Activación del prosencéfalo basal

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 22044 (2022) Citar este artículo

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Las señales ambientales y los estados internos, como el estado de ánimo, la recompensa o la aversión, influyen directamente en los comportamientos de alimentación más allá de la necesidad homeostática. El hipotálamo ha sido ampliamente investigado por su papel en la alimentación homeostática. Sin embargo, aún se desconocen muchos de los circuitos neuronales que impulsan una alimentación no homeostática más compleja que integra señales sensoriales y de valencia (como el gusto y el olfato). Aquí, describimos un circuito de cerebro anterior basal (BF) a habénula lateral (LHb) que modula directamente el comportamiento de alimentación no homeostático. Usando el mapeo de circuitos mediado por virus, identificamos una población de neuronas glutamatérgicas dentro del BF que se proyectan a la LHb, que responde a diversas señales sensoriales, incluidos los olores aversivos y relacionados con los alimentos. La activación optogenética de los circuitos de BF a LHb impulsa una aversión robusta de tipo reflexivo. Además, la activación de este circuito suprime el impulso de comer en ayunas. Juntos, estos datos revelan un papel de las neuronas glutamatérgicas del prosencéfalo basal en la modulación de la aversión asociada a la LHb y los comportamientos de alimentación mediante la detección de señales ambientales.

La alimentación es un comportamiento apetitivo que es esencial para la supervivencia de todos los animales. La alimentación homeostática, o alimentación para cumplir con los requisitos calóricos, consiste en equilibrar la producción calórica con la ingesta calórica para mantener el peso adecuado y la salud metabólica. Sin embargo, este es solo un componente del comportamiento alimentario. Las señales ambientales (como el gusto y el olfato), el estado de ánimo, la recompensa y la aversión afectan la alimentación y pueden impulsar el consumo de alimentos por encima o por debajo de los requisitos calóricos saludables normales1,2,3. A diferencia de la alimentación homeostática, estos mecanismos de alimentación no homeostáticos han evolucionado para hacer que los organismos se adapten a un entorno cambiante, en el que las fuentes de alimento pueden no ser fiables. Sin embargo, cuando los alimentos son de fácil acceso, estos mecanismos pueden volverse desadaptativos.

Un ejemplo clásico de alimentación no homeostática es el comportamiento hedónico basado en la recompensa que impulsa a un animal a consumir alimentos más allá de la necesidad calórica. Recíprocamente, las señales alimentarias aversivas y/o los estímulos amenazantes pueden impedir la ingesta de alimentos incluso en ayunas. Por ejemplo, las señales que indican comida en mal estado o un depredador cercano pueden impulsar un comportamiento de evitación o escape, respectivamente, para garantizar la supervivencia. Si bien en general se aprecia que el hipotálamo regula aspectos clave de la alimentación homeostática4,5,6,7,8, y que las vías de homeostasis, recompensa y aversión convergen para gobernar la alimentación9,10,11, los circuitos, los constituyentes neuronales y los patrones de La conectividad funcional que media en el comportamiento de alimentación no homeostático sigue siendo en gran parte desconocida.

Nosotros y otros hemos identificado recientemente el prosencéfalo basal como un nodo de circuito que impacta directamente en la alimentación no homeostática12,13,14. En particular, cuando las neuronas glutamatérgicas excitatorias del BF se seleccionaron genéticamente para la activación crónica, los ratones exhibieron una hipofagia grave y letal. Esta supresión de la alimentación estuvo acompañada de aversión a la comida y a los estímulos relacionados con la comida. Las proyecciones glutamatérgicas de BF en el área hipotalámica lateral (LHA) se identificaron como parcialmente responsables tanto de la hipofagia como de la aversión observadas; sin embargo, la activación directa de las terminales glutamatérgicas de BF dentro del LHA no fenocopió completamente la aversión asociada a los alimentos mostrada por la activación del cuerpo celular de BF. , lo que sugiere que otros objetivos aguas abajo de la BF contribuyen a la aversión relacionada con los alimentos observada12.

A través del mapeo de proyección anterógrada mediada por virus, encontramos que las neuronas glutamatérgicas del BF también se proyectan hacia la habénula lateral (LHb), un centro de aversión prominente dentro del cerebro3,15, y que la LHb recibe información sensorial del BF. Además, cuando se activan las proyecciones de BF a LHb, este circuito genera una aversión potente similar a un reflejo que interrumpe la memoria. Este circuito suprime el impulso homeostático de comer sin afectar el apetito. Juntos, estos datos identifican un circuito cerebral que vincula el prosencéfalo basal glutamatérgico con la LHb para modular directamente la alimentación independientemente del estado homeostático.

Para determinar cómo las neuronas vGlut2BF pueden impulsar el cese de la alimentación a través de circuitos de evitación/aversión, primero buscamos identificar objetivos efectores aguas abajo implicados en comportamientos aversivos. Para ello, realizamos un mapeo de proyección anterógrada mediante la inyección estereotáxica de un virus adenoasociado a la sinaptofisina::mRuby2 dependiente de Cre (rAAV-Ef1α-flex-Synaptophysin::mRuby2) en el prosencéfalo basal de ratones vGlut2-Cre+/−, lo que permite la identificación de terminales BF presinápticos y sus presuntos objetivos aguas abajo (Fig. 1a, b). Observamos numerosos extremos en regiones previamente descritas con entrada de BF glutamatérgica conocida, incluida el área hipotalámica lateral (LHA), que investigamos previamente (Fig. 1c, Supp. Fig. 112). En particular, la habénula lateral (LHb) estaba fuertemente inervada por proyecciones BF (Fig. 1d). Dado que se sabe que la habénula lateral impulsa comportamientos aversivos3,15, investigamos la conectividad vGlut2BF-a-LHb (vGlut2BF→LHb) como un circuito candidato para mediar la aversión y la supresión de la alimentación.

Las neuronas glutamatérgicas BF inervan sólidamente la LHb y están conectadas funcionalmente a las neuronas glutamatérgicas LHb. ( a ) Configuración experimental para el seguimiento anterógrado de células vGlut2BF. ( b ) Direccionamiento viral representativo de Synaptophysin :: mRuby2 dependiente de Cre al prosencéfalo basal (BF, Bregma 0.62). Barra de escala = 300 μm. ( c ) Cuantificación de diferentes regiones del cerebro que reciben entradas de BF glutamatérgicas. Cuantificación calculada como la densidad de Syn::mRuby2+ terminales/volumen del ROI. PC, corteza piriforme; LHb, habénula lateral; LHA, área hipotalámica lateral; VMH, hipotálamo ventromedial; DMH, hipotálamo dorsomedial; VTA, área tegmentaria ventral; PAG, gris periacueductal; PMN, núcleo premamilar; IPR, núcleo interpeduncular. ( d ) Terminales de proyección de sinaptofisina :: mRuby2 en la habénula lateral (LHb) (Bregma - 1.82). ii) Recuadro ampliado. MHb, habénula medial. ( e ) Configuración experimental del experimento de mapeo de circuitos asistido por canalrodopsina, estimulando terminales vGlut2 + BF mientras se registra desde células mRuby + / vGlut2 + en el LHb. ( f ) Fibras ChR2-EYFP de las neuronas vGlut2BF que terminan en LHb. Las células mRuby+ vGlut2LHb en la LHb se superponen con las proyecciones BF que expresan ChR2. ( g ) Rastro electrofisiológico ex vivo representativo de la célula mRuby + en la LHb. LCR, líquido cefalorraquídeo (control). TTX (1 μM), 4-AP (0,5 μM) y CNQX/AP5 (10 μM/ 50 μM) agregados secuencialmente. ( h ) Mediciones actuales (pA) de células mRuby + LHb después de la estimulación optogenética de terminales BF en (1) aCSF (− 320.20 ± 71.30 pA), (2) + TTX (− 44.20 ± 19.20 pA), (3) + 4AP ( − 243,10 ± 47,08 pA) y (4) + CNQX/AP5 (− 20,43 ± 4,64 pA). Las barras de error representan SEM. Comparado estadísticamente usando un ANOVA unidireccional comparando todos los grupos con el grupo de control aCSF. aCSF frente a TTX: p = 0,0010, aCSF frente a + 4AP: p = 0,5496, aCSF frente a + CNQX/AP5: p = 0,0013. n = 12 para aCSF, n = 10 para TTX, n = 11 para 4AP y n = 7 para CNQX/AP5. ( i ) Amplitud promedio de células mRuby + LHb en aCSF y con la adición de TTX y 4AP. Las barras de error representan SEM. n = 12 y 11, respectivamente. aLCR = − 320,20 ± 71,30 pA, + TTX/4AP = − 243,10 ± 47,08 pA. Comparado estadísticamente mediante una prueba t no pareada, p = 0,3859. ( j ) Latencia promedio al 10% de la corriente máxima de las células mRuby + LHb tras la fotoestimulación de los terminales BF (5.940 ± 0.04 ms). Las barras de error representan SEM. n = 15.

Para respaldar los datos de trazado anatómico, luego probamos si el prosencéfalo basal y la habénula lateral están conectados funcionalmente. Dado que estudios previos mostraron que el LHb contiene principalmente células vGlut2+16, inyectamos un AAV que expresa Channelrhodopsin (ChR2) dependiente de Cre en el BF (rAAV-Ef1α-flex-hChR2 (H134R)-EYFP-WPRE-pA) y un Cre-dependiente Virus reportero mRuby2 en la LHb (rAAV-Ef1α-flex-mRuby2) de animales vGlut2-Cre+/− (Fig. 1e, f). Luego, fotoestimulamos selectivamente las neuronas vGlut2BF que se proyectan a la LHb, mientras realizamos grabaciones de células completas guiadas visualmente a partir de células mRuby+ vGlut2+ dentro de la LHb. En las neuronas objetivo de LHb registradas, observamos una despolarización robusta con fotoestimulación vGlut2BF con una amplitud promedio de - 320.20 ± 71.30 pA (Fig. 1g-i). Además, la latencia promedio desde el final de un pulso de luz de 473 nm hasta el 10 % de la corriente máxima fue de 5,94 ± 0,039 ms, lo que sugiere una conexión monosináptica (Fig. 1j). Además, realizar grabaciones en presencia de TTX y 4-AP indicó que las conexiones vGlut2BF → LHb eran monosinápticas (Fig. 1g-i). Esta respuesta se eliminó en presencia de los antagonistas de los receptores AMPA y NMDA CNQX y APV, lo que indica una respuesta glutamatérgica (Fig. 1g, h). En conjunto, estos datos muestran que las células vGlut2LHb reciben una inervación sólida de las neuronas vGlut2BF y que estos nodos están conectados monosinápticamente.

Además de impulsar la supresión y la aversión a la alimentación, las neuronas vGlut2BF también responden a diversos estímulos sensoriales, incluidas las señales olfativas aversivas y relacionadas con los alimentos12,17,18. Dado que BF y LHb están conectados funcionalmente, a continuación buscamos determinar si las proyecciones de BF a la LHb o las neuronas dentro de la propia LHb responden a la información sensorial. Debido a la abundancia y diversidad de odorantes volátiles, y debido a que se sabe que ciertos olores son innatamente aversivos, apetitosos o gratificantes para los ratones19,20,21, presentamos estímulos olfativos mientras registramos la actividad neuronal de los terminales axónicos vGlut2BF dentro de la LHb. Para esto, nos enfocamos en la expresión de GCaMP8 dependiente de Cre (rAAV-Synapsin-flex-jGCaMP8s) en neuronas vGlut2BF y realizamos fotometría de fibra en el LHb mientras presentábamos olores relacionados con la comida apetitivos19,20 u olores innatamente aversivos (orina de zorro, comida podrida). olor y trazas de aminas19,21) utilizando un olfatómetro de flujo continuo descrito anteriormente (Fig. 2a, b, Supp. Fig. 2a22). Los odorantes se presentaron durante 2 s cada uno, en repeticiones de 10 con un orden aleatorio y 18 s entre la presentación del olor.

