Secuenciación del transcriptoma de una sola célula de neuronas inspiratorias del complejo preBötzinger en ratones neonatales

Scientific Data volumen 9, Número de artículo: 457 (2022) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Las neuronas del complejo preBötzinger del tronco encefálico (preBötC) generan el ritmo y el patrón motor rudimentario para los movimientos respiratorios inspiratorios. Realizamos grabaciones de pinzamiento de parche de células enteras de neuronas inspiratorias en el preBötC de rodajas de ratón neonatal que retienen in vitro la ritmicidad relacionada con la respiración. Clasificamos las neuronas en función de sus propiedades electrofisiológicas y antecedentes genéticos, y luego aspiramos su contenido celular para la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq). Este conjunto de datos proporciona secuencias de nucleótidos sin procesar (archivos FASTQ) y archivos anotados de secuencias de nucleótidos asignadas al genoma del ratón (mm10 de Ensembl), que incluye recuentos de fragmentos, longitudes de genes y fragmentos por kilobase de transcripción por millón de lecturas asignadas (FPKM ). Estos datos reflejan los transcriptomas de las neuronas que generan el ritmo y el patrón de los movimientos respiratorios inspiratorios.

Mediciones)

secuencias de nucleótidos

Tipos de tecnología

Secuenciación de Illumina

Tipo(s) de factor(es)

genotipo: neuronas derivadas de Dbx1 frente a neuronas no derivadas de Dbx1 en el complejo preBötzinger de ratón • propiedades electrofisiológicas: neuronas del complejo preBötzinger inspiratorio tipo 1 frente a tipo 2

Muestra Característica - Organismo

Músculo de ratón

Muestra Característica - Ambiente

entorno de laboratorio

Muestra Característica - Ubicación

Estados Unidos contiguos de América

La fase activa inexorable de la respiración es la inspiración, en la que el descenso del diafragma y la elevación de las costillas expanden los pulmones para aspirar aire1. El ritmo de la inspiración emana del sitio inferior del tronco encefálico llamado complejo preBötzinger (preBötC)2,3,4. Los elementos ritmogénicos centrales del preBötC son interneuronas derivadas de células precursoras que expresan el gen homeobox en desarrollo homeobox-1 cerebral (Dbx1), en lo sucesivo denominadas neuronas Dbx15,6,7,8,9,10. Las neuronas Dbx1 también transmiten el ritmo inspiratorio como un patrón de salida a las premotoneuronas y motoneuronas para los músculos de la bomba y de las vías respiratorias11,12. La inspiración comienza con una fase preinspiratoria atribuida únicamente a las neuronas ritmogénicas11,13,14. Cuando su actividad alcanza un umbral, se produce un estallido inspiratorio que recluta neuronas que influyen y transmiten el patrón de salida motora13,14,15. Las neuronas generadoras de patrones y ritmos son los dos subconjuntos de la población de neuronas Dbx1 en el preBötC.

Los generadores de patrones y ritmos se pueden diferenciar electrofisiológicamente. Las neuronas tipo 1 son putativamente ritmogénicas. Se activan con una suma similar a una rampa de potenciales sinápticos de 300 a 500 ms antes del inicio de un estallido inspiratorio de gran magnitud16,17. Las neuronas de tipo 1 expresan una corriente de K+ transitoria (IA) de tipo A. El bloqueo de IA desestabiliza el ritmo inspiratorio y la actividad preinspiratoria global in vitro18. Las neuronas de tipo 2 están supuestamente especializadas para generar el patrón de salida. Se activan ~300 ms más tarde que el Tipo-116,17 y expresan una corriente catiónica mixta (Ih) activada por hiperpolarización, cuya manipulación afecta la salida motora19.

Diferenciamos electrofisiológicamente las neuronas tipo 1 y tipo 2 durante las grabaciones de pinzamiento de parche de células enteras. A pesar de la disparidad bien caracterizada entre los tipos, algunas neuronas exhiben una fisiología ambigua y no pueden clasificarse de manera confiable; los llamamos Desconocidos pero, sin embargo, los consideramos importantes para la respiración porque están en el preBötC y están rítmicamente activos en fase con la inspiración in vitro. Recuperamos el contenido citoplasmático y realizamos la secuenciación de ARN de próxima generación en 10 muestras: cuatro neuronas de tipo 1 (tres de precursores que expresan Dbx1 y una obtenida de un ratón de tipo salvaje CD-1 sin un reportero de Dbx1), una neurona de tipo 2 de un precursor que expresa Dbx1, así como 5 neuronas desconocidas de ratones de tipo salvaje CD-1. Todas las neuronas se registraron y se extrajo el ARN en dos meses y se enviaron juntas para la secuenciación de próxima generación.

