PIEZO1 transduce picor mecánico en ratones

Nature, volumen 607, páginas 104–110 (2022)Citar este artículo

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El picor desencadena el rascado, un mecanismo de defensa conductual que ayuda a eliminar irritantes y parásitos dañinos1. El picor químico se desencadena por muchas señales endógenas y exógenas, como la histamina proinflamatoria, que se libera durante una reacción alérgica1. La picazón mecánica puede desencadenarse por sensaciones ligeras como fibras de lana o un insecto que se arrastra2. A diferencia de las vías químicas del picor, que se han estudiado ampliamente, los mecanismos que subyacen a la transducción del picor mecánico son en gran parte desconocidos. Aquí mostramos que el canal iónico activado mecánicamente PIEZO1 (ref. 3) se expresa selectivamente por neuronas sensoriales específicas de picazón y es necesario para sus corrientes activadas mecánicamente. La pérdida de la función PIEZO1 en las neuronas periféricas reduce en gran medida los comportamientos de rascado evocados mecánicamente y la sensibilización provocada por picazón tanto aguda como crónica. Finalmente, los ratones que expresan un alelo 4 Piezo1 de ganancia de función exhiben comportamientos mecánicos de picazón mejorados. Nuestros estudios revelan la naturaleza polimodal de las neuronas sensoriales del picor e identifican un papel para PIEZO1 en la sensación de picor.

Subconjuntos discretos de neuronas somatosensoriales dentro del ganglio de la raíz dorsal (DRG) y el ganglio del trigémino impulsan selectivamente los comportamientos de picazón en ratones5,6. Se cree que estos pruriceptores son quimiosensoriales más que mecanosensoriales y, como tales, están implicados selectivamente en el prurito químico1. Los pruriceptores químicos están marcados por la expresión de los genes del neuropéptido somatostatina (Sst) y el precursor del polipéptido natriurético B (Nppb), o el receptor A3 acoplado a proteína G relacionado con MAS (Mrgpra3), junto con otros genes marcadores identificados a partir del ARN de una sola célula. estudios de secuenciación (RNA-seq)7,8,9. Trabajos previos dilucidaron vías de transducción de picor químico en estas neuronas5,10,11,12,13. Por el contrario, la base molecular y celular del prurito mecánico en la periferia es relativamente desconocida, aunque su circuito está bien descrito en la médula espinal. Por ejemplo, el prurito mecánico puede desencadenarse por la activación de los mecanorreceptores de umbral bajo (LTMR) Aβ positivos para el receptor tipo Toll 5 y la participación de las vías espinales excitatorias positivas para el receptor 1 del neuropéptido Y y la urocortina 3, y/o por la inhibición de las interneuronas inhibitorias positivas del neuropéptido Y espinal que reciben entrada LTMR14,15,16. Además, la pérdida dependiente de la edad de los complejos de células de Merkel-neurita aumenta el picor mecánico, presumiblemente a través de la pérdida de la inhibición dependiente de LTMR del circuito espinal del picor17. Se desconocen las contribuciones de otras neuronas somatosensoriales, incluidos los pruriceptores químicos, al picor mecánico y la sensibilización al picor.

Los primeros trabajos sobre la expresión de los genes Piezo demostraron inequívocamente que la transcripción de Piezo2 está presente en altos niveles en las neuronas somatosensoriales y sugirió que Piezo1 se expresaba solo en niveles de fondo3,18. En respuesta a la publicación de varios conjuntos de datos de RNA-seq de una sola célula que informan una expresión baja pero detectable de la transcripción Piezo1 en neuronas DRG de ratón7,8,19 (Datos extendidos Fig. 1), revisamos nuestros experimentos anteriores usando fluorescencia de una sola molécula in situ hibridación (smFISH) para caracterizar más a fondo la expresión de Piezo1 en las neuronas sensoriales. En particular, observamos que Piezo1 se expresa en el 92 % de las neuronas Nppb+ DRG (Fig. 1a–f y Extended Data Fig. 2a–d), y en células no neuronales que probablemente constituyan endotelio vascular20. Este patrón de expresión específico sugirió que PIEZO1 tiene un papel en la picazón. También observamos la expresión de Piezo1 en un subconjunto de neuronas del receptor D acoplado a proteína G (Mrgprd+) relacionadas con MAS (Datos extendidos Fig. 2a), que previamente se han implicado en el dolor mecánico y en la picazón química provocada por el compuesto β- alanina21,22; sin embargo, no observamos Piezo1 en las neuronas de picor químicas sensibles a la cloroquina Mrgpra3 + (Fig. 1d-f y Datos extendidos Fig. 3a). Por el contrario, Piezo2 se expresó en un porcentaje menor de neuronas Nppb+ (Fig. 1d-f y Datos extendidos Fig. 3b). Se han identificado diferencias sustanciales entre las neuronas DRG humanas y de ratón23,24 y se desconoce el papel, si es que lo hay, de la NPPB en la transmisión del picor humano. smFISH de secciones de un DRG humano reveló la transcripción PIEZO1 en el 83,6 % de las neuronas NPPB+ (Fig. 1h y Datos extendidos Fig. 4a,b), lo que sugiere un patrón de expresión conservado. Usando una línea de ratón que expresa una proteína de fusión PIEZO1tdTomatoC-terminal25, observamos una expresión robusta de PIEZO1tdTomato en células endoteliales vasculares de molécula de adhesión de células endoteliales de plaquetas 1 (PECAM1+) del GRD y capilares del ganglio trigémino (como se esperaba)20, así como dentro de un subconjunto de cuerpos celulares neuronales y fibras nerviosas, consistente con la expresión de la proteína PIEZO1 en neuronas somatosensoriales de ratón (Fig. 1i-l y Datos extendidos Fig. 5a-c).

