo Ther 9, 4565–72 (2015).

Artículo Google Académico

Queenan, AM, Shang, W., Kania, M., Page, MGP y Bush, K. Interacciones de ceftobiprol con β-lactamasas de las clases moleculares A a D. Antimicrob. Agentes Quimiotera. 51, 3089–3095 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Farrell, DJ, Flamm, RK, Sader, HS & Jones, RN Actividad de ceftobiprol contra más de 60 000 patógenos bacterianos clínicos aislados en Europa, Turquía e Israel entre 2005 y 2010. Antimicrob. Agentes Quimiotera. 58, 3882–3888 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Hao, M. et al. Resistencia a apramicina en cepas epidémicas de Klebsiella pneumoniae ST258 resistentes a carbapenémicos. J. Antimicrobiano. Quimioterapia. 76, 2017-2023 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tasse, L. et al. Metagenómica funcional para extraer enzimas catabólicas de fibra dietética del microbioma intestinal humano. Genoma Res. 20, 1605–1612 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kakirde, KS y col. Vector lanzadera Gram negativo BAC para la expresión heteróloga de bibliotecas metagenómicas. Gene 475, 57–62 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rousset, F. et al. El impacto de la diversidad genética en la esencialidad de los genes dentro de las especies de Escherichia coli. Nat. Microbiol. 6, 301–312 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

MacLean, RC & San Millan, A. La evolución de la resistencia a los antibióticos. Ciencia 365, 1082–1083 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Amos, GCA, Zhang, L., Hawkey, PM, Gaze, WH y Wellington, EM El análisis metagenómico funcional revela que los ríos son un reservorio de diversos genes de resistencia a los antibióticos. Veterinario. Microbiol. 171, 441–447 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cheng, G. et al. La detección funcional de los genes de resistencia a los antibióticos de la microbiota intestinal humana revela una nueva fusión de genes. FEMS Microbiol. Letón. 336, 11–16 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fick, J. et al. Contaminación de aguas superficiales, subterráneas y potables de la producción farmacéutica. Reinar. Toxicol. química 28, 2522–2527 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Soper, WT Placa de gradiente modificada para uso en la técnica de placa de virus. aplicación Microbiol. https://doi.org/10.1128/am.14.3.470-471.1966 (1966).

De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, DT, Cruts, M. y Van Broeckhoven, C. NanoPack: visualización y procesamiento de datos de secuenciación de lectura larga. Bioinformática 34, 2666–2669 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Li, H. Minimap2: alineación por parejas para secuencias de nucleótidos. Bioinformática 34, 3094–3100 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, H. et al. El formato de mapa/alineación de secuencias y SAMtools. Bioinformática 25, 2078–2079 (2009).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Li, H. Seqtk: una herramienta rápida y liviana para procesar secuencias FASTA o FASTQ. github. https://github.com/lh3/seqtk (2013).

Vaser, R., Sović, I., Nagarajan, N. & Šikić, M. Ensamblaje rápido y preciso del genoma de novo a partir de lecturas largas no corregidas. Genoma Res. 27, 737–746 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fisher, RA, Corbet, AS & Williams, CB La relación entre el número de especies y el número de individuos en una muestra aleatoria de una población animal. J. Anim. Ecol. 12, 42-58 (1943).

Hyatt, D. et al. Pródigo: reconocimiento de genes procarióticos e identificación del sitio de inicio de la traducción. BMC Bioinformática 11, 119 (2010).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ Herramienta básica de búsqueda de alineación local. J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S. & Li, W. CD-HIT: acelerado para agrupar los datos de secuenciación de próxima generación. Bioinformática 28, 3150–3152 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, W. & Godzik, A. Cd-hit: un programa rápido para agrupar y comparar grandes conjuntos de proteínas o secuencias de nucleótidos. Bioinformática 22, 1658–1659 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Buchfink, B., Xie, C. & Huson, DH Alineación de proteínas rápida y sensible usando DIAMOND. Nat. Métodos 12, 59–60 (2014).