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de William & Mary aprobó estos protocolos, que se ajustan a las políticas de la Oficina de Bienestar de los Animales de Laboratorio (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.) y las directrices del Consejo Nacional de Investigación20. Se mantuvieron ratones CD-1 (Charles River, Wilmington, MA) y ratones genéticamente modificados (descritos a continuación) en un ciclo de 14 horas de luz/10 horas de oscuridad a 23 °C y se alimentaron ad libitum con libre acceso al agua.

Los experimentos emplearon ratones CD-1 o un modelo de ratón interseccional denominado Dbx1;Ai148. En cuanto a la nomenclatura del modelo interseccional, la primera parte se refiere a ratones Dbx1Cre (IMSR Cat# EM:01924, RRID:IMSR_EM:01924) que expresan la recombinasa Cre impulsada por el promotor Dbx121. La segunda parte, Ai148 (IMSR Cat# JAX:030328, RRID:IMSR_JAX:030328), se refiere a ratones con respuesta Cre creados por el Allen Brain Institute que expresan el indicador fluorescente Ca2+ GCaMP6f después de la recombinación mediada por Cre de alelos floxed22. Cruzamos ratones hembra Dbx1Cre con machos Ai148 para producir descendencia con expresión de GCaMP6f en neuronas derivadas de Dbx1.

Limpiamos todos los espacios de trabajo con RNase ZAP (Thermo Fisher, Waltham, MA) antes de cada experimento. Las herramientas y el material de vidrio se esterilizaron en autoclave o se limpiaron con RNase ZAP y luego se enjuagaron con agua libre de nucleasas (NFW).

Anestesiamos cachorros CD-1 o Dbx1;Ai148 (de 0 a 3 días posnatales, es decir, P0-3) mediante hipotermia según lo indicado por las pautas de la Asociación Médica Veterinaria Estadounidense (AVMA, Schaumburg, IL) versión 2020.0.1, que tiene licencia bajo la Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Sin Derivadas 3.0. Extrajimos el neuroeje de la protuberancia a la médula espinal cervical en 2 minutos y lo colocamos en líquido cefalorraquídeo artificial helado (aCSF) que contenía (en mM): 124 NaCl, 3 KCl, 1,5 CaCl2, 1 MgSO4, 25 NaHCO3, 0,5 NaH2PO4 y 30 dextrosa. Se preparó aCSF con anticipación en un ambiente libre de RNasa y luego se burbujeó con 95 % de O2 y 5 % de CO2 durante los experimentos. El neuroeje se recortó para aislar el tronco encefálico y luego se pegó a la superficie dorsal de un bloque de agar y luego se colocó en un tornillo de banco dentro de un vibratomo (Campden Instruments 7000 smz-2, Leicester, Reino Unido) lleno de aCSF helado aireado por 95 % O2 y 5% CO2. Cortamos un corte transversal de 450–500 µm de espesor con preBötC en su superficie rostral23. El corte se empleó durante no más de 3 horas para evitar la degradación y contaminación de los contenidos genéticos citoplasmáticos.