a–c, Imágenes representativas (cinco imágenes de dos ratones) de DRG smFISH de ratón seccionadas para Piezo1 (a), Nppb (b) y fusionadas con DAPI (c). Las puntas de flecha blancas indican celdas Piezo1+ o Nppb+. d, Cuantificación de imágenes smFISH de DRG de ratón que muestran el porcentaje de células que expresan un marcador dado (etiquetas de barra) que se comarcaron con la transcripción de Piezo1. El número de neuronas analizadas se indica encima de la barra (cuatro a seis imágenes por marcador de dos ratones). e, Datos de d presentados como el porcentaje de neuronas Piezo1+ que coexpresan un marcador dado. f, Porcentaje de neuronas Nppb+ que expresan Piezo1 o Piezo2. g, Comparación de la expresión de Piezo2 en neuronas Nppb+ frente a Mrgpra3+. h, Cuantificación de imágenes smFISH humanas (de siete a ocho imágenes por marcador de un donante; consulte Datos extendidos Fig. 4a,b). i–l, imágenes representativas de DRG de ratón seccionados etiquetados con anticuerpos contra tdTomato (las imágenes muestran PIEZO1 (i), PECAM1 (j), neurofilamento H (NEFH; k) y la imagen fusionada (l)). Los asteriscos indican vasos sanguíneos y las puntas de flecha indican una neurona PIEZO1+ y una fibra nerviosa. El experimento se repitió una vez más. Todas las imágenes se presentan como proyecciones z de máxima intensidad de imágenes confocales. Barras de escala, 100 µm.

A continuación, buscamos establecer si PIEZO1 es funcional en las neuronas somatosensoriales. A diferencia de PIEZO2, que hasta la fecha no tiene activadores químicos conocidos, PIEZO1 puede activarse in vitro e in vivo utilizando la molécula pequeña Yoda1, que sensibiliza las corrientes de PIEZO1 provocadas por estímulos mecánicos y desencadena la entrada de calcio por sí sola26. Para evaluar los efectos de Yoda1 en la fisiología de las neuronas sensoriales, recurrimos a imágenes de calcio radiométricas en neuronas DRG de ratón cultivadas disociadas. Observamos que Yoda1 desencadenó transitorios de calcio en aproximadamente el 20% de las neuronas DRG cultivadas (Fig. 2a) y la mayoría de estas células respondieron a los compuestos de picazón β-alanina (un agonista de MRGPRD) y/o histamina, que activa un amplio subconjunto de Neuronas somatosensoriales TRPV1+27, incluidas las neuronas Nppb+5,11 (Fig. 2b,c). Los transitorios de calcio dependientes de Yoda1 se perdieron en las neuronas de los ratones Piezo1fl/fl;Pirt-Cre+/−, que se dirige a la gran mayoría de las neuronas sensoriales periféricas28 (Fig. 2d). Por el contrario, probamos si las neuronas de ratones que expresan un alelo Piezo1 de ganancia de función (GOF) (PIEZO1GOF) equivalente a una mutación de xerocitosis hereditaria humana4 podrían exhibir respuestas Yoda1 mejoradas. Observamos aumentos modestos en el área bajo la curva y la amplitud máxima de los transitorios de calcio Yoda1 en las neuronas PIEZO1GOF DRG (Fig. 2e, f).