Las proyecciones glutamatérgicas de BF a LHb y las células LHb que reciben la entrada de BF responden a estímulos sensoriales aversivos y relacionados con los alimentos. ( a ) Configuración experimental para grabaciones de fotometría de fibra. ( b ) Configuración experimental para registrar terminales de axón vGlut2BF en LHb e imagen representativa de la orientación de fibra óptica (Bregma - 1.58). ( c ) Rastros dF / F de puntuación z promedio de terminales de axón vGlut2BF → LHb (en negro) en réplicas biológicas (n = 12). El contorno gris representa el IC del 95 %. El cuadro rosa representa la entrega de olor de 2 s. El mapa de calor muestra cada presentación de un olor determinado (10 repeticiones por olor) en los 12 ratones. Amarillo = 1 (actividad máxima), azul oscuro = 0 (actividad mínima). Mapa de calor generado por MATLAB (versión R2019a; https://www.mathworks.com/products/matlab.html). ( d ) Respuesta media al olor de las terminales BF registrada mediante fotometría de fibra. Las barras de error representan SEM. n = 12. Puntuación z media de respuestas de olor dF/F: aceite mineral = 0,19 ± 0,22 (p = 0,41), orina de zorro = 0,74 ± 0,22 (p = 0,0070), comida = 0,79 ± 0,35 (p = 0,048), metilbutilamina = 0,80 ± 0,36 (p = 0,047), Cadaverina = 0,73 ± 0,23 (p = 0,0087), Ácido butírico = 0,84 ± 0,28 (p = 0,013). (e) Área media de respuesta al olor bajo la curva (AUC) de terminales BF registrada mediante fotometría de fibra. Las barras de error representan SEM. n = 12. AUC media de las respuestas de olor dF/F de puntuación z: aceite mineral = 78,61 ± 80,24 (p = 0,35), orina de zorro = 273,0 ± 82,50 (p = 0,0070), comida = 289,1 ± 131,1 (p = 0,049) , Metilbutilamina = 302,0 ± 127,6 (p = 0,037), Cadaverina = 256,9 ± 85,95 (p = 0,012), Ácido butírico = 312,7 ± 103,5 (p = 0,012). ( f ) Configuración experimental para grabaciones de fotometría de fibra de células LHb que reciben entrada BF usando AAV1-Cre e imagen representativa de la orientación de fibra óptica (Bregma - 1.58). ( g ) Rastros dF / F de puntuación z promedio de células LHb que reciben entrada BF (en negro) a través de réplicas biológicas (n = 6). El contorno gris representa el IC del 95 %. El cuadro rosa representa la entrega de olor de 2 s. El mapa de calor muestra cada presentación de un olor determinado (10 repeticiones) en los 6 ratones. Amarillo = 1 (actividad máxima), azul oscuro = 0 (actividad mínima). Mapa de calor generado por MATLAB (versión R2019a; https://www.mathworks.com/products/matlab.html). ( h ) Respuesta media al olor de las células LHb que reciben la entrada BF registrada mediante fotometría de fibra. Las barras de error representan SEM. n = 6. Puntuación z media de respuestas de olor dF/F: aceite mineral: − 0,14 ± 0,34 (p = 0,69), orina de zorro = 0,85 ± 0,29 (p = 0,033), comida = 1,83 ± 0,10 (p = < 0,0001) , Metilbutilamina = 1,78 ± 0,18 (p = 0,0002), Cadaverina = 1,66 ± 0,21 (p = 0,0006), Ácido butírico = 1,54 ± 0,24 (p = 0,0013). (i) Área media de respuesta al olor bajo la curva (AUC) de las células LHb que reciben la entrada BF registrada mediante fotometría de fibra. Las barras de error representan SEM. n = 6. AUC media de las respuestas de olor dF/F de puntuación z: aceite mineral = − 51,10 ± 123,3 (p = 0,70), orina de zorro = 306,0 ± 103,0 (p = 0,031), comida = 680,9 ± 37,48 (p = < 0,0001), Metilbutilamina = 652,9 ± 66,78 (p = 0,0002), Cadaverina = 604,0 ± 76,99 (p = 0,0005), Ácido butírico = 553,7 ± 95,45 (p = 0,0021).

Tras la entrega del olor, los terminales vGlut2BF→LHb respondieron tanto a los olores aversivos como a los relacionados con los alimentos, pero no a los controles de aceite mineral (Fig. 2c). La cuantificación de los registros fotométricos, incluida la respuesta al olor promedio y el área promedio bajo la curva (AUC), reveló que las neuronas vGlut2BF→LHb se activaron a niveles similares tanto por la comida como por los olores innatamente aversivos (Fig. 2d, e, Supp. Fig. 3 ). Por ejemplo, al comparar los valores de puntuación z sustraídos de referencia de las respuestas de olor promedio, los terminales vGlut2BF→LHb mostraron un aumento de la fluorescencia en 0,80 ± 0,36 (p = 0,047) para la amina traza metilbutilamina, y aumentó en 0,79 ± 0,35 (p = 0,048) para odorante chow (Fig. 2d). Las proyecciones de VGlut2BF a la LHb tenían menos probabilidades de responder a los olores neutros y no respondieron a la mantequilla de maní odorante de comida apetecible y apetecible (Supp. Fig. 4). Por lo tanto, las proyecciones de vGlut2BF a la LHb parecen responder tanto a la información sensorial aversiva como apetitiva. Dadas las amplias respuestas de las terminales vGlut2BF→LHb, luego cuestionamos en qué medida las neuronas en la LHb reciben y responden directamente a esta información sensorial. Hacia esto, dirigimos estereotáxicamente un Cre transináptico anterógrado (rAAV1-hSyn-Cre)23 al BF de animales de tipo salvaje (C57BL/6NJ), mientras que simultáneamente inyectamos e implantamos el LHb con GCaMP8 dependientes de Cre (rAAV-Synapsin-flex- jGCaMP8s) y un implante de fibra óptica para registros fotométricos (Fig. 2f, Supp. Fig. 2b). Esto nos permitió grabar desde células diana LHb que reciben entrada sináptica BF. De acuerdo con lo que observamos a partir de las respuestas de fotometría en las terminales vGlut2BF, notamos respuestas de olor sólidas a los olores aversivos y relacionados con los alimentos en las neuronas LHb (Fig. 2g-i, Supp. Fig. 5). Por ejemplo, al comparar los valores de puntuación z sustraídos de referencia de las respuestas de olor promedio, las células LHb objetivo de AAV1-Cre en el BF mostraron un aumento de la fluorescencia en 1,78 ± 0,18 (p = 0,0002) para la amina traza metilbutilamina, y en 1,83 ± 0,10 ( p = <0.0001) para comer odorante (Fig. 2h). Las células LHb que recibieron la entrada de BF también parecían responder a varios olores neutros y al apetitoso y sabroso alimento odorante mantequilla de maní (Supp. Fig. 6). Por lo tanto, las proyecciones de vGlut2BF→LHb transmiten una amplia gama de información sensorial, incluidas señales tanto apetitivas/alimentarias como aversivas a la LHb, que también responde a diversos estímulos olfativos.

Hemos identificado el BF glutamatérgico como un nodo importante en la supresión de la ingesta de alimentos y la conducción de la aversión, y hemos demostrado que las neuronas vGlut2BF envían proyecciones sólidas a la LHb. Por lo tanto, buscamos determinar si la conectividad vGlut2BF→LHb modula la alimentación. Hacia esto, dirigimos estereotáxicamente un AAV que expresa Channelrhodopsin2-EYFP dependiente de Cre (rAAV-Ef1α-flex-hChR2 (H134R)-EYFP) 24, o GFP dependiente de Cre como control (rAAV-EF1α-flex-GFP) para el BF de animales vGlut2-Cre+/−. ChR2-EYFP, que está unido a la membrana, rotuló sólidamente las proyecciones BF → LHb de manera similar al etiquetado sinaptofisina :: mRuby2 (Fig. 1d). Sin embargo, dado que ChR2 está localizado en la membrana, también se visualizaron fibras de paso desde el BF a la LHb pasando por el tálamo. Se implantaron fibras ópticas sobre la LHb para estimular selectivamente los terminales vGlut2BF que expresan ChR2 en la LHb (Fig. 3a, b, Supp. Fig. 7).

La activación de las neuronas glutamatérgicas basales del prosencéfalo que proyectan la habénula lateral reduce la ingesta de alimentos y genera aversión. ( a ) Configuración experimental para el comportamiento optogenético in vivo, en el que se activan los terminales vGlut2BF en la LHb. (b) Imágenes representativas que muestran un implante de fibra óptica dirigido a terminales BF en la LHb. Imágenes tomadas en Bregma − 1.46. ii) Recuadro ampliado. ( c ) Línea de tiempo experimental para el ensayo de realimentación con y sin estimulación optogenética de células vGlut2BF → LHb. Ingesta promedio de alimentos (g) de comida medida en intervalos de 5 min con estimulación/sin estimulación a lo largo de la duración de un experimento de realimentación de 20 min. Los símbolos sólidos representan valores promediados, mientras que los símbolos huecos/transparentes representan réplicas biológicas de valores individuales. Significancia estadística calculada utilizando ANOVA de dos vías de medidas repetidas con corrección de Sidak para comparaciones múltiples. Las barras de error representan SEM. n = 7. En el período de tiempo de estimulación de 5 min: controles GFP = 0,12 ± 0,021 g, animales ChR2 = 0,05 ± 0,019 g, p = 0,0078. En un período de tiempo sin estimulación de 10 min: controles GFP = 0,07 ± 0,008 g, ChR2 = 0,100 ± 0,018 g, p = 0,6608. En el período de tiempo de estimulación de 15 min: controles GFP = 0,07 ± 0,016 g, CHR2 = 0,03 ± 0,008 g, p = 0,2345. En un período de tiempo sin estimulación de 20 min: controles GFP = 0,06 ± 0,013 g, ChR2 = 0,097 ± 0,020 g, p = 0,3297. ( d ) Configuración experimental para el ensayo de evitación de lugares en tiempo real con estimulación optogenética. ( e ) Mapas de calor que muestran el movimiento del control representativo de GFP y ratones ChR2-EYFP durante el ensayo de evitación de lugar en tiempo real en el que se estimuló a los ratones en el lado derecho de la cámara. Mapas de calor generados con el software Noldus Noldus EthoVision (XT 16; https://www.noldus.com/ethovision-xt). (f) Porcentaje promedio de tiempo que los controles de GFP y los animales que expresan ChR2-EYFP pasaron en lados de la arena sin estimulación o con estimulación durante un experimento de 20 minutos. Significación estadística determinada mediante prueba binomial para la proporción con corrección de Bonferroni; hipótesis nula = 50%. Las barras de error representan SEM. n = 7. Para los controles GFP, pasaron 47,68 ± 1,98 % de su tiempo en el lado sin estimulación y 51,32 ± 1,97 % en el lado con estimulación, p = 0,7644. Para ChR2: 71,07 ± 4,70 % de tiempo en el lado sin estimulación, 27,84 ± 4,82 % en el lado con estimulación, p < 0,0001. (g) Duración promedio de cada visita al lado de estimulación de la cámara. La significación estadística se determinó utilizando la prueba t de dos colas no pareada. Controles GFP = 17,50 ± 3,98 s, ChR2 = 7,71 ± 1,79 s, p = 0,0447. n = 7. (h) Número de visitas a la zona de estimulación. La significación estadística se determinó utilizando la prueba t de dos colas no pareada. Controles GFP = 42,00 ± 5,52 visitas, ChR2 = 56,29 ± 9,05 visitas, p = 0,2026 (no significativo). n = 7.