La Figura 1a (arriba) muestra nuestro flujo de trabajo de electrofisiología. Perfundimos cortes con aCSF (28 ° C) a 2–4 ​​ml / min en una cámara de registro en un microscopio de fisiología (Zeiss Axio Examiner, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemania). La concentración externa de K+ del aCSF se elevó de 3 a 9 mM para facilitar el ritmo respiratorio robusto y la salida motora del hipogloso (XII)4,24. Registramos la salida del motor XII utilizando electrodos de succión fabricados con pipetas de vidrio de borosilicato esterilizadas en autoclave (DE: 1,2 mm, DI: 0,68 mm), inicialmente tiradas de un extractor de micropipetas Flaming-Brown P-97 (Sutter Instruments, Novato, CA), luego pulidas al fuego a un diámetro de ~100 µm. La salida del motor XII se amplificó en 2000 utilizando un amplificador diferencial (EX1, Dagan Instruments, Minneapolis, MN), filtrado de paso de banda a 0,3–1 kHz y suavizado para su visualización utilizando un filtro analógico de raíz cuadrática media (Analog Devices, Norwood , MA) para proporcionar una forma de onda XII rectificada y suavizada de onda completa. En cortes de ratón Dbx1; Ai148, identificamos neuronas preBötC Dbx1 inspiratorias basadas en cambios de fluorescencia rítmica en sincronización con la salida XII antes de obtener una grabación de pinza de parche de células completas. En ratones CD-1, identificamos neuronas preBötC inspiratorias que se activaron en sincronía con la salida del motor XII después de establecer el registro de células completas. Fabricamos pipetas de parche de vidrio de borosilicato esterilizado en autoclave (DE: 1,5 mm, DI: 0,86 mm) utilizando un programa de 4 etapas en el extractor de micropipetas Flaming-Brown P-97. La resistencia de la punta se midió entre 3 y 5 MΩ. Llenamos pipetas de parche con solución interna, mezclada en un ambiente libre de ARNasa, que contenía (en mM): 123 K-gluconato, 12 KCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 4 Mg-ATP, 0,3 Na-GTP, 10 Na2-fosfocreatina , y 13 glucógeno. Ajustamos la osmolaridad de la solución interna (parche) a 260-270 mOsm y mantuvimos el pH en 7,25. Inhibidor de ribonucleasa recombinante (RRI) (Takara Bio USA, Mountain View, CA) a la solución interna inmediatamente antes de cada experimento para preservar el ARN. Se emplearon micromanipuladores robóticos (Sensapex, Helsinki, Finlandia) para colocar las pipetas de parche adyacentes a las neuronas inspiratorias bajo control visual. Realizamos grabaciones de abrazadera de parche de células enteras utilizando un amplificador de abrazadera de parche EPC-10 (HEKA Instruments, Holliston, MA) con el software PATCHMASTER (RRID: SCR_000034).

Resumen esquemático del diseño experimental. (a) El flujo de trabajo de Patch-Seq. Las neuronas preBötC derivadas de Dbx1 rítmicamente activas se registran en la configuración de abrazadera de parche de célula completa (VM, seguimiento superior). El nervio craneal hipogloso (XII) representa la salida motora relacionada con la inspiración (trazo inferior). a_i – a_iv representan gráficamente los pasos en el flujo de trabajo de Patch-Seq como se detalla en Métodos. ( b ) Diagrama de flujo b_i – b_v que muestra el flujo de trabajo de bioinformática como se detalla en Métodos.

Definimos la latencia del impulso inspiratorio como el tiempo transcurrido entre el comienzo de la suma de los potenciales sinápticos excitatorios (EPSP), que despolarizan la neurona desde su potencial de membrana inactivo entre los estallidos inspiratorios, hasta el inicio del estallido inspiratorio. La latencia del impulso inspiratorio se utilizó, en parte, para determinar si una neurona era de tipo 1 o de tipo 2 (Fig. 1ai). Las neuronas preBötC de tipo 1 muestran una latencia de impulso inspiratorio superior a 300 ms, mientras que las neuronas preBötC de tipo 2 muestran una latencia de impulso inspiratorio del orden de 100 ms (comparar la Fig. 2a, izquierda y b, izquierda).

Perfiles electrofisiológicos de neuronas preBötC. (a) una neurona tipo 1 caracterizada por una latencia de impulso inspiratorio prolongada (izquierda), excitación retardada (centro) y falta de un potencial de "hundimiento" (derecha). (b) una neurona de tipo 2 caracterizada por una breve latencia del impulso inspiratorio (izquierda), sin excitación retardada (centro) y la presencia de un potencial de hundimiento (derecha).

Probamos la corriente de K+ de tipo A (IA), característica de las neuronas preBötC de tipo 1 mediante la aplicación de comandos escalonados de corriente despolarizante supraumbral de 500 ms de duración desde un potencial de retención de –70 mV. Las neuronas preBötC de tipo 1 que expresan IA exhibieron una excitación retardada de 120 a 220 ms, mientras que las neuronas preBötC de tipo 2 sin expresión de IA no muestran una excitación retardada en respuesta a comandos de paso de corriente despolarizante similares16,17,25 (compárese la Fig. 2a, medio vs. b, medio).