Artículo PubMed Google Académico

Oksanen, J. et al. vegano: Paquete de Ecología Comunitaria. Paquete R versión 2.6-4 (2022).

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Agradecemos a D. Verma del Departamento de Microbiología y B. Bhimrao de la Universidad de Ambedkar, Lucknow, India, por su ayuda con la recolección de muestras de suelo y la aprobación de la NBA. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Laboratorio Nacional de Biotecnología NKFIH-871-3/2020 y 2022-2.1.1-NL-2022-00008 (BK y CP); el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención no. 739593 (BP y BK); el Consejo Europeo de Investigación H2020-ERC-2014-CoG 648364-Resistance Evolution (CP) y H2020-ERC-2019-PoC 862077–Aware (CP); Subvención de la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación FK-135245 (BK) y FK-124254 (OM); la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación y el Ministerio de Innovación y Tecnología bajo el Programa 'Frontline' KKP 129814 y 126506 (BP y CP); el Laboratorio Nacional de Seguridad en Salud RRF-2.3.1-21-2022-00006 (BP), GINOP-2.3.2–15–2016–00014 (EVOMER, CP y BP), GINOP-2.3.2–15–2016– 00020 (MolMedEx TUMORDNS, CP), GINOP-2.3.2-15-2016-00035 (NZ); una beca de investigación János Bolyai de la Academia de Ciencias de Hungría (BO/352/20 (BK), BO/00303/19/8 (OM)); Nuevo Programa Nacional de Excelencia del Ministerio de Capacidades Humanas (UNKP-20-5-SZTE-654 y UNKP-21-5-SZTE-579, BK); Nuevo Programa Nacional de Excelencia del Ministerio de Innovación y Tecnología financiado por el Fondo Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación (ÚNKP-20-3 -SZTE-452, GA); el Programa de Becas para Estudiantes de Doctorado del Programa de Doctorado Cooperativo del Ministerio de Innovación y Tecnología financiado por el Fondo Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación (KDP-17-4/PALY-2021, C992025, MS). RH, BG, PU y AG recibieron el apoyo de GINOP-2.3.4-15-2020-00010, GINOP-2.3.1-20-2020-00001, BECOMING-2019–1-HU01-KA203–061251, el Horizonte de la Unión Europea Programa de investigación e innovación 2020 bajo el acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie no. 754432 y el Ministerio de Ciencia y Educación Superior de Polonia, de los recursos financieros para la ciencia en 2018-2023. Este trabajo de investigación se realizó con el apoyo del Programa de Educación de la Academia Nacional de Científicos de la Fundación Biomédica Nacional bajo el patrocinio del Ministerio de Cultura e Innovación de Hungría (DK).

Pramod K. Jangir

Dirección actual: Departamento de Zoología, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Estos autores contribuyeron por igual: Gábor Apjok, Mónika Számel y Chryso Christodoulou.

Unidad de Biología Sintética y de Sistemas, Instituto de Bioquímica, Centro de Investigación Biológica, Laboratorio Nacional de Biotecnología, Red de Investigación Eötvös Loránd (ELKH), Szeged, Hungría

Gábor Apjok, Mónika Számel, Chryso Christodoulou, Viktória Seregi, Bálint Márk Vásárhelyi, Tamás Stirling, Bálint Eszenyi, Tóbiás Sári, Fanni Vidovics, Erika Nagrand, Dorina Kovács, Petra Szili, Ildikó Ilona Lantos, Orsolya Méhi, Pramod K. Jangir, Gábor Draskovits, Ákos Nyerges, Gergely Fekete, Balázs Papp, Pál Csaba y Bálint Kintses