Para probar el efecto de la activación de vGlut2BF→LHb en el comportamiento de alimentación, los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche y luego se estimularon con luz de 470 nm a 20 Hz (la tasa de activación máxima de las neuronas vGlut2BF25) con pulsos de 5 ms durante 5 min, seguidos de períodos de descanso de 5 min. mientras se le presenta la comida. El consumo de alimentos se midió cada 5 min durante un total de 20 min (Fig. 3c). Los ratones que expresan ChR2 redujeron drásticamente su ingesta de alimentos en ~ 50 % durante los períodos de fotoestimulación, pero consumieron tanta comida como los animales de control durante los períodos sin fotoestimulación (Fig. 3c; los ratones ChR2-EYFP consumieron 0,05 ± 0,02 g de comida, mientras que los controles GFP consumieron 0,12 ± 0,02 g en la sesión de estimulación inicial (p = 0,0078)). Por lo tanto, la activación selectiva de los terminales vGlut2BF→LHb impidió de manera transitoria y significativa la ingesta de alimentos en animales en ayunas, pero inmediatamente después del cese de la fotoestimulación, se reanudó el comportamiento de alimentación normal sin disminución.

Dado que se ha demostrado que el BF glutamatérgico media la aversión12,26, a continuación preguntamos si la activación optogenética de los terminales vGlut2BF→LHb media el comportamiento aversivo. Para probar esto, sometimos a ratones optogenéticos implantados con LHb (Fig. 3a, b) a un ensayo de evitación de lugar en tiempo real, en el que los ratones fueron fotoestimulados (20 Hz, pulsos de 5 ms) en la mitad de una arena sin marcar (Fig. 3d). Los ratones se grabaron en video y el tiempo que pasaron en cada mitad de la arena se analizó post hoc. Los ratones de control que expresaban GFP pasaron la misma cantidad de tiempo en ambos lados de la cámara (51,32 ± 1,97 % en el lado de estimulación, 47,68 ± 1,98 % de tiempo en el lado sin estimulación, p = 0,7644). Sin embargo, los ratones que expresan ChR2 exhibieron una aversión obvia al área de la arena programada para la fotoestimulación del circuito vGlut2BF→LHb, pasando significativamente menos tiempo en el lado de estimulación en comparación con el lado sin estimulación (27,84 ± 4,82 % en el lado de estimulación, 71,1 ± 4,7% en el lado sin estimulación, p = < 0,0001, Fig. 3e, f). Además, la duración promedio de la visita al lado de la estimulación fue significativamente más corta para los ratones ChR2 en comparación con los controles GFP (7,71 ± 1,79 s para los ratones ChR2-EYFP, 17,5 ± 3,98 s para los controles GFP, p = 0,0447; Fig. 3g). Sin embargo, los controles GFP y los ratones ChR2-EYFP tuvieron un número similar de visitas a la zona de estimulación (Fig. 3h), lo que indica que los ratones ChR2 continuaron aventurándose en la zona de estimulación a pesar de la aversión provocada. Juntas, estas observaciones sugieren que el circuito vGlut2BF→LHb impulsa la aversión al lugar en tiempo real, ya que los ratones ChR2 pasan menos tiempo en general y realizan visitas más cortas a la zona de estimulación durante un ensayo de evitación del lugar en tiempo real.

Debido al fenotipo de aversión dramática observado con la activación del circuito vGlut2BF → LHb, luego cuestionamos si este circuito conduciría a respuestas aversivas aprendidas después del condicionamiento asociativo. Para probar esto, activamos optogenéticamente las neuronas vGlut2BF → LHb cuando los animales estaban en la mitad de una arena que contenía un marcador contextual (paredes con un patrón de rayas; Fig. 4a), y posteriormente medimos su capacidad para asociar la señal con aversión fotoestimulada de vGlut2BF →Circuito LHb. Para esto, los ratones fueron entrenados durante 20 minutos por día, tres días seguidos usando un paradigma de aversión al lugar condicionado (Fig. 4a). El día de la prueba (día 4), los animales se colocaron en la misma cámara que los días anteriores pero no se sometieron a fotoestimulación. La actividad total se registró durante 20 min y el tiempo pasado en cada lado de la cámara se analizó post hoc. A pesar de ser reacios a la fotoestimulación durante un ensayo de evitación de lugar en tiempo real (Fig. 3d-h), los ratones no aprendieron a evitar el lado marcado de una arena el día de la prueba después del entrenamiento de preferencia de lugar condicionado, y gastaron casi el 50 por ciento de su tiempo. tiempo en cualquiera de las mitades de la arena (Fig. 4b; los ratones ChR2-EYFP pasaron 46,43 ± 3,96 % de su tiempo en el lado sin rayas y 50,78 ± 4,07 % de su tiempo en el lado rayado/previamente estimulado, p = 0,6137) . Como control positivo para verificar que los ratones optogenéticos vGlut2BF → LHb no tenían una formación de memoria deteriorada debido a los implantes de fibra invasivos y / o la inyección viral, realizamos un condicionamiento de miedo contextual usando un choque de pies sin fotoestimulación (Supp. Fig. 8a). Todos los ratones exhibieron un aumento significativo en el porcentaje de tiempo de congelación en la cámara de acondicionamiento de choque de pies, tanto 2 como 24 h después del acondicionamiento (Supp. Fig. 8b), lo que indica que los ratones optogenéticos vGlut2BF → LHb tienen circuitos de aprendizaje y memoria intactos.

La estimulación optogenética de los circuitos basales del prosencéfalo a la habénula lateral perjudica la formación de la memoria. ( a ) Paradigma experimental de preferencia de lugar condicionado contextualmente con estimulación optogenética. ( b ) Porcentaje promedio de tiempo que los animales optogenéticos GFP y ChR2-EYFP pasaron en cualquier lado del campo de preferencia de lugar condicionado contextualmente el día de la prueba, sin fotoestimulación. Significación estadística determinada mediante prueba binomial para la proporción con corrección de Bonferroni; hipótesis nula = 50%. Las barras de error representan SEM. n = 7. Para los controles de GFP, gastaron 48,66 ± 2,798 % en la zona sin estimulación, 48,7 ± 2,83 % en la zona de estimulación, p = 0,99. Para los animales ChR2, gastaron 46,43 ± 3,958 % en el lado sin estimulación, 50,78 ± 4,07 % en el lado con estimulación, p = 0,6137. (c) Nuevo paradigma experimental de reconocimiento de objetos. En la versión de fotoestimulación de este paradigma, los ratones fueron fotoestimulados (20 Hz, pulsos de 5 ms) durante 10 min después de una sesión de entrenamiento de 10 min con dos objetos idénticos. Un día después, se probó a los ratones qué tan bien discriminaban entre un objeto novedoso y uno familiar. (d) Índice de discriminación (calculado como: [(tiempo investigando un objeto nuevo – tiempo investigando un objeto familiar)/tiempo total de investigación]*100) el día de la prueba de reconocimiento de objetos nuevos. Un índice de discriminación superior a 0 indica una preferencia por investigar un objeto novedoso, como se esperaba. DI para estimulación GFP = 33,53 ± 3,80%. DI para la estimulación de ChR2 = 0,049 ± 7,38%. DI para GFP sin estimulación = 33,91 ± 7,13 %, DI para ChR2 sin estimulación = 28,55 ± 4,29 %. Significación estadística calculada utilizando un ANOVA de dos vías de medidas repetidas con una corrección de comparaciones múltiples de Bonferroni. Estímulo GFP frente a estímulo ChR2 p = 0,0023. GFP sin estimulación frente a ChR2 sin estimulación p = > 0,9999. ChR2 con estimulación frente a ChR2 sin estimulación p = 0,0113. GFP con estimulación frente a GFP sin estimulación p = > 0,9999.

Debido a la falta de preferencia de lugar condicionada a pesar de la potente aversión producida por la estimulación optogenética del circuito vGlut2BF→LHb, cuestionamos si este circuito estaba pasando por alto el aprendizaje y la memoria de un estado y/o ubicación aversivo, o si estaba potencialmente interrumpiendo la formación de la memoria. Para probar esto, realizamos una nueva tarea de memoria de reconocimiento de objetos en la que la presentación del objeto fue seguida por estimulación optogenética (para no confundir el proceso de entrenamiento). Curiosamente, los ratones que expresan ChR2 no discriminaron un objeto "familiar" de un objeto novedoso, con un índice de discriminación de 0,049 ± 7,38 %, lo que indica que la estimulación del circuito vGlut2BF→LHb ocluye la formación de la memoria. Este efecto fue reversible, ya que los mismos animales discriminaron adecuadamente entre objetos nuevos y familiares cuando se entrenaron sin fotoestimulación (Fig. 4c, d). Juntos, estos datos muestran que, si bien el circuito vGlut2BF→LHb media una aversión potente, esta aversión no se forma en un recuerdo y no se puede asociar con señales contextuales como muchos otros tipos de comportamientos aversivos. Además, la estimulación de este circuito después del entrenamiento inhibe activamente la formación de la memoria.

Debido al fenotipo de aversión dramática observado con la activación de las neuronas vGlut2BF → LHb, a continuación preguntamos si la activación de este circuito promovía una respuesta de estrés o de lucha o huida típica de otros estados altamente aversivos. Para probar esto, analizamos los niveles de las hormonas plasmáticas ACTH, corticosterona, norepinefrina y epinefrina luego de la activación optogenética de las neuronas vGlut2BF→LHb. Se recolectó sangre al inicio (sin estimulación optogenética), inmediatamente después de 5 minutos de fotoestimulación para detectar respuestas de lucha o huida de acción rápida, y 20 minutos después de un período de fotoestimulación de 5 minutos para identificar cualquier posible respuesta de estrés de acción más lenta. Cada punto de tiempo se separó por 2 semanas para permitir una recuperación completa y evitar confundir los puntos de tiempo posteriores (Fig. 5a). Después de aislar el plasma de la sangre total recolectada, medimos la ACTH y la corticosterona mediante radioinmunoensayos y las catecolaminas mediante HPLC. Es importante destacar que no hubo diferencias en los niveles hormonales entre los controles GFP y los animales experimentales ChR2-EYFP al inicio (sin estimulación optogenética; Fig. 5b). Curiosamente, no detectamos diferencias importantes entre los controles GFP y los ratones ChR2-EYFP en ninguna de las hormonas medidas inmediatamente después de la estimulación o 20 minutos después de la estimulación (Fig. 5c, d). De hecho, algunas hormonas, como la epinefrina, exhibieron una reducción en los niveles durante el transcurso del experimento, pero este efecto se observó en los grupos GFP y ChR2-EYFP, lo que podría indicar una aclimatación al procedimiento de extracción de sangre (Fig. 5d). Por lo tanto, la activación de las neuronas vGlut2BF → LHb provoca un comportamiento aversivo robusto sin inducir una respuesta de estrés o de lucha o huida. Junto con la evidencia de que este estado aversivo foto-evocado no se puede contextualizar y perjudica la memoria (Fig. 4), estos datos sugieren que el circuito vGlut2BF→LHb induce una respuesta de aversión instantánea, "similar a un reflejo".