Probamos la corriente catiónica activada por hiperpolarización (Ih) mediante la aplicación de comandos de paso de corriente hiperpolarizante de 400 a 500 ms de duración, lo que provocó excursiones de voltaje iniciales que excedieron los -20 mV desde un potencial de retención de -50 mV. Las neuronas preBötC de tipo 2 que expresan Ih exhibieron una despolarización dependiente del tiempo y el voltaje, mientras que las neuronas preBötC de tipo 1 sin expresión de Ih no muestran potenciales de caída en respuesta a comandos de paso de corriente hiperpolarizante similares16,17,25 (compárese con la Fig. 2a , derecha vs. b, derecha).

La Figura 1a (abajo) muestra un esquema de nuestro flujo de trabajo para obtener contenido citoplásmico y crear una biblioteca de ADN complementario (ADNc) adecuada para la secuenciación de próxima generación. Después de categorizar las neuronas como Tipo-1 o Tipo-2 sobre la base de la latencia del impulso inspiratorio y la expresión, o ausencia de la misma, de IA e Ih; o clasificándolos como Desconocidos, extrajimos el contenido celular con una presión negativa de 0.7 a 1.5 psi (Fig. 1aii). La pipeta de parche se retrajo rápidamente y el contenido de la pipeta se expulsó rompiendo su punta en el fondo de un tubo de PCR libre de ARNasa que contenía 4 µL de agua libre de nucleasas con 2% de RRI. La muestra se centrifugó brevemente, se congeló inmediatamente sumergiéndola en nitrógeno líquido y luego se almacenó a –80 °C. Convertimos el ARN extraído en ADNc de acuerdo con el kit de ARN de entrada ultrabaja SMART-Seq v4 (Takara Bio USA) para el protocolo de secuenciación (Fig. 1aiii). La primera cadena de ADNc se sintetizó realizando una transcripción inversa en un termociclador (42 °C durante 90 min, 70 °C durante 10 min). Luego se amplificó el ADNc a 95 °C por 1 min, 17 ciclos de 98 °C por 10 s, 65 °C por 30 s, 68 °C por 3 min; 72 °C durante 10 min. El ADNc amplificado por PCR se purificó mediante inmovilización en perlas AMPure (Beckman Coulter, Brea, CA), que lavamos con etanol al 80 % antes de eluir el ADNc de las perlas. El cDNA amplificado se validó utilizando el bioanalizador Agilent 2100 y el kit de alta sensibilidad de Agilent (5067-4626, Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Las muestras que cruzaron un umbral de 20 unidades de fluorescencia en el rango de 1500 a 2000 pares de bases, con poco o ningún pico en la región de 100 a 500 pares de bases (p. ej., Fig. 1aiii) luego se cuantificaron con el kit de ensayo de alta sensibilidad Qubit dsDNA (Molecular Probes, Eugene, OR). Las muestras con una concentración de ADNc superior a 150 pg/µl se conservaron para la secuenciación de próxima generación26. Procesamos ADNc de longitud completa con los kits de preparación de bibliotecas Nextera (FC-131-1024, Illumina, San Diego, CA) para obtener bibliotecas de ADNc para la secuenciación de próxima generación con Illumina HiSeq. Sistema de secuenciación 4000 con lecturas de extremos emparejados (150 pb) (Fig. 1aiv). Los investigadores desconocían el tipo de célula durante la construcción y secuenciación de la biblioteca.

La Figura 1b muestra el esquema de nuestro flujo de trabajo de bioinformática. Primero, la calidad de las lecturas se verificó utilizando FastQC v0.11.8 (Fig. 1bi). Las lecturas del adaptador (Lectura 1: TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG, Lectura 2: GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG) se recortaron con bbduk v38.00 con el siguiente comando (Fig. 1bii):

sh bbduk.sh in1 = inputFASTQFile1.fastq. in2 = inputFASTQFile2.fastq out1 = outputFASTQFile1.fastq out2 = outputFASTQFile2.fastq ktrim = r -Xmx27g mm = fk = 33 hdist = 1 literal = TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG,GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAG tbo tpe