Escuela de Doctorado en Biología, Universidad de Szeged, Szeged, Hungría

Gábor Apjok, Mónika Számel, Tamás Stirling, Tóbiás Sári & Pramod K. Jangir

HCEMM-BRC Grupo de Investigación en Microbiología Traslacional, Szeged, Hungría

Viktória Seregi & Bálint Kintses

Instituto de Bioquímica, Centro de Investigación Biológica, Laboratorio Nacional de Seguridad Sanitaria, Red de Investigación Eötvös Loránd (ELKH), Szeged, Hungría

Tamás Stirling & Balázs Papp

Escuela de Doctorado en Ciencias Médicas Multidisciplinarias, Universidad de Szeged, Szeged, Hungría

petra szili

Grupo de Investigación en Bioinformática, Instalación Central de Genómica y Bioinformática, Centro de Investigación Szentágothai, Universidad de Pécs, Pécs, Hungría

Róbert Herczeg, Bence Gálik, Péter Urbán y Attila Gyenesei

Departamento de Biología Molecular Clínica, Universidad Médica de Bialystok, Bialystok, Polonia

Bence Galik y Attila Gyenesei

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias e Informática, Universidad de Szeged, Szeged, Hungría

László Bodai y Bálint Kintses

Departamento de Genética, Facultad de Ciencias e Informática, Universidad de Szeged, Szeged, Hungría

Nora Zsindely

Dirección de Diagnóstico Veterinario, Oficina Nacional de Seguridad de la Cadena Alimentaria, Budapest, Hungría

Denes Bela

Departamento de Microbiología Clínica e Inmunología, Escuela de Medicina Sackler, Universidad de Tel Aviv, Tel Aviv, Israel

Ido Yosef y Udi Qimron

Laboratorio de Biología de Sistemas Metabólicos HCEMM-BRC, Szeged, Hungría

Balázs Papp

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GA y BK concibieron el proyecto. MS, GA, CC, BMV, T.Sári, EN, PKJ, AN, CP y BK planificaron los experimentos y análisis de datos. MS, GA, VS, DK, IIL, FV, BE, T.Sári, PS, EN, OM, GD, BD, realizaron los experimentos. LB, NZ realizaron la secuenciación Illumina, RH, BG, PU, ​​AG realizaron la secuenciación Nanopore. MS, GA, CC, BMV, T.Stirling, GF, RH, BP, CP y BK analizaron los datos experimentales y realizaron análisis bioinformáticos. BK, CP, CC, MS y GA escribieron el manuscrito con contribuciones de todos los autores.

Correspondencia a Pál Csaba o Bálint Kintses.

GA, MS, T.Sári, OM, UQ y BK son inventores en una solicitud de patente presentada por DEEPMINE (Oficina Europea de Patentes). El Biological Research Center Szeged posee una patente activa de DIVERGE (PCT/EP2017/082574, US 10,669,537 B2, European Patent No. 3526327), donde BK y CP son inventores. UQ es el director de tecnología de Trobix Innovation Ltd. y es inventor de una solicitud de patente pendiente sobre un método para generar variantes de bacteriófagos que tienen rangos de huéspedes ampliados (PCT/IL2017/050734). Todos los demás autores no tienen intereses en competencia.