La aversión provocada por la activación del prosencéfalo basal a la habénula lateral no provoca una respuesta de estrés. (a) Paradigma experimental para la recolección de plasma al inicio, después de la estimulación y 20 minutos después de la estimulación. Cada punto de tiempo separado por 2 semanas. ( b ) Niveles hormonales de referencia en todas las hormonas medidas para los controles GFP y los animales ChR2-EYFP. Pruebas estadísticas utilizando múltiples pruebas t no pareadas. Las barras de error representan SEM. n = 6 para controles GFP, n = 7 para animales ChR2-EYFP. Para ACTH: controles GFP = 504,03 ± 158,94 pg/mL, animales ChR2 = 444,82 ± 146,80 pg/mL (p = 0,9799). Para corticosterona: controles GFP = 437,74 ± 93,38 ng/mL, animales ChR2 = 376,45 ± 60,59 ng/mL (p = 0,9111). Para epinefrina: controles GFP = 677,17 ± 115,04 pg/ml, animales ChR2 = 639,29 ± 126,13 pg/ml (p = 0,9950). Para norepinefrina: controles GFP = 873,17 ± 89,83 pg/mL, animales ChR2 = 719,29 ± 94,81 pg/mL (p = 0,6007). ( c ) Niveles hormonales al inicio, después de la estimulación y 20 minutos después de la estimulación para las hormonas de respuesta al estrés ACTH y corticosterona. Significación estadística determinada usando medidas repetidas ANOVA de dos vías con una corrección de Sidak para comparaciones múltiples. n = 6 para controles GFP, n = 7 para animales ChR2-EYFP Para ACTH: controles GFP al inicio = 504,03 ± 158,94 pg/mL, animales ChR2-EYFP al inicio = 444,82 ± 145,80 pg/mL, p = 0,9799. Controles GFP post estimulación = 586,11 ± 129,50 pg/mL, ChR2-EYFP post estimulación = 719,61 ± 77,57 pg/mL, p = 0,8197. Controles GFP 20 min después del estímulo = 630,24 ± 98,01 pg/mL, ChR2-EYFP 20 min después del estímulo = 628,4 ± 89,46 pg/mL, p = > 0,999. Para corticosterona: controles GFP al inicio = 437,74 ± 93,38 ng/ml, animales ChR2-EYFP al inicio = 376,45 ± 60,59 ng/ml, p = 0,9111. Controles GFP post estimulación = 409,17 ± 92,20 ng/mL, ChR2-EYFP post estimulación = 455,90 ± 84,11 ng/mL, p = 0,9575. Controles GFP 20 min post estimulación = 306,86 ± 58,40 ng/mL, ChR2-EYFP 20 min post estimulación = 381,12 ± 33,80 pg/mL, p = 0,8541. ( d ) Niveles hormonales al inicio, después de la estimulación y 20 minutos después de la estimulación para las hormonas de lucha o huida epinefrina y norepinefrina. Significación estadística determinada usando medidas repetidas ANOVA de dos vías con una corrección de Sidak para comparaciones múltiples. n = 6 para controles GFP, n = 7 para animales ChR2-EYFP. Para epinefrina: controles GFP al inicio = 677,17 ± 115,04, animales ChR2-EYFP al inicio = 639,29 ± 126,13, p = 0,9950. Controles GFP posteriores al estímulo = 365,50 ± 37,82, animales ChR2-EYFP posteriores al estímulo = 514,14 ± 53,00, p = 0,1278. Controles GFP 20 min después del estímulo = 364,50 ± 39,10, animales ChR2-EYFP 20 min después del estímulo = 438,00 ± 45,31, p = 0,5698. Para norepinefrina: controles GFP al inicio = 873,17 ± 89,83, animales ChR2-EYFP al inicio = 719,29 ± 94,81, p = 0,6007. Controles de GFP después del estímulo = 768,83 ± 150,05, animales ChR2-EYFP después del estímulo = 546,86 ± 42,95, p = 0,4999. Controles GFP 20 min después del estímulo = 628,33 ± 87,80, animales ChR2-EYFP 20 min después del estímulo = 431,29 ± 58,80, p = 0,2591.

Dado que la activación del circuito vGlut2BF→LHb induce un comportamiento de aversión potente y anula la alimentación inducida por el hambre, a continuación preguntamos si la activación optogenética de este circuito sería suficiente para evitar que los ratones en ayunas consuman comida rica en grasas (HF; 60 % kcal de grasa). que es muy apetecible y gratificante para los ratones. Antes del experimento, los ratones optogenéticos vGlut2BF→LHb se habituaron a la comida HF complementando su dieta todos los días durante tres días. Luego, los ratones en ayunas durante la noche se colocaron en una arena donde un extremo de la arena tenía dos zonas de comida: una con comida normal y la otra con comida HF. Al cruzar a cualquiera de las zonas de comida, los ratones en ayunas recibirían fotoestimulación, pero no recibieron fotoestimulación en el resto de la arena (Fig. 6a). Los ratones se grabaron en vídeo y se midió el consumo de alimentos durante un total de 20 min. Como antes, los ratones que expresan ChR2 exhibieron una fuerte aversión al lado de la cámara con fotoestimulación y pasaron la mayor parte de su tiempo en el lado sin estimulación (Fig. 6b; los ratones ChR2 pasaron 78.29 ± 1.89% de su tiempo en el lado sin estimulación). frente al 11,98 ± 1,60% de su tiempo en el lado estimulación/alimentación, p = < 0,0001). Los ratones ChR2 también pasaron significativamente menos tiempo por visita al lado de estimulación de la cámara (Fig. 6c; los ratones ChR2 pasaron 2,16 ± 0,33 s por visita mientras que los ratones GFP pasaron 16,33 ± 2,3 s por visita, p = < 0,0001), y por lo tanto menos tiempo en las zonas de comida o de comida HF en comparación con los controles GFP. De hecho, los ratones ChR2 pasaron 2,80 ± 0,58 % de su tiempo en la zona de comida y 8,41 ± 1,30 % de su tiempo en la zona de comida HF, mientras que los controles GFP pasaron 20,79 ± 2,74 % de su tiempo en la zona de comida y 26,73 ± 2,45 % de su tiempo en la zona de comida HF (Fig. 6d). Sin embargo, a pesar de la aversión a la zona de fotoestimulación, los animales ChR2 consumieron la misma cantidad total de comida normal o HF que los controles GFP (Fig. 6e; los ratones GFP consumieron 0,05 ± 0,03 g de comida y 0,53 ± 0,05 g de comida HF mientras que los ratones ChR2 consumieron 0,03 ± 0,01 g de comida y 0,36 ± 0,09 g de comida HF). En particular, los ratones ChR2 realizaron visitas mucho más cortas a las zonas de comida o de comida HF (Fig. 6f) y viajaron una distancia total mayor que los controles GFP (Fig. 6g). Por lo tanto, los ratones ChR2 adaptaron su estrategia de alimentación para hacer viajes más cortos a las zonas de alimentación, evitando la fotoestimulación entre los episodios de alimentación. Los ratones ChR2 también realizaron de manera más desproporcionada más viajes a la zona de comida HF (Fig. 6h). Estos datos sugieren que bajo la presión de la fotoestimulación vGlut2BF→LHb ligada a la aversión, los animales ChR2 optan por buscar alimentos más ricos en calorías y más gratificantes. Además, los ratones ChR2 consumieron la misma cantidad de alimentos que los controles GFP en menos tiempo al realizar viajes más cortos pero más frecuentes a la zona de alimentos y consumir alimentos a un ritmo más rápido. Si bien estos datos muestran parcialmente la flexibilidad conductual de los ratones para obtener alimentos de manera eficiente cuando se enfrentan a una presión externa, también revelan una distinción fundamental: mientras que la aversión provocada por el circuito vGlut2BF→LHb es suficiente para reducir el tiempo dedicado a interactuar con los alimentos y reduce la ingesta de alimentos de forma aguda. (Fig. 3), la activación transitoria de este circuito no afecta el apetito. Es decir, el circuito vGlut2BF→LHb impulsa la aversión que puede anular el comportamiento de alimentación cuando se activa, pero esta activación en sí misma no reduce el apetito o la motivación para comer.

La activación de las neuronas glutamatérgicas del prosencéfalo basal que proyectan la habénula lateral anula el impulso de comer, pero no afecta el apetito. ( a ) Configuración experimental para la estimulación optogenética de neuronas vGlut2BF → LHb emparejadas con alimentos. (b) Porcentaje promedio de tiempo que los controles GFP y los animales ChR2-EYFP pasaron en las partes de estimulación o no estimulación de la arena durante un experimento de 20 minutos. Las barras de error representan SEM. Significación estadística determinada mediante prueba binomial para la proporción con corrección de Bonferroni; hipótesis nula = 50%. n = 7. Los controles GFP pasaron 43,00 ± 3,45 % del tiempo en el lado sin estimulación y 50,71 ± 3,22 % del tiempo en el lado con estimulación/comida (p = 0,4705). Los animales ChR2-EYFP pasaron 78,29 ± 1,89 % del tiempo en el lado sin estimulación en comparación con 11,98 ± 1,60 % del tiempo en el lado de estimulación/comida (p = < 0,0001). ( c ) La duración promedio de cada visita al lado de estimulación de la cámara para animales GFP y ChR2-EYFP. Las barras de error representan SEM. Significancia estadística determinada usando una prueba t de dos colas no pareada. n = 7. Los animales GFP gastaron 16,33 ± 2,3 s por visita. Los animales ChR2-EYFP gastaron 2,157 ± 0,33 s por visita. p = < 0,0001. ( d ) El porcentaje de tiempo que los controles de GFP y los animales ChR2-EYFP pasaron interactuando con comida o comida con alto contenido de grasa (dentro de la parte de estimulación de la arena). Las barras de error representan SEM. Significancia estadística determinada usando ANOVA de dos vías con una corrección de Tukey para comparaciones múltiples. n = 7. En la zona de comida: los controles GFP pasaron 20,79 ± 2,74 % del tiempo, los animales ChR2-EYFP pasaron 2,80 ± 0,58 % del tiempo (p = < 0,0001). En la zona de comida rica en grasas: los controles GFP pasaron 26,73 ± 2,45 % del tiempo, los animales ChR2-EYFP pasaron 8,41 ± 1,3 % del tiempo (p = < 0,0001). ( e ) Ingesta acumulada promedio de alimentos de los controles GFP y animales ChR2-EYFP durante el experimento de 20 min. Las barras de error representan SEM. Significancia estadística determinada usando ANOVA de dos vías con corrección de Tukey para comparaciones múltiples. n = 7. Comida consumida: controles GFP = 0,05 ± 0,03 g, animales ChR2-EYFP = 0,03 ± 0,01 g (p = 0,9888). Comida HF consumida: controles GFP = 0,53 ± 0,05 g, animales ChR2-EYFP = 0,36 ± 0,09 g (p = 0,1640). Comida GFP frente a comida GFP HF: p = < 0,0001. ChR2 chow frente a ChR2 HF chow: p = 0,0013. (f) La duración promedio de cada visita a las zonas de comida o de comida con alto contenido de grasa para los controles GFP y los animales ChR2-EYFP. Las barras de error representan SEM. Significancia estadística determinada usando ANOVA de dos vías con corrección de Tukey para comparaciones múltiples. n = 7. Promedio de visitas a la zona de comida: controles GFP = 7,11 ± 0,97 s, animales ChR2-EYFP = 1,43 ± 0,25 s (p = < 0,0001). Promedio de visitas a la zona de comida rica en grasas: controles GFP = 8,49 ± 1,10 s, animales ChR2-EYFP = 2,14 ± 0,31 s (p = < 0,0001). ( g ) La distancia promedio recorrida de los controles GFP y los animales ChR2-EYFP durante el experimento de elección de alimentos de 20 min. Las barras de error representan SEM. La significación estadística se determinó utilizando la prueba t de dos colas no pareada. n = 7. Controles GFP = 45,66 ± 9,94 m, animales ChR2-EYFP = 82,21 ± 28,33 (p = 0,0074). (h) El número promedio de visitas a las zonas de comida o de comida con alto contenido de grasa de la arena para los controles GFP y los animales ChR2-EYFP. Las barras de error representan SEM. Significancia estadística determinada usando ANOVA de dos vías con corrección de Tukey para comparaciones múltiples. n = 7. Viajes a zona de comida: controles GFP = 41,43 ± 3,36, ChR2-EYFP = 27,14 ± 2,42 (p = 0,0286). Viajes a la zona de comida rica en grasas: controles GFP = 44,7 ± 3,1, animales ChR2-EYFP = 55,57 ± 4,31 (p = 0,1285). Comparando comida GFP vs. comida GFP HF: p = 0,8987. Comparando ChR2-EYFP chow vs. ChR2-EYFP HF chow: p = < 0,0001.