a, Porcentaje de neuronas de tipo salvaje que responden a los compuestos (2682 neuronas de 3 ratones). AITC, isotiocianato de alilo. b, los diagramas de Venn de superposición de respuesta de datos de tipo salvaje combinados en ayd, que indican el porcentaje de neuronas totales. c, Rastros de señales de calcio representativas de b. Las puntas de flecha indican la adición de compuestos. d, Porcentaje de neuronas que responden en neuronas Piezo1 fl/fl;Pirt Cre-/- (tipo salvaje; WT) frente a Piezo1 fl/fl;Pirt Cre+/- (KO) (1883 neuronas WT y 2218 KO de 2 ratones por genotipo) . e, Área bajo la curva de Piezo1+/+ versus Piezo1GOF/GOF respuestas a 20 µM Yoda1 (Mann-Whitney: ****P < 0.0001, U = 102,979; n = 347 +/+ y 711 neuronas GOF/GOF de 2 ratones por genotipo). f, relación F340/F380 normalizada máxima de ratones Piezo1+/+ frente a Piezo1GOF/GOF a partir de datos en e (Mann-Whitney: *P = 0,0142, U = 121 046; n = 347 +/+ y 768 neuronas GOF/GOF de 2 ratones ). En e,f, la línea central denota la mediana, los recuadros son los percentiles 25 y 75 y los bigotes indican 1,5 veces el rango intercuartílico. g, Sección representativa de inmunohistoquímica (IHC) (de tres secciones de dos ratones) de neuronas Ai9 fl/fl;SstCre+/− DRG que muestran tdTomato nativo (expresado en células SST+) con los marcadores indicados (barra de escala, 100 µm). h, neuronas DRG disociadas Ai9 fl/fl;SstCre+/−. i–k, Resumen de la cinética de inactivación de corriente activada mecánicamente (MA) en experimentos de empuje de células completas después de la nucleofección de neuronas Ai9 fl/fl;SstCre+/− DRG con la mezcla de siRNA indicada contra siRNA de control no dirigido o contra Piezo1 (i; ****P < 0,0001, χ2 = 23,92, grados de libertad (df) = 3; n = 28 control y 32 células siRNA Piezo1), Piezo2 (j; *P = 0,0130, χ2 = 10,78, df = 3; n = 32 control y 31 células de siRNA Piezo2) y Piezo1 + Piezo2 (k; ****P < 0,0001, χ2 = 36,21, gl = 3; n = 30 control y 33 células de siRNA Piezo1 + Piezo2). Se realizaron pruebas de chi-cuadrado (χ2). IA, de adaptación intermedia; NR, sin respuesta; RA, de rápida adaptación; SA, adaptándose lentamente. l – n, rastros de sangría representativos de 150 ms (arriba) y corrientes MA (abajo) de i – j con nucleofección del siRNA indicado (de dos ratones cada uno). Todas las pruebas estadísticas son de dos colas cuando corresponda. n indica réplicas biológicas (células).

Datos fuente

Luego investigamos si las neuronas somatosensoriales que expresan PIEZO1 son inherentemente mecanosensibles. Aunque generalmente se cree que los pruriceptores químicos son mecánicamente insensibles, algunos estudios sugieren que pueden mostrar mecanosensibilidad bajo ciertas condiciones29. Como Piezo1 se expresa solo en un subconjunto de neuronas sensoriales Mrgprd+, razonamos que podría pasarse por alto un fenotipo impulsado por la perturbación de la expresión de Piezo1 en estas células. Por el contrario, Piezo1 se expresó en la gran mayoría de las neuronas Nppb+, y estas células son susceptibles de selección genética con somatostatinaCre (SstCre; Fig. 2g), ya que Sst se expresa en prácticamente todas las neuronas Nppb+ de ratón5,19. Validamos la expresión de Piezo1 dentro de las células Ai9 fl/fl;Sst Cre+/− tdTomato+ mediante RNAscope y descubrimos que el 73,9 % de las células tdTomato+ coexpresaban Piezo1 (datos extendidos, Fig. 6a). Realizamos electrofisiología de células completas para examinar las corrientes activadas mecánicamente en neuronas DRG cultivadas tdTomato + de ratones Ai9 fl / fl; Sst Cre +/− (Fig. 2h). Para perturbar la función de los canales activados mecánicamente, nucleofectamos pequeños ARN de interferencia (siRNA) agrupados contra Piezo1 y/o Piezo2 o siRNA de control no dirigido3,18,30. En todos los experimentos, co-nucleofectamos un plásmido para impulsar la expresión citosólica de la proteína verde fluorescente (GFP) y lo registramos a partir de células GFP+tdTomato+. En 45 de 74 células mecanosensibles nucleofectadas con el siRNA no dirigido (n = 90 grabaciones), observamos corrientes de adaptación intermedias (10 ms < τ inactivación (la constante de tiempo de la inactivación actual) < 30 ms) en respuesta a la sangría controlada con un sonda de vidrio romo, con 24 de 74 células mecanosensibles que exhiben corrientes de adaptación rápida (τinactivación ≤ 10 ms; Figs. 2i–k, n y datos extendidos Fig. 6b–d). Con la nucleofección de ARNip de Piezo1, las corrientes de adaptación intermedia se perdieron en gran medida y se retuvieron las corrientes de adaptación rápida (Fig. 2i, l, ny Datos extendidos Fig. 6c). Esto es consistente con los datos publicados que muestran que las corrientes dependientes de PIEZO1 tienen una inactivación τ mayor que las corrientes dependientes de PIEZO2 en sistemas de expresión endógenos y heterólogos3,31. Por el contrario, después de la nucleofección del siRNA Piezo2, las respuestas de adaptación rápida se perdieron y las respuestas de adaptación intermedia permanecieron (Fig. 2j, m, n y Datos extendidos Fig. 6b-d). Esto es consistente con el papel de PIEZO2 en la mediación de casi todas las corrientes de adaptación rápida en las neuronas DRG18. Es de destacar que se observaron algunas corrientes de adaptación lenta (τinactivación ≥ 30 ms) después de la caída de Piezo2, lo que sugiere el desenmascaramiento de las respuestas de adaptación lenta después de la pérdida del canal de adaptación rápida, ya que las corrientes de adaptación lenta se observaron con poca frecuencia en las células de control. Con la eliminación simultánea de Piezo1 y Piezo2, 32 de 33 células no respondieron a los estímulos mecánicos (Fig. 2k). Por lo tanto, PIEZO1 es el mediador predominante de las corrientes activadas mecánicamente en las neuronas SST+ DRG, mientras que PIEZO2 contribuye a la rápida adaptación de las corrientes.