Usamos el genoma de referencia del ratón mm10 de Ensembl (del Instituto Europeo de Bioinformática de la familia del Laboratorio Europeo de Biología Molecular) para crear un directorio del genoma para alinear las lecturas en STAR27 v2.7.7a usando los siguientes comandos:

STAR --runMode genomaGenerate --genomeDir mm10ReferenceGenome --genomeFastaFiles Mus_musculus.GRCm38.dna.primary_assembly.fa --sjdbGTFfile Mus_musculus.GRCm38.102.gtf --sjdbOverhang 149 -- genomaSAparseD 2

Luego, las secuencias se alinearon con el genoma de referencia mm10 mediante STAR v2.7.7a27 usando el siguiente comando (Fig. 1biii):

STAR --genomeDir mm10ReferenceGenome --readFilesIn inputFASTQFile1.fastq inputFASTQFile2.fastq --outFileNamePrefix outputBAMFile --outSAMtype BAM SortedByCoordinate --outReadsUnmapped Fastx

Usamos featureCounts v2.4.2 para cuantificar el recuento de fragmentos de los genes detectados (Fig. 1biv). Además, desarrollamos scripts personalizados (consulte Disponibilidad de código, a continuación) en el entorno de computación estadística "R" para generar archivos de texto que contienen longitudes de genes, recuentos de fragmentos y FPKM, que están disponibles en NCBI GEO (Fig. 1bv).

Los datos sin procesar que consisten en secuencias de nucleótidos (archivos FASTQ) junto con los recuentos de fragmentos sin procesar de los datos procesados ​​después de la alineación con mm10 (GSE175643_fragmentCounts.txt.gz), los valores FPKM de los genes representados en los fragmentos (GSE175643_fpkm.txt.gz) , y las longitudes de los genes de mm10 (GSE175643_geneLength.txt.gz) están disponibles públicamente en la base de datos NCBI GEO (GEO:GSE175643)28.

El archivo depositado en Figshare denominado "Propiedades electrofisiológicas de las neuronas del complejo preBötzinger inspiratorio en ratones neonatales (GEO:GSE175643)" presenta el perfil electrofisiológico de cada muestra de neurona preBötC en el conjunto de datos29. El archivo depositado en Figshare llamado "Estadísticas de mapeo de secuencias de nucleótidos para neuronas del complejo preBötzinger inspiratorio en ratones neonatales (GEO:GSE175643)" proporciona un conjunto de estadísticas de STAR con respecto al número de lecturas y sus longitudes, asignadas al genoma de referencia mm1029.

Verificamos el tamaño promedio y la abundancia de cDNA utilizando un kit de alta sensibilidad Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) y un kit de ensayo de alta sensibilidad Qubit dsDNA (Molecular Probes). Los datos sin procesar de las secuencias de nucleótidos junto con sus puntuaciones de calidad correspondientes (formato FASTQ) están disponibles públicamente en la base de datos NCBI GEO (GEO:GSE175643).

Con respecto a las puntuaciones de calidad, los 20 informes de FastQC (dos lecturas emparejadas de 10 neuronas preBötC de muestra) mostraron puntuaciones de calidad por secuencia con un promedio de 38–40. Ninguna de las secuencias se marcó como de mala calidad.