Mientras que la canalrodopsina revela si un circuito es suficiente para un comportamiento particular, también probamos la necesidad de circuitos vGlut2BF→LHb para la aversión y el comportamiento de alimentación a través de la inhibición optogenética, dirigiendo la arquerodopsina dependiente de Cre (ArchT-GFP) al BF y fibra óptica sobre el LHb de animales vGlut2-Cre+/− para inhibir los terminales vGlut2BF→LHb. Los experimentos electrofisiológicos validaron que la fotoinhibición impulsada por ArchT de los terminales BF inhibe de manera efectiva la transmisión sináptica a las células diana de LHb (Supp. Fig. 9; ver métodos). Al realizar ensayos de comportamiento in vivo, la inhibición optogenética de los terminales vGlut2BF→LHb no dio como resultado un fenotipo de preferencia de lugar en tiempo real, ni afectó la ingesta de alimentos en un ensayo de realimentación (suplemento Fig. 10 y 11). Debido a la redundancia de los circuitos de alimentación y aversión en el cerebro27, es probable que el circuito vGlut2BF→LHb sea suficiente, pero no singularmente necesario, para regular la alimentación adecuada y los comportamientos aversivos. No obstante, nuestros datos identifican claramente un circuito de aversión capaz de anular el impulso de comer de una manera rápida y reflexiva.

En este estudio, hemos identificado que las neuronas vGlut2BF se proyectan sólidamente a la LHb, un importante centro de aversión del cerebro. Usando fotometría de fibra e imágenes de calcio in vivo, encontramos que el circuito vGlut2BF→LHb responde a información sensorial diversa, incluidas señales sensoriales aversivas y relacionadas con los alimentos. Usando la optogenética, observamos que las proyecciones de vGlut2BF→LHb generan una fuerte aversión y anulan el consumo de alimentos sin afectar el apetito. Esta aversión no se recordaba después del condicionamiento, ni desencadenó una respuesta de estrés o de lucha o huida. La activación del circuito vGlut2BF→LHb también perjudicó la formación de la memoria. Por lo tanto, este circuito de aversión de BF a LHb actúa instantáneamente de manera refleja (Fig. 7).

Gráficamente abstracto. La información sensorial olfativa se transmite a la LHb a través del circuito glutamatérgico BF para impulsar comportamientos aversivos, anulando comportamientos apetitivos como la alimentación.

El prosencéfalo basal es un nodo con varias funciones, incluido el procesamiento sensorial, la atención, la motivación, el aprendizaje y la memoria18,25,28,29,30,31,32,33,34,35. Anteriormente, nosotros y otros hemos revelado de forma independiente que el LM tiene un papel en la supresión del apetito y los comportamientos aversivos12,13,14,26. Una de las formas en que el BF puede impulsar distintos comportamientos es a través de sus proyecciones diferenciales. Los objetivos del BF incluyen regiones sensoriales como la corteza piriforme, regiones asociadas a la alimentación como el hipotálamo y regiones asociadas a la recompensa/aversión como la amígdala basolateral, el área tegmental ventral y la habénula lateral12,13,26. Si bien este estudio se centró en el papel de las proyecciones de BF a la LHb en la aversión y la alimentación, estudios anteriores han demostrado que las proyecciones de BF a la LHA también generan aversión e hipofagia12. El LHA es un objetivo particularmente interesante del BF porque se sabe que las neuronas vGlut2LHA también impulsan la aversión y la supresión del apetito de forma independiente10. Sin embargo, la activación del campo terminal de las proyecciones vGlut2BF→LHA no recapitula completamente la aversión inducida por los cuerpos celulares de BF. Esto indica que otros nodos aguas abajo, como el LHb, pueden trabajar en conjunto con el LHA para modular tales comportamientos.

Se sabe que la LHb está involucrada en las conductas de aversión y escape, se activa con el estrés y el castigo, así como con las señales sensoriales que predicen el castigo, y en general impulsa un estado aversivo a través de su inhibición tanto de la motivación como de la recompensa dopaminérgica mesolímbica y del rafe dorsal. sistemas serotoninérgicos15,36,37,38,39,40,41,42. Con respecto a la alimentación, las proyecciones de LHA a LHb inhiben la alimentación hedónica e impulsan conductas aversivas9. Por lo tanto, la LHb sirve como candidato principal para la convergencia de los circuitos de aversión y alimentación. Descubrimos que la activación de las proyecciones de vGlut2BF en LHb suprime el impulso de comer y provoca aversión al lugar en tiempo real. Muchas otras entradas a la habénula lateral dan como resultado aversión cuando se estimula, incluyendo el área preóptica lateral, el pallidum ventral, el tabique medial y el hipotálamo lateral9,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. También ha habido informes de proyecciones recíprocas del LHb al LHA36. La conectividad recíproca entre estos dos nodos puede sincronizar diferentes centros de aversión en el cerebro para garantizar una respuesta de comportamiento rápida y rápida a los estímulos amenazantes o desadaptativos. Con el BF aguas arriba y conectado funcionalmente tanto al LHb como al LHA, el BF podría proporcionar un mayor control sinérgico de la aversión y facilitar esta sincronización. Por lo tanto, la interconectividad de BF, LHA y LHb proporciona un interesante circuito de tres nodos mediante el cual la información aversiva y apetitiva se sincroniza para impulsar cambios rápidos en el estado de comportamiento. Es importante tener en cuenta que la mayoría de las manipulaciones en este estudio involucraron experimentos optogenéticos de ganancia de función usando canalrodopsina para activar terminales de axón BF. Una advertencia potencial para este método de experimentación es la posibilidad de retropropagación de potenciales de acción. Sin embargo, los fenotipos hipofágicos de la estimulación optogenética de LM observados previamente12 difieren de los fenotipos de aversión más amplios observados en este estudio, lo que indica que probablemente este no sea el caso en nuestros experimentos. Además, la incapacidad para promover la alimentación y/o suprimir la aversión a través de la inhibición del campo terminal dentro de la LHb a través de la estimulación con arquerodopsina dirigida no demuestra definitivamente una manipulación de pérdida de función de buena fe. Esto puede ser que este nodo de circuitos por sí solo no pueda controlar dichos comportamientos, o también puede considerarse un obstáculo técnico para silenciar de manera efectiva la comunicación en este nodo utilizando este enfoque.

El BF juega un papel importante en el procesamiento y la integración sensorial, y se ha demostrado que responde a señales sensoriales aversivas y apetitivas12,17,18,30,31,32,34. Usando indicadores de calcio codificados genéticamente y fotometría de fibra, observamos que las proyecciones de vGlut2BF→LHb, así como las células LHb que reciben entrada de BF, responden a diversos estímulos sensoriales. Se ha demostrado previamente que la LHb se activa mediante varios tipos de estímulos sensoriales, incluidos los estímulos aversivos y las señales predictivas aversivas, así como las señales gratificantes41,44,53,54,55. Por lo tanto, una ruta que transmite diversa información sensorial a la LHb probablemente sea a través de la BF.

Diversos estímulos sensoriales activan tanto las terminales del axón vGlut2BF→LHb como las células LHb que reciben la entrada de BF. Cabe señalar que es interesante que las respuestas celulares de LHb fueran mucho más agudas y de mayor magnitud que las respuestas terminales de BF. Esto puede ser un aspecto técnico debido a las diferencias en la relación señal-ruido cuando se registra desde el soma frente a las terminales del axón, o puede indicar diferencias fisiológicas. Por ejemplo, las terminales BF pueden estar menos sincronizadas en sus respuestas a las señales sensoriales, prolongando la respuesta al olor, mientras que las células LHb pueden responder de manera más uniforme y rápida. Una pregunta crítica es si son las mismas o diferentes poblaciones de BF/LHb las que responden a las señales sensoriales aversivas y apetitivas, respectivamente. Al medir solo las respuestas de la población sumadas a través de la fotometría de fibra, es difícil abordar esta pregunta. Ambos nódulos están compuestos por tipos de células heterogéneas y diferentes subpoblaciones pueden responder a estímulos gratificantes y aversivos53,56. Sin embargo, considerando que estos nodos también responden a olores neutros, también es posible que este circuito responda de manera amplia, o no selectiva, a la información sensorial. Es posible que el circuito vGlut2BF→LHb se active tanto por los olores relacionados con los alimentos como por los aversivos porque modula la aversión y la supresión de la ingesta de alimentos de forma independiente, a través de distintos mecanismos. Del mismo modo, la respuesta a los olores neutros puede indicar un papel de las proyecciones BF en la transmisión de cualquier información sensorial destacada a los centros de recompensa y aversión. Por lo tanto, será fundamental determinar si las proyecciones de vGlut2BF→LHb contienen conjuntos funcionalmente distintos que responden a señales apetitivas o aversivas, respectivamente. O bien, si las proyecciones de vGlut2BF→LHb responden ampliamente a la información sensorial, será fundamental determinar qué otras regiones del cerebro asignan valencia a esta información sensorial, por ejemplo, a través de objetivos posteriores adicionales del BF o a través de otras entradas a la LHb.

Los estímulos aversivos normalmente forman asociaciones con diferentes señales sensoriales y contextuales. Además, se esperaría que comportamientos aversivos tan drásticos generaran una respuesta de estrés. La incapacidad de que la aversión vGlut2BF→LHb se asocie con señales contextuales o genere una respuesta de estrés hormonal es, por lo tanto, algo sorprendente. Sin embargo, estudios independientes han revelado que la aversión provocada por los cuerpos celulares de BF tampoco impulsa la preferencia de lugar condicionada26, lo que indica que la aversión impulsada por BF no parece recordarse. Aún más sorprendente, la estimulación optogenética de los circuitos vGlut2BF→LHb después del novedoso entrenamiento de reconocimiento de objetos perjudicó por completo la discriminación de objetos, lo que indica que los circuitos vGlut2BF→LHb inhiben activamente la formación de la memoria. Si bien es provocativo, esto plantea la pregunta de cuál sería el propósito evolutivo de un circuito que impulsa la aversión instantánea y perjudica la consolidación de la memoria. Quizás la naturaleza reflexiva e instantánea de la aversión impulsada por vGlut2BF→LHb se deriva de la capacidad de este circuito para interrumpir todas las funciones conductuales y cognitivas, lo que facilita una respuesta aversiva inmediata. Una vez que esta señalización está ausente, pueden sobrevenir funciones cognitivas como el aprendizaje y la memoria, o comportamientos motivados como la alimentación. Otros estudios también han indicado que la activación o la inhibición de la LHb altera el condicionamiento contextual57, por lo que tal vez cualquier perturbación de la señalización de la LHb sea suficiente para afectar el aprendizaje y la memoria. Estos efectos en la memoria se alinean con nuestras observaciones de que los ratones que expresan ChR2 regresan continuamente a una zona de fotoestimulación durante los ensayos de evitación de lugares en tiempo real, haciendo la misma cantidad de viajes que los controles GFP a pesar de la aversión provocada. Una posible interpretación de estos datos es que la activación del circuito vGlut2BF→LHb aumenta la impulsividad, lo que hace que los ratones no puedan aprender y que entren repetidamente en una zona aversiva. Finalmente, dado que los ratones que expresan ChR2 reanudan el consumo normal de alimentos inmediatamente después de la estimulación optogenética, la activación del circuito vGlut2BF→LHb no parece estresar al animal, ya que los animales con estrés agudo pierden el apetito58. En conjunto, los ensayos de aprendizaje y memoria y los datos hormonales indican que el circuito vGlut2BF→LHb impulsa la aversión reflexiva que es distinta de otros comportamientos aversivos.