La hipersensibilidad al prurito mecánico (aloknesis) surge tras la inyección de histamina en la piel de ratones y humanos32,33. Las neuronas del DRG que responden a la histamina se componen principalmente de receptores de picor TRPV1+ dedicados, incluidas las neuronas Nppb+ y las neuronas Mrgpra3+11. Investigamos si la histamina podría sensibilizar directamente las corrientes activadas mecánicamente dependientes de PIEZO126 en las neuronas Ai9fl/fl;SstCre+/− DRG. Una exposición de cinco minutos a 100 µM de histamina provocó un pequeño aumento en la τinactivación de presuntas corrientes activadas mecánicamente dependientes de PIEZO1 que también fueron sensibilizadas por Yoda1 10 µM (datos extendidos Fig. 6e, f, i). Ni Yoda1 ni la histamina alteraron significativamente la corriente máxima, Imax (Datos extendidos Fig. 6g, h). La incubación en una concentración por debajo del umbral de histamina34 (1 µM), que es insuficiente para impulsar la entrada de calcio, mejoró de manera similar la entrada de calcio dependiente de Yoda1 en las neuronas tdTomato+ DRG (Datos extendidos Fig. 6j–l). Además de los efectos directos sobre las corrientes mecánicamente activadas dependientes de PIEZO1, la histamina y otros pruritogénicos pueden provocar la sensibilización del picor a través de mecanismos celulares autónomos o no autónomos, este último análogo a la sensibilización del circuito LTMR que se observa en la alodinia35. Estos hallazgos sugieren un papel potencial para la mecanotransducción dependiente de PIEZO1 en la aloknesis.

Con el fin de determinar el papel del PIEZO1 neuronal sensorial en la picazón mecánica y la aloknesis, eliminamos el PIEZO1 de las neuronas sensoriales periféricas usando el controlador PirtCre en un ratón Piezo1flox (Piezo1 fl/fl;PirtCre+/−) (ref. 28) y probamos el resultado ratones en modelos de picor químico y mecánico agudo. Elegimos este controlador Cre neuronal pansensorial para eliminar PIEZO1 de todas las neuronas periféricas. En el modelo de nuca de picazón mecánica14,15,32 (Fig. 3a), observamos una profunda disminución en el rascado evocado mecánicamente en ratones knockout condicionales (KO), pero no en los controles heterocigotos o de tipo salvaje (Fig. 3b, c ). Además, aunque los ratones KO fueron capaces de rascarse en respuesta a la inyección de histamina en la nuca, los ratones KO no exhibieron aloknesis robusta a la estimulación con el filamento de von Frey de 0,04 g después del cese del rascado provocado por la histamina14,32 (Fig. 3d y Extended Datos Fig. 7a–d). Elegimos el filamento de 0,04 g para los ensayos de aloknesis porque no provocó un rascado sustancial en ratones de tipo salvaje ingenuos (Fig. 3b). Aunque los ratones KO se rascaron en respuesta a la inyección aguda de histamina, observamos una reducción pequeña pero significativa que fue más evidente en un número reducido de episodios de rascado por episodio de rascado36 (Datos extendidos Fig. 7b-d). Para investigar más a fondo este hallazgo, también probamos la capacidad de los ratones KO para rascarse en respuesta a la inyección de cloroquina, que activa los receptores de picor MRGPRA3+12 (que no expresan Piezo1) o la de interleucina-31 (IL-31), que activa las neuronas Nppb+ que coexpresan Il31ra (ref. 7). La picazón evocada por cloroquina (datos extendidos Fig. 7e, f) fue normal en ratones KO, mientras que la picazón y la aloknesis provocadas por IL-31 disminuyeron de manera similar a la histamina (datos extendidos Fig. 7g-j). Estos déficits menores en el prurito químico provocado por histamina e IL-31 (pero no por cloroquina) pueden reflejar un papel del prurito mecánico dependiente de PIEZO1 en la amplificación de los comportamientos de rascado que dependen de las neuronas Sst+Nppb+. Para relacionar nuestros hallazgos con estudios previos de picazón mecánica que también probaron las respuestas de rascado a la estimulación del oído14,15, también probamos el área afeitada detrás de las orejas de los ratones y observamos que los ratones KO tenían respuestas de picazón mecánica profundamente reducidas (Datos extendidos Fig. 7k) .