Los datos del transcriptoma descritos aquí se recopilaron utilizando técnicas idénticas a los datos analizados en Kallurkar et al. Sci Rep, 12:2923, 2022, que constaba de 17 neuronas preBötC Dbx1 (siete Tipo-1, nueve Tipo-2 y una Desconocida)25. De ahora en adelante, nos referiremos a esos datos como "Kallurkar 2022". Sin embargo, los datos actuales se recopilaron y enviaron para su secuenciación aproximadamente 1,5 años antes, por lo que deseamos probar un efecto de lote que podría causar una variación entre estos dos conjuntos de datos. Para detectar la disparidad del efecto por lotes, creamos diagramas de caja30 para cada muestra que resumen la expresión logarítmica de 8916 genes con expresión distinta de cero en más de dos tercios de las muestras de Kallurkar 2022 y el conjunto de datos actual (es decir, 19 de 27 en total). muestras). Esos 8916 genes representan el 16 % de los 55 367 genes del genoma de referencia mm10. La Figura 3 muestra que el log10 medio (FPKM) oscila en aproximadamente 1,0 en Kallurkar 2022 (diagramas de caja grises, muestras 1 a 9 y 11 a 18) y los datos actuales (diagramas de caja negros, muestras 1 a 10). La longitud de los diagramas de caja, que abarcan los cuartiles inferior y superior, suelen ser de una década (es decir, un factor de 10 en FPKM), pero algunas llegan a tres décadas (un factor de 1000 en FPKM). Sin embargo, las muestras 1 a 4 en el presente conjunto de datos muestran una mediana de log10 (FPKM) <0,5 y una longitud de caja de tres décadas. Esas estadísticas indican que las muestras 1 a 4 muestran niveles de expresión más bajos, para una fracción de los genes detectados, y una mayor variabilidad en comparación con Kallurkar 2022 y las muestras 5 a 10. Para explorar aún más los niveles de expresión y la variabilidad, trazamos la mediana de log10 (FPKM) frente a la desviación absoluta mediana (MAD) de log10 (FPKM) (Fig. 4). Las muestras 1 a 4 (círculos rellenos con números) se colocan en la parte superior izquierda en comparación con las muestras 5 a 10 (círculos rellenos) y Kallurkar 2022 (círculos abiertos), lo que nuevamente es consistente con una menor expresión génica y una mayor variabilidad. Finalmente, examinamos un histograma de log10 (FPKM) para Kallurkar 2022 y los datos actuales (Fig. 5). Kallurkar 2022 (línea gris) se superpone bien con las muestras 5 a 10 (línea negra continua) y el pico más alto de las muestras 1 a 4 en el conjunto de datos actual (línea negra discontinua). Sin embargo, las muestras 1–4 exhiben otro pico en la distribución en log10(FPKM) cerca de –2, lo que indica un conjunto de genes de baja expresión responsables de la mayor variabilidad de las muestras 1–4. En particular, las muestras 1–4 exhibieron la concentración más baja de cDNA según la cuantificación Qubit, aunque las cuatro pasaron el criterio de 150 pg/µL26. Las muestras 1 a 4 tienen una mediana de log10 (FPKM) que es un factor de 10 más bajo que las muestras 5 a 10 y Kallurkar 2022 (Fig. 5, líneas verticales).

Gráficos de cajas que muestran los niveles de expresión de los 8916 genes expresados ​​en 19 transcriptomas de neuronas preBötC de Kallurkar et al., 2022 (ref. 25) o las 10 muestras del presente informe. Los conjuntos de datos de Kallurkar 2022 son las muestras 1 a 9 y 11 a 18 (diagramas de caja gris). Los conjuntos de datos actuales son las muestras 1 a 10 (diagramas de caja negra). La mediana log10(FPKM) se indica mediante un punto de diana en el centro del diagrama de caja, que muestra los cuartiles superior e inferior. Los puntos indican los niveles de expresión génica fuera del rango intercuartílico.

Una gráfica de la desviación absoluta mediana (MAD) de log10 (FPKM) frente a la mediana de log10 (FPKM) de los 8916 genes que se expresaron en al menos 19 transcriptomas de neuronas preBötC de Kallurkar et al., 2022 (ref. 25) ( círculos abiertos) o las 10 muestras del presente informe (círculos cerrados). Las muestras 1–4 con MAD alta y expresión mediana baja se indican además con números correspondientes al nombre de la muestra.

Histograma que muestra la probabilidad del nivel de expresión génica para los 8916 genes expresados ​​en al menos 19 transcriptomas de neuronas preBötC de Kallurkar et al., 2022 (ref. 25) (línea continua gris) o las 10 muestras en el presente informe (línea negra discontinua para las muestras 1–4 y línea negra sólida para las muestras 5–10). Las alturas del primer contenedor (0,13, 0,05 y 0,09) corresponden a la fracción de genes mm10 no expresados ​​en Kallurkar 2022 y conjuntos de datos actuales.