Cuando se les desafía a consumir alimentos en un área de fotoestimulación aversiva, los ratones optogenéticos vGlut2BF→LHb adaptan su estrategia de comportamiento para hacer viajes cortos pero frecuentes a una zona de alimentos para que puedan consumir la mayor cantidad de alimentos posible en un corto tiempo, lo que resulta en alimentos similares. niveles de ingesta como controles. Dado que la ingesta acumulada de alimentos no se ve afectada, esto indica que la activación del circuito vGlut2BF→LHb inhibe la ingesta de alimentos sin afectar el apetito o la ingesta total de alimentos. Este resultado contrasta con la obvia supresión de la alimentación cuando los ratones son estimulados continuamente a lo largo de una arena (como en la Fig. 3c). Una explicación para estos resultados contrastantes es que cuando los ratones solo son estimulados en una zona específica de una arena, pueden iniciar el comportamiento de alimentación en episodios cortos, escapando a una zona sin estimulación una vez que la fotoestimulación aversiva se activa al máximo. Por otro lado, cuando son fotoestimulados continuamente, los ratones nunca inician la alimentación y por lo tanto consumen menos alimentos en comparación con los controles GFP. Estos datos respaldan la interpretación de que el circuito vGlut2BF→LHb impulsa principalmente un fenotipo aversivo que anula el comportamiento de alimentación sin afectar el apetito. La supresión de la ingesta de alimentos, por tanto, es secundaria a la conducta aversiva. Sin embargo, una interpretación alternativa es que el circuito vGlut2BF→LHb tiene funciones separadas tanto en la supresión como en la aversión a la alimentación. Esta interpretación alternativa está respaldada por datos de fotometría de fibra que revelan respuestas de olor tanto a señales relacionadas con los alimentos como aversivas, así como datos que muestran una falta de una respuesta de estrés hormonal después de la estimulación optogenética, ya que muchos circuitos de aversión desencadenan lucha o huida y liberación de la hormona del estrés. Tal vez la supresión de la alimentación y la aversión normalmente se analizan por separado a través de diferentes tasas de activación, magnitud de la respuesta neuronal o reclutamiento de diferentes conjuntos neuronales. Sin embargo, la naturaleza artificial de la estimulación optogenética, en la que toda la población de BF→LHb se dispara a una frecuencia específica, puede enmascarar la señalización fisiológica de vGlut2BF→LHb. No obstante, estos datos indican que el circuito vGlut2BF→LHb es suficiente para impulsar tanto la aversión reflexiva potente como la supresión drástica de la alimentación.

En resumen, hemos identificado e interrogado un circuito del cerebro anterior basal que impulsa una aversión potente y reflexiva que anula los comportamientos de alimentación. La naturaleza reflexiva de esta aversión es única y altera nuestra comprensión de cómo los circuitos de aversión compiten con los comportamientos motivados para generar respuestas rápidas a los estímulos innatamente aversivos. Además, este estudio proporciona información crítica sobre cómo la aversión/recompensa y el procesamiento sensorial interactúan con los circuitos homeostáticos para alterar el comportamiento alimentario y el peso corporal. Desde una perspectiva evolutiva, los comportamientos motivados esenciales para la supervivencia, como la búsqueda de alimento, la alimentación y la reproducción, deben equilibrarse con la precaución de entornos nuevos y/o extraños, y la conciencia de las señales ambientales que indicarían recompensa o peligro. Por lo tanto, numerosos circuitos neuronales de aversión y escape en el cerebro deben conectarse para anular los circuitos de alimentación cuando sea necesario si hay una amenaza presente. Al estudiar cómo funcionan estos circuitos y cómo están conectados anatómicamente, podemos comprender y tratar mejor los trastornos devastadores como la obesidad y los trastornos alimentarios, que tienen importantes efectos directos sobre la salud, así como muchos otros efectos secundarios perjudiciales59,60. Además, debido a la participación de la LHb en la adicción, los trastornos del estado de ánimo y la esquizofrenia15,61, comprender la influencia del circuito BF en este nodo de aversión puede ayudar potencialmente a comprender otros tipos de enfermedades mentales.

Ratones:

vGlut2-Cre (Slc17a6tm2(cre)Bajo)

Fuente: Laboratorio Jackson

Cepa #: 016963

Tipo salvaje C57BL/6NJ

Fuente: Laboratorio Jackson

Cepa #: 005304

AAV:

Sinaptofisina dependiente de Cre: AAV-Ef1α-flex-Synaptophysin::mRuby2-WPRE-hGHpA

Serotipo: DJ8

Fuente: Núcleo de neuroconectividad en el Instituto de Investigación Neurológica Jan and Dan Duncan

ChR2 dependiente de Cre: AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA

Serotipo: 2/9

Fuente: Núcleo de Neuroconectividad en el Instituto de Investigación Neurológica Jan and Dan Duncan; plásmido subclonado de Addgene #26973

mRuby dependiente de Cre: AAV-Ef1α-flex-mRuby2

Serotipo: DJ8

Fuente: Núcleo de Neuroconectividad en el Instituto de Investigación Neurológica Jan and Dan Duncan; plásmido subclonado de Addgene #40260

GFP dependiente de Cre: AAV-Ef1α-flex-eGFP

Serotipo: DJ8

Fuente: Núcleo de Neuroconectividad en el Instituto de Investigación Neurológica Jan and Dan Duncan; plásmido subclonado de Addgene #28304

GcaMP dependiente de Cre: AAV-Syn-flex-GcaMP8s-WPRE-hGHpA

Serotipo: DJ8.

Fuente: Núcleo de Neuroconectividad en el Instituto de Investigación Neurológica Jan and Dan Duncan; plásmido de Addgene #10083962

AAV1-Cre: AAV1-hSyn-Cre-WPRE-pA

Serotipo: 2/1 (anterógrado)

Fuente: Addgene #105553 (Núcleo viral de U Penn)

ArchT dependiente de Cre: AAV-CAG-flex-ArchT-GFP

Serotipo: 2/9

Fuente: Núcleo de Neuroconectividad en el Instituto de Investigación Neurológica Jan and Dan Duncan; plásmido de Adddgene #28307 del laboratorio de Edward Boyden63

Los ratones utilizados en este estudio fueron tratados de conformidad con el Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU. y la IACUC. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por Baylor College of Medicine y el comité autorizado de aprobación de protocolos BCM IACUC con el número de protocolo AN5596. Todos los métodos se informaron de acuerdo con las recomendaciones de las pautas ARRIVE. Para todos los experimentos, se utilizaron compañeros de camada masculinos y femeninos, y se distribuyeron en grupos experimentales y de control. Los ratones tenían al menos 8 semanas de edad para las cirugías estereotáxicas y el comportamiento se realizó en ratones de entre 3 y 5 meses de edad. Los animales se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y se alojaron en grupo. Se alimentó a los ratones con comida estándar para ratones (Harlan, 2920X), y esta comida o comida rica en grasas (60% kcal de grasa, Research Diets Inc 12492) se usó para los experimentos de alimentación. Se adquirieron ratones vGlut2-Cre (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J Stock No. 01696364) de Jackson Laboratories. El genotipado de vGlut2-Cre se realizó con los siguientes cebadores de Jackson Laboratories: Mutant Reverse "ACA CCG GCC TTA TTC CAA G" (Primer 13007), Common "AAG AAG GTG CGC AAG ACG" (Primer 32667) y Wild type Reverse " CTG CCA CAG ATT GCA CTT GA" (Primer 32668). Para obtener heterocigotos (vGlut2-Cre+/-), se cruzaron ratones homocigotos vGlut2-Cre (vGlut2-Cre+/+) con ratones de tipo salvaje C57BL/6NJ (Jackson labs Stock No. 005304).

Para todas las cirugías estereotáxicas, los ratones fueron anestesiados y mantenidos bajo anestesia usando ~ 1-3% de isoflurano vaporizado con oxígeno. Se utilizó un instrumento estereotáxico conectado al software Angle Two para apuntar con precisión a regiones del cerebro. Después de nivelar el cráneo en las direcciones ML y AP (dentro de +/− 0,03 mm), se enfocaron diferentes regiones usando coordenadas determinadas empíricamente. La coordenada AP se desplazó ligeramente hacia delante para ajustar la inclinación del cerebro, y las coordenadas optimizadas se verificaron mediante inyecciones de diI antes de cualquier experimento de cirugía estereotáxica. Hacia esto, el prosencéfalo basal se apuntó a través de inyecciones bilaterales de bregma, AP = 1,18 mm, DV = − 5,8 mm y ML = ± 1,29 mm. Para todos los experimentos, se usaron 150 nL de virus por lado y el virus se concentró en las regiones del prosencéfalo basal medial desde Bregma 0,97 hasta Bregma 0,50. Para los experimentos de trazado anatómico, se utilizó AAV-Ef1α-flex-Synaptophysin::mRuby2-WPRE-hGHpA (serotipo DJ8). Para el mapeo de circuitos asistido por canalrodopsina, se utilizó AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (serotipo 2/9) para la activación asistida por luz, y AAV-Ef1α-flex-mRuby2 (serotipo DJ8) fue se utiliza para etiquetar celdas desde las que grabar. Para la validación electrofisiológica de ArchT-GFP, se mezcló AAV-CAG-flex-ArchT-GFP (serotipo 2/9) con AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (serotipo 2/9) como Relación 1:1 por volumen. Para los ensayos de comportamiento optogenético se utilizó AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (serotipo 2/9) para animales de experimentación con ganancia de función, se utilizó AAV-Ef1α-flex-eGFP (serotipo DJ8) para los controles, y se utilizó AAV-CAG-flex-ArchT-GFP (serotipo 2/9) para los experimentos de pérdida de función. Para los experimentos de obtención de imágenes de calcio, se utilizó AAV-Synapsin-flex-jGCaMP8s-WPRE-pA (serotipo DJ8) y/o AAV1-hSyn-Cre-WPRE-pA (serotipo 2/123). Todos los virus se titularon a al menos 1011 partículas virales/µL.

Al menos dos semanas después de la inyección viral, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se les perfundió transcardiacamente con PBS seguido de PFA al 4 % (diluido con paraformaldehído al 16 % EM Grade No. 15710 Electron Microscopy Sciences). Los cerebros se diseccionaron y se fijaron más en PFA al 4 % durante la noche a 4 °C, seguido de crioprotección durante la noche en sacarosa al 20 % en PBS y, finalmente, durante la noche en sacarosa al 30 % en PBS a 4 °C. Luego, los cerebros crioprotegidos se incluyeron y congelaron en OCT (Fisher HealthCare No. 4585) y se almacenaron a -80 °C hasta el corte. Los cerebros se cortaron coronalmente en dirección anterior a posterior en un criostato (Leica CM1860) a 40 μm para experimentos de rastreo/marcaje viral y 80 μm para determinar los sitios de implante de fibra óptica post hoc. Si se rebanaba a 40 μm, se recolectaba una de cada tres secciones. Si se corta a 80 μm, se recogieron todas las secciones. Después de lavar con PBS, los cortes se montaron en portaobjetos y se tiñeron con DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, 0100–20). Las imágenes se tomaron con un microscopio confocal Leica TCS SPE a 10 o 20x, un microscopio Leica TCS SP8 STED o un microscopio Leica SP8X. Todas las imágenes en mosaico se tomaron a 10x. Para la cuantificación del marcaje de BF sinaptofisina::mRuby2, se analizaron tres animales en todo el cerebro, desde el bulbo olfatorio hasta el cerebelo. En las regiones en las que se observó el etiquetado de sinaptofisina::mRuby2, se tomaron tres imágenes por región (identificadas mediante el Allen Brain Atlas) en diferentes cortes dentro de un animal. La señal fluorescente se cuantificó post hoc utilizando Imaris, en el que se dibujaron máscaras sobre las regiones de interés (ROI) y se restó la señal de fondo para calcular un volumen de terminales sinaptofisina::mRuby2 dividido por el volumen total de la ROI. A continuación, se promediaron las réplicas técnicas dentro de un animal para crear un promedio de réplicas biológicas, que se utilizó para calcular una densidad media general de sinaptofisina::mRuby2 en todas las réplicas biológicas.