a, Ilustración del modelo de prurito mecánico en la nuca. b, modelo de picor mecánico en Piezo1fl/fl o Piezo1 fl/+;PirtCre−/− (WT; n = 11), Piezo1 fl/+;PirtCre+/− (heterocigoto (HET); n = 6) y Piezo1 fl/fl ;PirtCre+/− (KO; n = 8) ratones (ANOVA bidireccional: ****Pgenotipo < 0,0001, F(2, 22) = 17,88; Sidak's Padjusted: **P0,07g = 0,0017, ***P0 .16g = 0.0003, ***P0.4g = 0.0005). c, Porcentaje acumulativo de respuestas scratch de b (Kruskal-Wallis: ***P = 0,0007, χ2 = 14,52; Dunn's ***Padjusted = 0,0008). d, aloknesis de histamina (Kruskal-Wallis: ***P = 0,0003, χ2 = 16,43; Dunn: ***ajustado = 0,0001) de ratones en b. Los datos en b–d son de tres experimentos. e, modelo de picor mecánico en ratones Piezo1fl/fl;SstCre−/− (WT; n = 8) y Piezo1 fl/fl;Sst Cre+/− (KO; n = 10) (ANOVA bidireccional: ****Pgenotipo < 0,0001, F(1, 17) = 44,87, ajustado de Sidak: **P0,07g = 0,0086, ***P0,16g = 0,0002, **P0,4g = 0,0027). f, Porcentaje acumulativo de respuestas de scratch de e (Mann-Whitney: ****P < 0,0001, U = 0). g, aloknesis de histamina (Mann-Whitney: ****P < 0,0001, U = 0) de ratones en e. Los datos en e–g son de dos experimentos. h, Modelo de mejillas de picazón provocada por Yoda1 (Kruskal-Wallis: ****P < 0,0001, χ2 = 12,88; Dunn: **Ajustado = 0,0014; n = 4 ratones de 1 experimento). No se observó frotamiento. i, modelo de nuca de picazón provocada por Yoda1 (Mann-Whitney: *** P = 0.0003, U = 1; n = 8 ratones de 1 experimento). j, modelo de picazón en la nuca (50 µM Yoda1) en ratones Piezo1 fl/fl o Piezo1 fl/+;Pirt Cre−/− (WT) y Piezo1 fl/fl;PirtCre+/− (KO) (Mann–Whitney: ** *P = 0,0004, U = 0, n = 9 ratones WT y 6 KO de 2 experimentos). k, modelo de picor mecánico en ratones Piezo1+/+ (PIEZO1WT; n = 9) y Piezo1GOF/GOF o Piezo1GOF/+ (PIEZO1GOF; n = 17) (ANOVA bidireccional: ****Pgenotipo < 0,0001, F(1, 25) = 24,16; ajustado de Sidak: *P0,16g = 0,0493, *P0,4g = 0,0441, ***P0,6g = 0,0008). l, Porcentaje acumulativo de respuestas de scratch de k (Mann-Whitney: **P = 0,0013, U = 14). Las barras de error representan la media ± sem de n réplicas biológicas (ratones) y las pruebas estadísticas son de dos colas cuando corresponda. Los datos en k–l son de tres experimentos.

Datos fuente

Cuando examinamos otros comportamientos mecanosensoriales en los ratones KO, observamos un aumento pequeño pero significativo en el umbral de retiro de la pata medido con el ensayo de von Frey (Datos extendidos Fig. 7l-m); sin embargo, los comportamientos reflejos mecanonociceptivos a los estímulos punteados y contundentes eran normales (Datos extendidos Fig. 7n-q). Los comportamientos propioceptivos no se vieron afectados (Datos extendidos Fig. 7r), a diferencia de la pérdida sensorial específica de PIEZO2 (ref. 37). Postulamos que el pequeño efecto sobre el umbral mecánico podría deberse a un papel potencial de las neuronas Sst+Nppb+ y/o MRGPRD+ que expresan Piezo1 en la mecanosensibilidad inicial, una función sugerida previamente para estas subpoblaciones neuronales5,22. Presumimos que PIEZO1 actúa principalmente a través de la subpoblación Sst+Nppb+ de neuronas del picor para promover el picor mecánico y la sensibilización al picor, ya que Piezo1 se expresó más fuertemente dentro de esta subpoblación que dentro de las células Mrgprd+ (Fig. 1), mientras que la mayoría de las corrientes mecánicamente activadas en las células MRGPRD+ dependen de PIEZO2 (ref. 30). Con este fin, generamos ratones Piezo1fl/fl;SstCre+/− y observamos que fenocopiaron en gran medida los ratones Piezo1fl/fl;PirtCre+/− con respecto a la picazón mecánica y la aloknesis evocada por histamina (Fig. 3e-g). Por lo tanto, concluimos que PIEZO1 transduce el picor mecánico y la aloknesis principalmente a través de los receptores de picor dedicados Sst+Nppb+.

Posteriormente, investigamos si la activación de PIEZO1 puede desencadenar un picor agudo. Descubrimos que la inyección de Yoda1 indujo selectivamente comportamientos de rascado en el modelo de la mejilla, lo que permite discriminar entre el rascado de las extremidades traseras provocado por la picazón y el frotado de las patas delanteras provocado por el dolor38 (Fig. 3h), e indujo un rascado fuerte en el modelo de picazón de la nuca (Fig. 3h). .3i). No se observó alodinia mecánica después de la inyección intraplantar de Yoda1 (Datos ampliados, Fig. 8a). En particular, los ratones Piezo1fl/fl;PirtCre+/- no mostraron rascado en respuesta a Yoda1, lo que sugiere un mecanismo específico de neuronas sensoriales por el cual Yoda1 y PIEZO1 desencadenan selectivamente picazón y no dolor (Fig. 3j). Además, no observamos signos evidentes de inflamación 30 minutos después de la inyección de Yoda1 en la piel de la nuca (datos extendidos, Fig. 8b,c), lo que respalda nuestros estudios de inactivación que mostraron que Yoda1 provoca picazón aguda principalmente a través de las neuronas somatosensoriales en lugar de indirectamente. efectos sobre las células inmunitarias PIEZO1+ o los queratinocitos.