Nature Microbiology agradece a Trevor Charles, Kevin Forsberg y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Comparación de las eficiencias de electroporación y transducción. La figura muestra que el número máximo de plásmidos entregados a los anfitriones es al menos dos órdenes de magnitud mayor por transducción que por electroporación en las 3 especies de anfitriones patogénicos (las barras de centro y error representan la media y el error estándar (n= 3 experimentos biológicamente independientes) ). Datos disponibles en la Tabla complementaria 2. b, insertos metagenómicos amplificados por PCR de células transducidas. Después de la transducción y la electroporación, los fragmentos de ADN metagenómico se amplificaron por PCR utilizando cebadores específicos de plásmidos en ambos lados del fragmento de ADN metagenómico y posteriormente se secuenciaron mediante secuenciación capilar. Este experimento diferencia células monoclonales (producto único de PCR y secuencia de ADN) de aquellas que fueron cotransducidas por dos o más plásmidos (doble banda en el gel y señal mixta en la secuencia capilar). La PCR se repitió en el caso de cada par host-biblioteca con resultados similares. c, Durante la generación de partículas de bacteriófagos transductores, una gran parte de los fagos sigue siendo replicativa y mata las células bacterianas utilizadas para la generación de fagos. Por lo tanto, con el aumento de la concentración de fagos, la eficacia de la transducción no crece como cabría esperar, sino que disminuye. La figura muestra la eficiencia de transducción de la partícula de fago de transducción T7 que alberga la cola de fago T7 (línea negra) en Shigella sonnei HNCMB 25021 a diferentes diluciones (ver Métodos). La línea discontinua roja muestra el aumento esperado en la eficiencia de transducción sin ningún efecto letal detectable de los fagos replicativos. Datos disponibles en la Tabla complementaria 2.

Datos fuente

a, Los mutantes T7 gp17 HRDR suelen tener combinaciones específicas de mutaciones, el 28 % de las cuales se han descrito anteriormente como mutaciones adaptativas. Mapa de calor que representa el número de casos en que se produce una mutación en los 50 HRDR de cola de fago T7 secuenciados. Las mutaciones adaptativas según (Huss et al.28) se indican con un punto rojo. La combinación frecuente de mutaciones adaptativas específicas indica el potencial de DIvERGE para encontrar mutaciones que alteran la especificidad del huésped con alta eficiencia. Datos disponibles en la Tabla complementaria 4. b, c, Distribución de mutaciones detectadas en los genes de fibra de cola de fago mutagenizados Escherichia fago T7 gp17 y Salmonella fago ΦSG-JL2 gp17. Los HRDR previstos se distinguen a través de regiones coloreadas como en (Yehl et al.29) con el bacteriófago T3. d, Eficiencias de transducción de las colas de fago mutante T7 (gris) y ΦSG-JL2 (amarillo) en comparación con sus contrapartes de tipo salvaje con la cepa deficiente en LPS E. coli K12 BW25113 ΔtrxAΔwaaR. El eje Y muestra el número de células transducidas en 1 ml. Las barras central y de error representan el error medio y estándar (n = 3 experimentos biológicamente independientes). Obsérvese que no observamos ningún fago Vi06 gp43 de Salmonella mutante enriquecido, lo que indica que la fibra de la cola del fago Vi06 de Salmonella se une a un receptor de la superficie celular distinto del LPS. Datos disponibles en la Tabla complementaria 4.