Los experimentos de registro electrofisiológico de rebanadas se realizaron como se describió anteriormente65 con modificaciones menores. Brevemente, los ratones se anestesiaron profundamente con isoflurano y luego se perfundieron transcardiacamente con una solución de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) helada que contenía (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 glucosa y 25 bicarbonato. (pH 7,3, 295 mOsM). Se extrajeron los cerebros y se transfirieron a una solución de corte helada que contenía (en mM): 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 10 MgSO4, 0,5 CaCl2, 234 sacarosa, 11 glucosa y 26 bicarbonato. La solución de corte se burbujeó continuamente con 95 % de CO2/5 % de O2. Los cerebros se incluyeron coronalmente en agarosa de bajo punto de fusión al 1,5%. Los cerebros incluidos en agar se sumergieron inmediatamente en una solución de corte oxigenada en un vibratomo Leica VT1200. Se realizaron secciones coronales de trescientos micrómetros a una velocidad de corte de 0,4 mm/s. Los cortes se retiraron a una cámara de recuperación de cortes de aCSF oxigenado a 37 °C durante al menos 30 min. Después de la recuperación, los cortes se devolvieron lentamente a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de registrarlos.

Para el mapeo del circuito optogenético de las entradas glutamatérgicas del prosencéfalo basal a la LHb, las células vGlut2+ LHb se identificaron a través del etiquetado de mRuby2 y se parchearon. Las células parcheadas se sujetaron primero con voltaje a -65 mV para registrar las propiedades de la membrana de referencia. Para verificar la presencia de una corriente de entrada provocada por la luz, se activó la canalrodopsina mediante iluminación de campo completo de una fuente de luz de xenón filtrada filtrada a (Olympus, U-N41020). El inicio y la duración de la estimulación con luz se controlaron a través del software ClampEx (versión 10.3) mediante un obturador mecánico (Sutter). Luego, las celdas parcheadas se sujetaron con tensión a 0 mV (ajustadas para el potencial de unión) para revelar las corrientes hacia el exterior. Si se observó una corriente de salida evocada por la luz en aCSF, entonces se aplicaron en baño en serie TTX (1 µM), 4AP (0,5 µM) y CNQX (10 µM/APV (50 µM) para verificar: (1) el potencial de acción -dependencia; (2) la naturaleza monosináptica; y (3) la dependencia del receptor de glutamato de la corriente evocada.

Para validar nuestra capacidad de inhibir el circuito vGlut2BF→LHb a través de la estimulación ArchT, inyectamos una mezcla 1:1 por volumen de AAV-CAG-flex-ArchT-GFP y AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA al BF, y se realizaron registros de sujeción de voltaje de celda completa a partir de celdas en el LHb de acuerdo con las especificaciones anteriores. Al identificar aquellos que respondieron a la estimulación presináptica de ChR2 en terminales BF usando luz de 470 nm, luego probamos si la inhibición de ArchT suprimió el disparo provocado por ChR2. Hacia esto, se entregó continuamente luz de 565 nm durante un período sostenido. Luego, durante la fotoinhibición de ArchT, se estimuló secuencialmente ChR2 (luz de 470 nm) para probar si ArchT suprimía la activación provocada por ChR2. Finalmente, se detuvo la estimulación de ArchT y se usó la estimulación de ChR2 para reactivar reversiblemente la célula LHb postsináptica.

Para los experimentos de imágenes de calcio del terminal del axón BF, se inyectaron bilateralmente rAAV-Syn-flex-GCaMP8s-WPRE-hGHpA62 en el HDB utilizando las coordenadas descritas anteriormente. Para las imágenes de calcio del cuerpo celular de LHb, se inyectó bilateralmente rAAV1-hSyn-Cre-WPRE-pA en el HDB y rAAV-Syn-flex-GcaMP8s-WPRE-hGHpA en el LHb izquierdo. Al mismo tiempo que la inyección viral, se aseguró un implante de fibra óptica (núcleo de 200 um con NA = 0,50, RWD R-FOC-L200C-50NA) sobre el LHb izquierdo usando las coordenadas de bregma AP = − 1,45, ML = − 0,45 y DV = − 2,60 utilizando el mismo proceso que el anterior. Además, se cementó una placa de cabeza de aluminio en la parte posterior del cráneo que permitiría fijar la cabeza de los ratones en una rueda para correr durante la presentación del olor. Se permitió que los ratones curaran y expresaran el virus durante 3 semanas antes de que se produjeran los registros de fotometría de fibra.

Durante las grabaciones de fotometría de fibra, se fijó la cabeza de los ratones en una rueda para correr con un olfatómetro22 colocado aproximadamente a 6 cm de su nariz. Los odorantes presentados incluyeron orina de zorro (Predator Pee), comida (alimento 5V5 triturado y disuelto en aceite mineral), metilbutilamina (Sigma 241407), cadaverina (Sigma 52063), ácido butírico (Sigma B103500), R(+)-limoneno (Sigma 183164), S(-)-limoneno (Sigma 218367), aceite de rosa (Rainbow Abby) y mantequilla de maní (Justin's). Todos los olores se disolvieron en mineral al 2% de concentración por volumen y se presentaron en repeticiones de 10, en orden aleatorio. Se usó aceite mineral solo como control negativo. Todos los olores eran nuevos excepto el odorante 5V5 chow.

Los registros de fotometría de fibra se realizaron utilizando el sistema Doric como se describe en66. Brevemente, dos diodos emisores de luz (465 y 405 nm de longitud de onda) se acoplaron a un cubo de filtro mediante cables de fibra óptica (núcleo de 400 um, NA = 0,48). El cubo de filtro separó las longitudes de onda de excitación y emisión, dirigiendo las longitudes de onda de excitación a lo largo de otra fibra óptica (núcleo de 200 um, NA = 0,48) que se conectó a la fibra óptica implantada en el ratón mediante una funda de férula. Las longitudes de onda de emisión se transportaron desde el ratón hasta el cubo del filtro a lo largo de la misma fibra, luego se dirigieron a un fotodetector de femtovatios (Newport) a través de un cable de fibra óptica (núcleo de 600 um, NA = 0,48). La excitación y la emisión se controlaron y registraron, respectivamente, en el software Doric Studio. jGCaMP8s se excitó a 465 nm para registrar la dinámica del calcio indicativa de la actividad neuronal. Excitando simultáneamente a 405 nm, el punto isosbéstico para GCaMP, recolectamos emisiones que eran insensibles a la unión de calcio. Esto se usó para controlar los artefactos de movimiento y otros ruidos independientes del calcio. Para grabar desde el canal de control (405 nm) y el canal experimental (465 nm) simultáneamente, empleamos una estrategia "bloqueada" en la que cada LED se moduló a una frecuencia alta diferente (típicamente 270 y 500 Hz, respectivamente). La emisión resultante de ambos modos de excitación fue registrada por el mismo fotodetector y la señal fue demodulada en línea en Doric Studio para separar el canal de control del canal experimental. Luego, ambas señales se convirtieron a dF/F en el estudio Doric utilizando su herramienta de análisis, restando el canal de control al canal experimental para reducir el ruido. Se calculó la dF/F con puntuación Z para los 5 s anteriores y 20 s después de cada presentación de olor. Los olores se presentaron durante 2 s seguidos de un intervalo entre pruebas de 18 s. Los mapas de calor se generaron en MATLAB (versión R2019a). Los pulsos TTL generados por Arduino activaron el olfatómetro y se usaron como entrada digital durante la grabación para alinear con precisión la fotometría de fibra con la presentación del olor. Una vez que se promediaron 10 réplicas técnicas para cada ratón individual, las réplicas biológicas se promediaron juntas para crear un promedio compuesto. La respuesta de puntuación z promedio se calculó para 3 s antes (línea de base) y 3 s después de la entrega del olor. Luego, las respuestas de referencia promedio se restaron de la respuesta de olor para generar una respuesta de olor normalizada de referencia en todos los olores. Luego se calculó la significancia estadística utilizando una prueba t de una muestra, comparando las respuestas de olor normalizadas con 0 (la hipótesis nula).

Para implantes optogenéticos, ratones vGlut2-Cre+/− de ocho semanas de edad fueron inyectados estereotáxicamente bilateralmente en el BF con rAAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (serotipo 2/9), rAAV-Ef1α-flex- GFP (serotipo DJ8), o rAAV-CAG-flex-ArchT-GFP (serotipo 2/9). Una semana más tarde, a los ratones se les implantaron bilateralmente implantes de fibra óptica hechos a medida sobre la LHb, como se describe en Patel y Swanson 201967. Brevemente, se peló un cable de fibra óptica con núcleo de 200 um (0,22 NA, FG200AEA) y se fijó en una férula de 230 um (Thor Labs CFLC2301-10) usando epoxi curado con luz ultravioleta (Bondic). El implante se recortó a 3,5 mm y el extremo plano del implante se pulió para garantizar una alta salida de luz (al menos 1 mW). La habénula lateral se implantó bilateralmente en un ángulo de 15 grados en las coordenadas de bregma AP = − 1,58, ML = ± 0,34 y DV = − 2,85. Los implantes de fibra óptica se aseguraron con cemento (cemento dental Metabond C y B, Parkell) y se cubrieron con acrílico flash reticulado (Yates-Motloid 44115 y 44119). Se recortaron agujas de calibre 18 a aproximadamente 1 pulgada de largo y se aseguraron con acrílico sobre la parte posterior del cráneo para unir los ratones a los cables de conexión sin frotarlos, y en su lugar se usaron pinzas de anillo para unir los ratones a los cables de conexión. Se permitió que los ratones se recuperaran durante dos semanas después de la cirugía de implante antes de los experimentos de comportamiento.

A los compañeros de camada vGlut2-Cre+/− masculinos y femeninos se les inyectó estereotáxicamente rAAV-flex-ChR2-EYFP o rAAV-flex-GFP en el BF y se les implantó fibra óptica sobre el LHb para estimular los terminales BF. Después de 2 semanas de recuperación, los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche. Al día siguiente, los ratones se conectaron a cables de conexión y se les permitió aclimatarse solos a una cámara de comportamiento durante 5 minutos antes de comenzar el experimento. Después de la aclimatación, a los ratones individuales se les presentó comida y se los fotoestimuló con un láser de 473 nm (Doric; salida de al menos 1 mW) a 20 Hz con pulsos de 5 ms durante 5 min. Después de 5 min, se apagó el láser y se pesó el alimento. Luego se permitió que los ratones consumieran alimentos sin fotoestimulación durante 5 min. Esto se repitió una vez más (5 min con fotoestimulación, seguido de 5 min sin fotoestimulación) durante una duración total de 20 min, pesando la ingesta de alimentos cada 5 min. Se calculó la ingesta promedio de alimentos para cada punto de tiempo, y los grupos de control de ChR2 y GFP se compararon mediante un ANOVA de dos vías de medidas repetidas.

Para los ratones ArchT-GFP, se realizó la misma cirugía estereotáxica que la anterior pero usando rAAV-CAG-flex-ArchT-GFP. Después de la recuperación, los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche, se conectaron a cables de fibra óptica, se les proporcionó comida y se les permitió consumir alimentos durante 20 minutos sin fotoestimulación para calcular una ingesta de alimentos de referencia (los alimentos se pesaron cada 5 minutos). La semana siguiente, los mismos ratones se ayunaron durante la noche y luego se fotoinhibieron con un láser de 561 nm (CrystaLaser) a 1 Hz con pulsos de 900 ms durante 20 min continuamente mientras se les proporcionaba comida. Los alimentos se pesaron cada 5 min. Se calculó la ingesta de alimentos promedio para cada punto de tiempo, y se compararon los grupos "sin estimulación" y "con estimulación" a través de un ANOVA de dos vías de medidas repetidas.