Para responder a la pregunta de si la actividad PIEZO1 mejorada modula el picor mecánico in vivo, aprovechamos un modelo de ratón con ganancia de función PIEZO1 existente4,39. Los ratones constitutivos PIEZO1GOF mostraron comportamientos de rascado evocados mecánicamente mejorados en respuesta a la estimulación de von Frey de la nuca afeitada en comparación con los controles (Fig. 3k-l). Además, los ratones PIEZO1GOF exhibieron un aumento de la aloknesis evocada por histamina (Datos extendidos Fig. 8f). También observamos un ligero aumento en la picazón evocada por histamina en ratones PIEZO1GOF (datos extendidos Fig. 8d, e), lo que implica aumentos generales en el rascado provocado por picazón en esta línea de ratones, y consistente con el efecto opuesto que se observó en Piezo1fl/fl ;Ratones PirtCre+/-. Además, los ratones PIEZO1GOF exhibieron un mayor rascado evocado por picazón después de la inyección de Yoda1 (datos extendidos Fig. 8g) y, a diferencia de los controles de compañeros de camada de tipo salvaje, desarrollaron aloknesis después de la inyección de Yoda1 (datos extendidos Fig. 8h). Especulamos que el fenotipo de aloknesis podría deberse a una mayor activación de los receptores de picor GOF por parte de Yoda1, que se administra a una dosis limitada por la solubilidad de la molécula26. De acuerdo con el aumento menor en el umbral mecánico de la pata trasera en los ratones PIEZO1KO, no observamos evidencia de alodinia constitutiva (Datos extendidos, Fig. 8i) y solo una ligera disminución en el umbral de abstinencia del 50 % de los ratones PIEZO1GOF (Datos extendidos, Fig. 8j) . No hubo mejora de los reflejos mecanonociceptivos agudos a estímulos punteados o contundentes (Datos ampliados Fig. 8k-m). Estos resultados demuestran que la actividad mejorada de PIEZO1 exacerba selectivamente el prurito mecánico y la aloknesis in vivo.

Nos preguntamos si la picazón mecánica dependiente de PIEZO1 es relevante para la picazón crónica, un problema de salud mundial con una prevalencia de por vida superior al 10 % en humanos40. Probamos la relevancia de la picazón mecánica dependiente de PIEZO1 en un modelo de ratón ampliamente utilizado de picazón crónica que se ha demostrado que imita aspectos específicos de la dermatitis atópica humana, el trastorno de picazón crónica más común41. La aplicación diaria del análogo de vitamina D MC903 (calcipotriol) induce eritema profundo, xerosis, excoriación, rascado provocado por picazón e hipersensibilidad a la picazón en la nuca, la oreja o la mejilla del ratón42. Observamos el desarrollo de lesiones maduras en ratones de tipo salvaje y Piezo1fl/fl;PirtCre+/− que fueron tratados con MC903, lo que sugiere que la inflamación de la piel se desarrolla normalmente en ausencia de PIEZO1 neuronal (Fig. 4a). Es de destacar que los ratones knockout mostraron déficits significativos en la hipersensibilidad mecánica al picor (Fig. 4b), con comportamientos de rascado espontáneo leve pero significativamente disminuidos en comparación con los compañeros de camada de control tratados con MC903 (Fig. 4c), que se explicaron en gran medida por un número reducido de episodios de rascado por episodio (Datos ampliados Fig. 9a). Esto sugiere que los mecanismos parcialmente independientes subyacen a la hipersensibilidad al picor frente al rascado espontáneo en el contexto del picor crónico, y se alinea con trabajos previos que muestran que diversos pruritógenos químicos endógenos que se liberan de las células inmunitarias y de la piel contribuyen al picor en este modelo42.

a, Imágenes representativas (n = 12 WT y n = 9 ratones KO de dos experimentos) de la piel de la nuca de Piezo1 fl/fl;PirtCre+/− (KO; arriba) y Piezo1 fl/fl;PirtCre−/− (WT; abajo ) compañeros de camada el día 8 del modelo MC903. b, hipersensibilidad mecánica al picor provocada por MC903 en ratones Piezo1fl/fl o Piezo1fl/+;PirtCre-/- (WT), Piezo1fl/+;PirtCre+/- (HET) y Piezo1 fl/fl;PirtCre+/- (KO) (Kruskal –Wallis: ***P = 0,0002, χ2 = 17,36, Dunn: ***Ajustado = 0,0004). c, rascado espontáneo MC903 (Kruskal-Wallis: *P = 0,0444, χ2 = 6,231; Dunn: *Padjusted = 0,0319). Los datos en b,c son de n = 12 WT, n = 5 HET yn = 9 ratones KO de dos experimentos. d, rascado evocado mecánicamente después de la inyección de solución salina tamponada con fosfato (PBS) o GsMTx4 en ratones de tipo salvaje, normalizados a la línea de base; ver también Datos extendidos Fig. 9b (ANOVA de tres vías: ****Ptratamiento < 0.0001, F(1, 104) = 51.38; Ajuste de Tukey: ***P0.16g = 0.0002, *P0.4g = 0.0260; n = 14 ratones). e, aloknesis de histamina (Mann-Whitney: ****P < 0,0001, U = 0; n = 14 ratones). f, rascado provocado por histamina (Mann-Whitney: P = 0,0709, U = 58,50; n = 14 ratones). Los datos en d-f son de dos experimentos. g, Esquema de los experimentos del modelo de picor crónico MC903 con GsMTx4 agudo. h, MC903 hipersensibilidad al picor antes y después de la inyección de PBS o GsMTx4 (Kruskal-Wallis: **P = 0,0013, χ2 = 15,66; Dunn (de izquierda a derecha): **Ajustado = 0,0063, **Ajustado = 0,0066, *Ajustado = 0,01; n = 8 ratones). i, rascado espontáneo de MC903 después de la inyección de PBS o GsMTx4 (Mann-Whitney: P = 0.1848, U = 19; n = 8 ratones). Los datos en h–i son de dos experimentos. Las barras de error representan la media ± sem de n réplicas biológicas (ratones) y las pruebas estadísticas son de dos colas cuando corresponda.