Datos fuente

a, Representación esquemática de la generación de partículas de fago transductor con T7 gp17WT. Durante el primer paso del proceso, el bacteriófago T7 que carece de los genes que codifican la fibra de la cola en su genoma, pero que muestra la fibra de la cola T7 de tipo salvaje, infecta la célula E. coli BW25113 que lleva el plásmido metagenómico y un plásmido que expresa la cola del fago. La infección da como resultado la producción de partículas de fago que llevan el plásmido metagenómico (partícula de fago transductor) o el genoma del fago (fago replicante) según Yosef et al. Si la cola del fago codificada por el plásmido que expresa la cola del fago (y, por lo tanto, se muestra en las partículas T7 generadas) puede infectar eficientemente a E. coli, el fago replicante se acumula continuamente durante el proceso, ya que el genoma del fago que contiene la partícula del fago puede iniciar una nueva reproducción. ciclo. b, El número de plásmidos metagenómicos que se administran en Shigella sonnei HNCMB 25021 por las partículas del fago T7 que albergan fibras de la cola gp17WT (azul) o gp17V544G (verde) (prueba t unilateral de dos muestras, P = 0,01944. Centro y error las barras representan la media y el error estándar, n = 3 experimentos biológicamente independientes). Los datos están disponibles en la Tabla complementaria 5. c, Contaminación de fagos replicativos medida por la formación de placas de las partículas de fagos transductores T7 que albergan las fibras de la cola gp17WT (azul) o gp17V544G (verde) (ver Métodos). El ensayo de placa se llevó a cabo tanto con E. coli BW25113 como con S. sonnei HNCMB 25021 (prueba t bilateral de dos muestras, P = 0,000168 y P = 0,013476 cuando se aplicó con E. coli y S. sonnei, respectivamente. Centro y las barras de error representan la media y el error estándar; n = 3 experimentos biológicamente independientes). Los datos están disponibles en la Tabla complementaria 5. d, Contaminación de fagos replicativos medida por los números de colonias de S. sonnei HNCMB 25021 transducidos con partículas de fagos T7 que albergan las fibras de la cola gp17WT (azul) o gp17V544G (verde). La menor cantidad de fago replicativo en la muestra de partículas transductoras T7 gp17V544G se indica mediante el aumento del número de colonias incluso a altas concentraciones de la partícula transductora. En particular, a diferencia de la Fig. 5c complementaria, la actividad replicativa del fago se detecta en la concentración más alta de la partícula transductora en este experimento. (n = 2 réplicas biológicas. Las barras central y de error representan la media y el error estándar). Datos disponibles en la Tabla complementaria 5. e, Eficiencias de transducción de las partículas del fago T7 que albergan fibras de la cola gp17WT (azul) o gp17V544G (verde) en E. coli BW25113 (prueba t bilateral de dos muestras, P = 0,00553, n = 3 experimentos biológicamente independientes. Las barras central y de error representan la media y el error estándar). Los datos están disponibles en la Tabla complementaria 5. f, Representación esquemática del esquema de generación de partículas de fago de transducción asumido con T7 gp17V544G. La eficiencia de transducción disminuida para E. coli BW25113 suprime la reproducción del fago replicativo después del primer ciclo de infección. Tenga en cuenta que el primer ciclo de infección lo lleva a cabo el T7 gp17WT. En resumen, la infección ineficaz de E. coli por la cola del fago mutante da como resultado una menor cantidad de fagos replicativos.

Datos fuente

a, la entrega de bibliotecas de plásmidos metagenómicos funcionales es tan eficiente con partículas de bacteriófago T7 gp17V544G en Shigella sonnei HNCMB 25021 como con electroporación en E. coli BW25113 (P = 0,19769, prueba t unilateral de dos muestras, n = 3 experimentos biológicamente independientes. Las barras central y de error representan la media y el error estándar.) Datos disponibles en la Tabla complementaria 2. b, c, Longitudes y diversidades de fragmentos de ADN metagenómico entregados, respectivamente, determinadas mediante el uso de secuenciación profunda de lectura larga justo después de la electroporación y la transducción (Métodos). Las líneas discontinuas representan el tamaño promedio de los fragmentos de ADN. Los índices de diversidad alfa de Shannon (H) se calcularon en función de la frecuencia de fragmentos con secuencias idénticas en las bibliotecas (n = 276899, n = 162107, para E. coli y S. sonnei, respectivamente). Datos disponibles en la Tabla complementaria 3.