A los compañeros de camada vGlut2-Cre+/− masculinos y femeninos se les inyectó estereotáxicamente rAAV-flex-ChR2-EYFP, rAAV-flex-GFP o rAAV-CAG-flex-ArchT-GFP en el BF y se les implantó fibra óptica sobre el LHb para estimular Terminales BF. Después de 2 semanas de recuperación, los ratones se conectaron a cables de conexión y se colocaron en una arena rectangular grande (25 pulgadas x 17 pulgadas). Se permitió que los ratones se aclimataran durante 5 minutos y luego comenzó el ensayo. Los movimientos de los animales se rastrearon utilizando una cámara que interactuaba con el software de código abierto Bonsai68, que podía detectar cuando un ratón estaba en un ROI predeterminado. Luego, este software activó un pulso TTL para la fotoestimulación láser (luz de 473 nm, 20 Hz, pulsos de 5 ms para ratones ChR2 o luz de 561 nm, 1 Hz, pulsos de 900 ms para ratones ArchT) cuando el ratón estaba en esta región. Usando este software, los ratones fueron fotoestimulados en la mitad de la arena mientras deambulaban libremente durante un total de 20 minutos, mientras se grababan en video. Para la preferencia de lugar condicionada, este paradigma se repitió durante 3 días seguidos y el día de la prueba se repitió sin fotoestimulación. Tanto para la evitación de lugares condicionados como en tiempo real, el tiempo pasado en cada mitad de la arena se calculó post-hoc utilizando el software de código abierto Optimouse en MATLAB69. La significación estadística se determinó utilizando una prueba binomial con la hipótesis nula de que los ratones pasarían el 50 % de su tiempo en ambas mitades de la arena. Los mapas de calor se generaron utilizando el software Noldus EthoVision (XT 16).

El condicionamiento del miedo contextual se realizó como se describió previamente70 con algunas modificaciones menores. Brevemente, los ratones se manipularon 3 min por día durante 3 días y luego se habituaron a la cámara de acondicionamiento durante 20 min durante dos días consecutivos. El día del entrenamiento, los ratones se colocaron en una cámara con marcadores contextuales visuales en las paredes y se aclimataron durante 2 min (ingenuo). Luego, los ratones recibieron descargas de 2 pies con 90 s de diferencia (0,75 mA, 2 s cada una). Un minuto más tarde, los ratones fueron devueltos a sus jaulas de origen. Dos y 24 h más tarde, los ratones se volvieron a colocar en la cámara de acondicionamiento durante 5 min para evaluar la memoria a corto y largo plazo, respectivamente. Durante este tiempo, la respuesta de congelación (inmovilidad) se registró utilizando un video en tiempo real analizado por FreezeView. La significación estadística se midió utilizando un ANOVA de dos vías de medidas repetidas con una corrección de Sidak para comparaciones múltiples.

El reconocimiento de objetos nuevos se realizó como se describió previamente71 con modificaciones menores. Los ratones se habituaron a una cámara de plástico negro (37 × 37 × 37 cm) y a cables de fibra óptica optogenéticos durante 10 minutos por día durante tres días antes del entrenamiento. El día del entrenamiento, los ratones se conectaron a cables de fibra óptica y se les permitió explorar dos objetos idénticos durante 10 min. Después de este entrenamiento, se retiraron los objetos y se fotoestimuló a los ratones a 20 Hz (pulsos de 5 ms) durante 10 min, y luego se los devolvió a su jaula de origen. 24 h más tarde (el día de la prueba), los ratones se conectaron a cables de fibra óptica y se les presentó un objeto del día anterior (el objeto familiar) y un objeto novedoso de aproximadamente el mismo tamaño (objeto novedoso) durante 10 minutos. Usando el software AnyMaze (versión 6.2), la cantidad de tiempo investigando cualquiera de los objetos fue registrada por experimentadores entrenados ciegos al tratamiento experimental. Se definió que los ratones estaban investigando un objeto si su nariz estaba olfateando dentro de un radio de 2 cm del objeto. A partir de estos datos, se calculó un índice de discriminación restando el tiempo dedicado a investigar el objeto familiar del objeto novedoso y dividiéndolo por el tiempo total de investigación como porcentaje [(tiempo investigando el objeto novedoso − tiempo investigando el objeto familiar)/(tiempo investigando el objeto novedoso + objeto familiar)] × 100. Para probar la reversibilidad del efecto de la fotoestimulación, se realizó el mismo ensayo una semana después sin fotoestimulación y con un conjunto diferente de objetos familiares y novedosos. La significación estadística se determinó mediante un ANOVA de dos vías de medidas repetidas con una corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples.

El plasma para las mediciones hormonales se recolectó en tres momentos: (1) línea de base, en la que los animales se conectaron a cables de fibra óptica y se les permitió aclimatarse durante 2 horas para eliminar el estrés de manejo, luego se retiraron de los cables y se recolectó sangre inmediatamente. (2) post-estimulación, en la que los animales se conectaron a cables de fibra óptica, se aclimataron durante 2 h, se estimularon durante 5 min a 20 Hz (pulsos de 5 ms), se retiraron y se extrajo sangre inmediatamente, o (3) 20 min post-estimulación , en el que los animales se sujetaron a cables, se aclimataron durante 2 h, se estimularon durante 5 min (pulsos de 20 Hz, 5 ms), se dejaron descansar durante 20 min y luego se extrajeron y se extrajo sangre. Estos tres puntos de tiempo se separaron por intervalos de 2 semanas para evitar resultados confusos del estresante proceso de recolección de sangre y para permitir que los animales se recuperaran de la pérdida de sangre entre las recolectas. El plasma se recogió pinchando la vena submandibular con una lanceta y recogiendo sangre completa en viales tratados con EDTA. Para las catecolaminas (epinefrina y norepinefrina), la solución de EGTA-glutatión se preparó de acuerdo con las especificaciones básicas de Vanderbilt University Hormone Assay and Analytical Services Core para usarse como conservante. Brevemente, se disolvieron 4,5 g de EGTA y 3,0 g de glutatión en 50 ml de dIH2O (pH de 6,0 a 7,4). La solución de EGTA-glutatión se añadió a los tubos de catecolamina inmediatamente después de la extracción de sangre a una concentración de 1:50. La sangre se centrifugó a 14.000 g durante 15 min a 4 °C para aislar el plasma. El plasma se extrajo de la capa superior, se congeló rápidamente y se almacenó a -80 °C hasta que se envió a Vanderbilt Hormone and Analytics Core para el análisis hormonal. Los niveles de ACTH y corticosterona se midieron mediante radioinmunoensayos mediante un procedimiento de doble anticuerpo, y las catecolaminas, norepinefrina y epinefrina, mediante HPLC mediante detección electroquímica. La significación estadística se midió utilizando un ANOVA de dos vías de medidas repetidas con una corrección de Sidak para comparaciones múltiples.

A los compañeros de camada vGlut2-Cre+/− masculinos y femeninos se les inyectó estereotáxicamente rAAV-flex-ChR2-EYFP o rAAV-flex-GFP en el BF y se les implantó fibra óptica sobre el LHb para estimular los terminales BF. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche y se colocaron en una arena rectangular grande (25 pulgadas x 17 pulgadas) donde se les permitió aclimatar durante 5 minutos. En un lado de la arena, se colocó comida de forma segura en una esquina, mientras que comida con alto contenido de grasa se colocó de forma segura en la esquina adyacente. Usando el código abierto.

Bonsai68, la fotoestimulación se limitó a un ROI a lo largo del lado de la comida de la arena, lo suficientemente grande como para fotoestimular al ratón mientras consumía o interactuaba con la comida. Los ratones se grabaron en vídeo y se registró la ingesta de alimentos durante un total de 20 min. Se calculó la ingesta de alimentos promedio tanto para el chow como para el chow con alto contenido de grasa para los ratones ChR2-EYFP y GFP y se compararon mediante ANOVA de dos vías. El tiempo pasado en el lado de estimulación de la arena, así como el tiempo pasado interactuando con cualquiera de los alimentos elegidos, se calcularon post-hoc usando Optimouse en MATLAB69, y se compararon usando un ANOVA de dos vías.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Un agradecimiento especial al Dr. Joshua Ortiz-Guzman, la Dra. Jennifer Selever y el Núcleo viral del Instituto de Investigación Neurológica (incluidos Zihong Chen y Ying Wang) por la producción de AAV utilizados en estos experimentos. Además, gracias a los miembros del laboratorio Arenkiel por su colaboración y ayuda en la edición de este manuscrito. El proyecto descrito fue apoyado a través de los premios multi-PI del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (Subvención No. R01DK109934) y el Departamento de Defensa de EE. UU. (Subvención No. DOD W81XWH-19-1-0429) a BRA y QT, 1R01DK131446 y R01 DK120858 a QT, R01 NS078294 y UF1NS111692 a BRA, y los núcleos de neuroconectividad y neurovisualización en Baylor College of Medicine, que cuentan con el apoyo de la subvención número P50 HD103555 del IDDRC del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver. El proyecto descrito también fue apoyado en parte por Vanderbilt Hormone and Analytics Core respaldado por las subvenciones de NIH DK059637 (MMPC) y DK020593 (DRTC). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver, los Institutos Nacionales de Salud o el Departamento de Defensa. También nos gustaría agradecer al Instituto Médico McNair y a Charif Souki por su continuo y generoso apoyo a la investigación asociada.

Departamento de Genética Molecular y Humana, Baylor College of Medicine, Houston, TX, EE. UU.

Jessica L. Swanson, Joshua Ortiz-Guzman, Snigdha Srivastava, Sean W. Dooling, Elizabeth Hanson Moss, Mikhail Y. Kochukov, Patrick J. Hunt, Brandon T. Pekarek y Benjamin R. Arenkiel

Instituto de Investigación Neurológica Jan and Dan Duncan, Texas Children's Hospital, Houston, TX, EE. UU.

Jessica L. Swanson, Joshua Ortiz-Guzman, Snigdha Srivastava, Elizabeth Hanson Moss, Mikhail Y. Kochukov, Patrick J. Hunt, Jay M. Patel, Brandon T. Pekarek y Benjamin R. Arenkiel

Programa de formación de científicos médicos, Baylor College of Medicine, Houston, TX, EE. UU.

Snigdha Srivastava, Patrick J. Hunt y Jay M. Patel

Departamento de Neurociencia, Baylor College of Medicine, Houston, TX, EE. UU.

Pey-Shyuan Chin, Jay M. Patel y Benjamin R. Arenkiel

Centro de Enfermedades Metabólicas y Degenerativas, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Houston, Houston, TX, EE. UU.

Tong de Qingchun

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JLS: conceptualización, diseño experimental, realización de experimentos, recopilación de datos, análisis de datos, redacción y edición de manuscritos, creación de figuras. JOG: tutoría y capacitación práctica, conceptualización, diseño experimental, realización de experimentos. SS: recopilación de datos, análisis de datos, creación de figuras. PC: recopilación de datos, análisis de datos, creación de figuras, edición de manuscritos. SWD: realizar experimentos, recopilar datos, análisis de datos. EHM: realizar experimentos, recopilar datos, análisis de datos, edición de manuscritos. MYK: realizar experimentos, recopilar datos, análisis de datos. PJH: realizar experimentos, recopilación de datos, análisis de datos, edición de manuscritos, creación de figuras. JMP: conceptualización, tutoría, diseño experimental, edición de manuscritos. BTP: tutoría, análisis de datos, edición de manuscritos. QT: conceptualización, tutoría, edición del manuscrito. BRA: tutoría, conceptualización, diseño experimental, edición del manuscrito.

Correspondencia a Benjamin R. Arenkiel.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Swanson, JL, Ortiz-Guzman, J., Srivastava, S. et al. La activación del circuito del prosencéfalo basal a la habénula lateral impulsa la aversión reflexiva y suprime el comportamiento de alimentación. Informe científico 12, 22044 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26306-8

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Recibido: 24 agosto 2022

Aceptado: 13 de diciembre de 2022

Publicado: 21 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26306-8

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