Datos fuente

Finalmente, preguntamos si la inhibición aguda de PIEZO1 podría aliviar el picor mecánico y la sensibilización al picor. Investigamos si la inhibición de PIEZO1 con la toxina GsMTx4 podría fenocopiar la pérdida genética de PIEZO1 (refs. 39, 43). De hecho, el pretratamiento con inyección intraperitoneal de GsMTx4 para lograr el bloqueo sistémico39 redujo el rascado provocado mecánicamente en ratones sin tratamiento previo (Fig. 4d y datos extendidos Fig. 9b) y la aloknesis después de la inyección de histamina (Fig. 4e), pero no afectó significativamente el picor provocado por histamina. (Figura 4f). Además, la hipersensibilidad al picor dependiente de MC903 en la nuca se atenuó en gran medida en ratones tratados con GsMTx4 (Fig. 4g, h), mientras que los comportamientos de rascado espontáneos persistieron, aunque a niveles ligeramente reducidos (Fig. 4i). Aunque GsMTx4 no es un antagonista selectivo de PIEZO1 e inhibe otros canales activados mecánicamente in vitro44, cuando se toma junto con nuestros datos de picazón crónica de ratones KO condicionales de PIEZO1, este hallazgo indica que los antagonistas de PIEZO1 tienen un uso potencial en el tratamiento de la picazón.

En resumen, nuestro trabajo muestra que un subconjunto de neuronas sensibles al picor son polimodales y responden a pruritogenos químicos y mecánicos. Los pruriceptores PIEZO1+ descritos aquí pueden actuar en paralelo o independientemente del circuito de picor mecánico dependiente de LTMR previamente identificado2. Queda la pregunta de por qué PIEZO1 transduce picor mecánico cuando PIEZO2 se expresa en neuronas somatosensoriales y es exquisitamente sensible a los estímulos mecánicos. Especulamos que el picor mecánico dependiente de PIEZO1 en las fibras C de conducción lenta puede alimentar la sensación persistente de un parásito excavador e impulsar el deseo de rascarse hasta que el organismo sea expulsado de la piel, mientras que el picor mecánico dependiente de Aβ-LTMR puede tener una clave papel en la coordinación y activación de una respuesta refleja rápida, muy similar a cómo los LTMR PIEZO2+ coordinan los comportamientos reflejos nociceptivos (como la respuesta a un pinchazo) que son en gran medida independientes de PIEZO2 (ref. 45). Además, el trabajo in vitro anterior ha demostrado que PIEZO1 es más sensible al estiramiento de la membrana (a través de la estimulación por succión del parche de membrana en modo de unión celular) que PIEZO2 (ref. 46). Aunque no probamos la capacidad de respuesta al estiramiento de la membrana de las neuronas SST+, una hipótesis es que las distintas propiedades de activación mecánica de PIEZO1 pueden favorecer la mecanosensibilidad de las terminaciones nerviosas libres como las de los pruriceptores, mientras que las propiedades de PIEZO2 pueden favorecer específicamente el extremo sensible al tacto especializado. órganos Además, aunque mostramos que PIEZO1 tiene un papel esencial en las neuronas SST+ en el prurito mecánico, no podemos descartar la posibilidad de que las neuronas MRGPRD+ contribuyan al prurito mecánico, a pesar de su controvertido papel como mediadores del prurito47. Con respecto a este punto, sí observamos rascado provocado por picazón en ratones con activación quimiogenética de neuronas MRGPRD+ maduras que expresan hM3Dq DREADD (receptor de diseño activado exclusivamente por una droga de diseño) después de la inyección del agonista 21 de DREADD en la mejilla (Figura de datos ampliada). . 10), lo que respalda estudios previos que implicaron a las neuronas MRGPRD+ en el prurito21. La contribución de PIEZO2 al prurito mecánico sigue sin estar clara debido a los efectos opuestos de diferentes subpoblaciones de LTMR sobre el prurito mecánico (es decir, aferentes de células de Merkel frente a TLR5+ LTMR)14,17. Será necesario desarrollar estrategias genéticas altamente selectivas para investigar cómo se cruzan las vías del picor dependientes de PIEZO1 y PIEZO2, ya que los métodos actuales para lograr la desactivación de PIEZO2 en los LTMR también se dirigen a los propioceptores que coordinan los comportamientos reflejos37, lo que puede confundir el estudio del picor. rascado evocado.