Además, comparamos los datos actuales con Kallurkar 2022 mediante estadísticas de mapeo. La fracción de ceros (es decir, la fracción de genes en mm10 que no se detectaron) fue de 0,775 en los datos actuales y de 0,762 en Kallurkar 2022. El archivo depositado en Figshare se llama "Estadísticas de mapeo de secuencias de nucleótidos para neuronas del complejo preBötzinger inspiratorio en ratones neonatales ( GEO:GSE175643)" enumera las estadísticas de mapeo en detalle para las secuencias de nucleótidos mapeadas de forma única, multimapeada o no mapeada en el genoma de referencia del ratón mm1030. Las estadísticas de mapeo para Kallurkar 2022 están asociadas con la ref. 25. En resumen, 0,85 ± 0,04 representa la fracción de secuencias del presente conjunto de datos mapeados únicamente a mm10, 0,05 ± 0,02 representa la fracción multimapeada y 0,10 ± 0,03 representa la fracción no mapeada. En Kallurkar 2022, 0,56 ± 0,14 representa la fracción de secuencias asignadas de forma única a mm10, 0,04 ± 0,01 representa la fracción multiasignada y 0,16 ± 0,07 representa la fracción no asignada.

Además, observamos que los informes de calidad de Kallurkar 2022 y los datos actuales arrojan puntajes similares para la "calidad de secuenciación por base", que fue de 35 o más y ninguna secuencia se marcó como de mala calidad.

En general, los diagramas de caja de expresión logarítmica y los análisis de seguimiento descartan una variación técnica importante entre Kallurkar 2022 y los conjuntos de datos actuales, con la advertencia de que una parte de los genes detectados en las muestras 1 a 4 mostraron una expresión general más baja y una mayor variabilidad en comparación con muestras 5–10 y todas las muestras en Kallurkar 2022. Sin embargo, la fracción relativamente alta de secuencias mapeadas de forma única y la fracción baja de secuencias no mapeadas enfatizan la calidad del conjunto de datos actual.

Volviendo a nuestra consideración del presente conjunto de datos, se registraron seis neuronas preBötC inspiratorias en ratones CD-1. Solo pudimos diferenciar una neurona tipo 1 en cortes de ratón CD-1; los otros cinco eran de tipo Desconocido. Estamos relativamente seguros de que la neurona tipo 1 era excitatoria y ritmogénica sobre la base de las propiedades de su membrana. Sin embargo, no podemos confiar en el tipo de transmisor o la función relacionada con la respiración de las cinco neuronas desconocidas de ratones de tipo salvaje CD-1.

De las cuatro neuronas Dbx1 preBötC, detectamos tres Tipo-1 pero solo una Tipo-2. Sería difícil sacar conclusiones sobre la expresión diferencial entre las neuronas preBötC Dbx1 de tipo 1 y tipo 2 sobre la base de un único transcriptoma de tipo 2. Dados los efectos de lote mínimos (ver arriba), uno podría analizar el transcriptoma Tipo-2 aquí con los transcriptomas previamente diseminados en el informe de Kallurkar et al.25.

En las Figs. 6 y 7, destacamos los niveles de expresión de genes que son de interés común para los fisiólogos respiratorios. Las barras están codificadas por colores para indicar Tipo 1 (magenta), Tipo 2 (naranja) y Desconocido (verde). La altura de las barras corresponde al nivel de expresión log2(FPKM) de cada gen. Las barras moradas muestran la media y la desviación estándar de toda la muestra. La figura 6 incluye receptores sinápticos ionotrópicos y metabotrópicos, neuropéptidos, receptores de neuropéptidos, canales de potencial receptor transitorio (es decir, Trp) y reelina (rln). La figura 7 presenta canales iónicos dependientes de voltaje, subunidades reguladoras y receptores intracelulares.

Niveles de expresión génica para receptores sinápticos ionotrópicos y metabotrópicos, neuropéptidos, receptores de neuropéptidos, canales de potencial receptor transitorio (es decir, Trp) y reelina (rln). La primera barra (púrpura) representa el nivel general de expresión génica para todas las muestras (N = 10). Las barras a la derecha están agrupadas por tipo de neurona, en el orden en que aparecen en la base de datos GEO del NCBI (#GSE175643): Las muestras 1–6 son de ratones CD-1; las muestras 7–10 son de ratones Dbx1;Ai148. Las neuronas tipo 1 (rosa) corresponden a las muestras 4–7; la neurona tipo 2 (naranja) corresponde a la muestra 1; y Las neuronas desconocidas (verde) corresponden a las muestras 2, 3, 8–10. La altura de la barra representa el valor log2 (FPKM medio); las barras de error muestran la desviación estándar en todas las muestras (solo barras moradas).