Datos fuente

La canalización se asemeja a un flujo de trabajo publicado anteriormente (canalización de secuenciación de biblioteca de expresión de escopeta con código de barras dual (Mutalik et al.34)) con una modificación que evita la amplificación por PCR de fragmentos de ADN metagenómico que confieren resistencia y, por lo tanto, conserva la composición original de las muestras (Métodos ). El flujo de trabajo consta de los siguientes pasos. Primero, todos los plásmidos metagenómicos funcionales obtenidos de las pantallas se agruparon y luego se linealizaron usando la endonucleasa de restricción SrfI. SrfI tiene una secuencia de reconocimiento de ocho pares de bases para minimizar la digestión del inserto metagenómico. A continuación, los plásmidos linealizados se someten a secuenciación de lectura larga de Nanopore (Métodos). La secuenciación de lectura larga identifica el fragmento de ADN metagenómico (inserto) y los dos códigos de barras aleatorios de 10 nucleótidos de largo preclonados aguas arriba y abajo (Uptag y Downtag, respectivamente) de cada fragmento de ADN metagenómico (Métodos). Paralelamente, antes de agrupar los plásmidos metagenómicos de cada pantalla, se aplicó una secuenciación profunda multiplexada de lectura corta para leer los códigos de barras únicos codificados por plásmidos en cada lado de los fragmentos metagenómicos en cada pantalla metagenómica funcional. Específicamente, las secuencias Uptag y Downtag se amplificaron por PCR con cebadores compatibles con la secuenciación Illumina (BC) con código de barras. Después de la secuenciación de Illumina y la desmultiplexación de las muestras con los códigos de barras BC, los conjuntos de datos de Nanopore e Illumina se combinan para asignar cada plásmido (identificado por Up- y Downtags) a un lote de detección que es una combinación única de huésped, antibiótico y biblioteca.

a, Porcentaje de ARG identificados en cada uno de los cuatro hosts de forma única (azul) y en superposición con al menos un host más (rojo). E. coli identificó solo el 57% de los 114 ARG. b, En promedio, solo el 44 % (marcado con una línea discontinua horizontal) de los ARG detectados se superponen entre pares de especies después de tener en cuenta la variabilidad de las pantallas replicadas (83 %), es decir, dividiendo el porcentaje de superposición entre pares de especies entre el porcentaje de superposición entre pantallas replicadas (0,365/0,83). Datos disponibles en el Archivo de datos de origen 6. Las gráficas de caja muestran la mediana (línea horizontal central), el primer y tercer cuartil (parte inferior y superior de la caja, respectivamente), con bigotes que muestran el valor máximo (mínimo) o 1,5 veces el rango intercuartílico de los datos; n = 80 para E. coli, n = 101 para K. pneumoniae, n = 56 para S. enterica y n = 37 para S. sonnei, donde 'n' es el número de ARG identificados en el huésped dado). Los datos están disponibles en la Tabla complementaria 6.

a, La figura muestra el número de ARG que se originan en diferentes grupos filogenéticos y la distribución de cada grupo entre huéspedes y resistomas (n = 114). La mayoría de los ARG se originaron a partir de Proteobacteria. Datos disponibles en el archivo de datos de origen 7. b. La figura muestra el número de ARG identificados en las diferentes categorías mecánicas y la compatibilidad funcional de cada categoría con múltiples hosts (n = 114). Las categorías más frecuentes fueron inactivación de antibióticos, eflujo de antibióticos y reguladores del eflujo de antibióticos. Datos disponibles en la Tabla complementaria 7.

a, Una porción significativamente mayor de ARG que no se detectaron para proporcionar un fenotipo de resistencia en ninguna especie estaba presente en un solo fragmento de ADN que confería resistencia en comparación con los ARG que se detectaron para proporcionar un fenotipo de resistencia en al menos una especie (Two-tailed Fisher's prueba exacta, P = 0,032, n = 80, Tabla complementaria 10). b, Precisión estimada de la pantalla basada en tomar las mediciones de MIC como un conjunto de datos estándar de oro. Tenga en cuenta que excluimos un ARG (QnrB73) de las mediciones de MIC, ya que la reintroducción de este ARG en cada una de las cuatro especies bacterianas huésped no se confirmó mediante la secuenciación de la biblioteca de plásmidos (Archivo de datos de origen 9). La presencia de resistencia en el conjunto de datos de MIC se definió como un cambio de más del doble en el valor relativo de MIC. Los falsos negativos son aquellos ARG que no se detectaron en la pantalla pero mostraron un fenotipo de resistencia en las mediciones de MIC. Los resultados positivos falsos son aquellos que no proporcionaron resistencia en las mediciones de MIC pero se detectaron para mostrar un fenotipo de resistencia en la pantalla. Asumimos el autostop de plásmidos como fuente principal de falsos positivos. Los datos están disponibles en la Tabla complementaria 9c, La distribución de los coeficientes de similitud de Jaccard ajustados que representan las superposiciones de conjuntos ARG funcionales entre pares de especies huésped después de controlar la precisión de la medición utilizando un enfoque estocástico (Métodos). La línea discontinua, la línea azul y las líneas rojas representan el coeficiente de similitud de Jaccard medido para pares de especies hospedantes, la mediana de los coeficientes de similitud de Jaccard ajustados y los límites inferior y superior de los intervalos de confianza del 95 %, respectivamente. d, En total, se estima que solo ~46 % de los ARG (~29 de 63) proporcionan resistencia en las cuatro especies bacterianas huésped. El histograma muestra el número de ARG que se estima que confieren resistencia en las cuatro especies huésped cuando se tienen en cuenta las tasas de falsos positivos y falsos negativos de la pantalla mediante el uso de un enfoque estocástico (ver Métodos). La línea discontinua, la línea azul y las líneas rojas representan el coeficiente de similitud de Jaccard medido para pares de especies hospedantes, la mediana de los coeficientes de similitud de Jaccard ajustados y los límites inferior y superior de los intervalos de confianza del 95 %, respectivamente. (ver Métodos).

a, El número total de ARG es estadísticamente el mismo para los grupos de antibióticos antiguos y nuevos, sin importar qué microbiomas se consideraron. (suelo antropogénico: P = 0,4377, asociado a humanos (intestinal/clínico): P = 0,601, prueba t bilateral de dos muestras de Welch, n = 5 y n = 5 para nuevos y viejos, donde 'n' representa el número de antibióticos, respectivamente; los diagramas de caja muestran la mediana (línea horizontal central), el primer y tercer cuartil (parte inferior y superior de la caja, respectivamente), con bigotes que muestran el valor máximo (mínimo) o 1,5 veces el rango intercuartílico de los datos ). b, Los resultados anteriores se mantuvieron cuando el análisis se restringió a los ARG con eventos de transferencia horizontal de genes establecidos (suelo antropogénico: P = 0,1994, prueba t bilateral de dos muestras de Welch, n = 3 y n = 2 para nuevos y viejos, donde 'n' representa el número de antibióticos, respectivamente; asociados con humanos (intestinales/clínicos): P = 0,6426, prueba t de dos muestras de Welch, n = 4 y n = 5, para nuevos y antiguos, respectivamente). Los datos están disponibles en la Tabla complementaria 7.

Métodos complementarios, descripción de la tabla 1 de datos ampliados, tablas complementarias 1 a 11 y datos de origen Datos ampliados Figs. 1–4.

Tablas complementarias 1–11.

Escaneo sin recortar de la imagen del gel en Datos extendidos Fig. 1 (Klebsiella pneumoniae NCTC 9131 + Biblioteca de suelo por fago K11).

Escaneo sin recortar de la imagen del gel en los datos extendidos Fig. 2 (Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2 + biblioteca intestinal por fago ΦSG-JL2).

Escaneo sin recortar de la imagen del gel en Datos extendidos Fig. 3 (Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2 + biblioteca clínica por fago ΦSG-JL2).

Escaneo sin recortar de la imagen del gel en Datos extendidos Fig. 4 (Electroporación en Escherichia coli K12 BW25113).

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Reimpresiones y permisos

Apjok, G., Számel, M., Christodoulou, C. et al. Caracterización de resistomas antibióticos mediante metagenómica funcional habilitada para bacteriófagos reprogramados en cepas clínicas. Nat Microbiol 8, 410–423 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01320-2

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Recibido: 26 noviembre 2021

Aceptado: 04 enero 2023

Publicado: 09 febrero 2023

Fecha de emisión: marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01320-2

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