Expresión génica de canales iónicos dependientes de voltaje, subunidades reguladoras y receptores intracelulares. La primera barra (púrpura) representa el nivel general de expresión génica para todas las muestras (N = 10). Las barras a la derecha están agrupadas por tipo de neurona, en el orden de su listado en la base de datos NCBI GEO (#GSE175643): Las muestras 1–6 son de ratones CD-1; las muestras 7–10 son de ratones Dbx1;Ai148. Las neuronas tipo 1 (rosa) corresponden a las muestras 4–7; la neurona tipo 2 (naranja) corresponde a la muestra 1; y Las neuronas desconocidas (verde) corresponden a las muestras 2, 3, 8–10. La altura de la barra representa el valor log2 (FPKM medio); las barras de error muestran la desviación estándar en todas las muestras (solo barras moradas).

Las neuronas cuyos transcriptomas presentamos aquí son la misma población de neuronas derivadas y no derivadas de Dbx1 descritas por Hayes y colegas31. Sin embargo, en ese estudio las neuronas preBötC no se registraron intracelularmente. Se podrían comparar los transcriptomas de neuronas preBötC actuales con los de Hayes et al. teniendo en cuenta que los fenotipos fisiológicos de estas últimas neuronas no fueron identificados31.

Los scripts R personalizados escritos para procesar los recuentos de fragmentos sin procesar están disponibles gratuitamente (https://github.com/prajkta9/bioinformatics-scRNA-seq).

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Departamento de Ciencias Aplicadas, William & Mary, 540 Landrum Drive, Williamsburg, Virginia, 23185, EE. UU.

Caroline K. David, Prajkta S. Kallurkar, María Cristina D. Picardo, Gregory D. Conradi Smith y Christopher A. Del Negro

Departamento de Neurociencia, Facultad de Medicina de la Universidad Jikei, 3-25-8 Nishi-shimbashi, Minato, Tokio, 105-8461, Japón

Yae K Sugimura

Departamento de Biología, William & Mary, 540 Landrum Drive, Williamsburg, Virginia, 23185, EE. UU.

Margarita S. Saha

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Caroline K. David seleccionó los datos, diseñó y creó algunas de las figuras y escribió partes del manuscrito con CADN. Yae K. Sugimura ayudó a concebir el estudio, registró las neuronas preBötC en modo patch-clamp de células enteras, caracterizó las neuronas, luego recolectó su contenido citoplasmático para amplificación y secuenciación, y ayudó a editar el manuscrito. Prajkta S. Kallurkar ayudó a concebir el estudio, ayudó a registrar las neuronas preBötC en modo patch-clamp de células enteras, recolectó su contenido citoplasmático para amplificación y secuenciación, realizó bioinformática como la alineación de secuencias a mm10 y también ayudó a analizar los datos. como escribir y editar el manuscrito. Maria Cristina D. Picardo ayudó a concebir el estudio, preparó la biblioteca de ADNc a partir de las muestras, envió la biblioteca de ADNc para secuenciación, seleccionó los datos y ayudó en la bioinformática, y ayudó a escribir y editar el manuscrito. Margaret S. Saha ayudó a concebir el estudio, diseñar y ajustar los protocolos experimentales, evaluó la calidad de los datos, ayudó a analizar los efectos por lotes y ayudó a escribir y editar el manuscrito. Gregory D. Conradi Smith ayudó a diseñar y afinar los protocolos bioinformáticos, evaluó la calidad de los datos alineados con el genoma, ayudó a analizar los efectos por lotes, hizo algunas de las figuras y escribió y editó partes del manuscrito. Christopher A. Del Negro ayudó a concebir el estudio, dirigió los esfuerzos experimentales y de bioinformática, hizo algunas de las figuras y escribió el manuscrito con CKD.

Correspondencia a Christopher A. Del Negro.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

David, CK, Sugimura, YK, Kallurkar, PS et al. Secuenciación del transcriptoma de una sola célula de las neuronas inspiratorias del complejo preBötzinger en ratones neonatales. Datos científicos 9, 457 (2022). https://doi.org/10.1038/s41597-022-01569-y

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Recibido: 10 de marzo de 2022

Aceptado: 19 julio 2022

Publicado: 30 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41597-022-01569-y

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