En una nota final, la genética de la picazón se atribuye en gran medida a variantes en un puñado de genes que se encuentran principalmente en poblaciones europeas blancas, que no contribuyen sustancialmente a los trastornos de picazón en poblaciones negras o africanas48. Dada la importancia de las variantes de PIEZO1 para la salud humana, particularmente en las poblaciones negras y africanas desatendidas y poco estudiadas4,39, será importante examinar si la variación en PIEZO1 contribuye al picor y cómo lo hace. Dichos estudios requerirán bases de datos genómicas a gran escala complementadas con un extenso fenotipado clínico de la picazón mecánica y la severidad de la picazón crónica, que hasta ahora se ha realizado solo en pequeñas cohortes de individuos debido a la complejidad de tales experimentos.

Todos los análisis estadísticos se realizaron en Prism 9.3.0 (GraphPad). Las barras de error se definen como la media ± sem, a menos que se indique lo contrario, y siempre que sea factible, se trazan puntos de datos individuales o recuentos totales. Para la Fig. 3b,e,k y las Figs. de datos extendidos. 7k, l, 8i y 9b, solo se representa la media ± sem debido a la gran cantidad de columnas, y los valores individuales se proporcionan en los datos de origen. Todas las covariables probadas se informan en las leyendas. Se realizaron pruebas de dos colas cuando correspondía. Los números n, las estadísticas de prueba, los valores P exactos y los grados de libertad se indican en las leyendas de las figuras. Aparte de los datos electrofisiológicos, que se analizaron utilizando los métodos descritos anteriormente3,18, no se asumió la normalidad y/o la varianza igual, por lo que se utilizaron pruebas no paramétricas en todo momento, con la prueba post-hoc apropiada indicada para comparaciones múltiples. Cuando se examinaron dos o más variables independientes, se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de dos o tres vías y no se asumió la esfericidad.

No se realizaron análisis por adelantado para predeterminar el tamaño de la muestra. Los tamaños de muestra se basaron en estudios similares en la literatura14,18. Todos los intentos de replicación fueron exitosos. Todos los experimentos se repitieron más de una vez, como se indica en las leyendas de las figuras, excepto las Figs. de datos extendidos. 7r, 8a y 10, y los números n (repeticiones biológicas) se indican para esos experimentos en las leyendas de las figuras. Para aquellos experimentos que se repitieron una sola vez, así se indica en la leyenda de la figura. No se utilizó aleatorización. Los ratones se asignaron arbitrariamente a los grupos de tratamiento y vehículo para los experimentos GsMTx4 y Yoda1, ya que tenían la misma edad, genotipo y sexo, por lo que no fue posible la aleatorización. Para todos los demás experimentos de comportamiento, un experimentador ciego analizó cohortes enteras o camadas de ratones a la vez, por lo que no se necesitó ni fue posible ninguna asignación o aleatorización. El experimentador cegado asignó arbitrariamente a los ratones números de cámara de comportamiento. Para todos los experimentos de comportamiento, el experimentador y el anotador (analizador) estaban cegados tanto al tratamiento (cuando se aplicaron dos o más tratamientos) como al genotipo (cuando se probaron dos o más genotipos) siempre que fue posible. Para las imágenes de electrofisiología y calcio, se probó un único cubreobjetos o cámara de células de cada genotipo o condición en orden alterno con el genotipo o condición opuestos (por ejemplo, siRNA o tratamiento farmacológico) para que los genotipos y las condiciones se evaluaran en paralelo. Para todos los demás experimentos, no se necesitó ni fue posible la aleatorización ya que no hubo condiciones para comparar. Para las imágenes de calcio, los datos se analizaron fuera de línea mediante rutinas automatizadas, por lo que no fue necesario el cegamiento. Para electrofisiología, los experimentos se realizaron como se publicó anteriormente sin cegamiento3,18,37. Para todos los demás experimentos, no hubo comparaciones, por lo que el cegamiento fue innecesario.

Todos los experimentos se realizaron bajo las políticas y recomendaciones de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Scripps Research. Los ratones se mantuvieron en alojamiento estándar con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas con luces encendidas de 6 a. m. a 6 p. m., con una temperatura ambiente de alrededor de 22 °C y una humedad entre 30 % y 80 % (no controlada). Los ratones se mantuvieron en camas de papel granulado y se les proporcionaron nidos cuadrados de papel y tubos de enriquecimiento de cloruro de polivinilo con acceso ad libitum a comida y agua. Se usaron ratones compañeros de camada de la misma edad para todos los experimentos in vivo. Para todos los experimentos in vivo excepto para las Figs. 3h,i y 4d–i, que usaron solo ratones machos, se usaron y agruparon ratones machos y hembras. Las edades de los ratones variaron de 2 a 6 meses para estudios de comportamiento y de 1,5 a 4 meses para electrofisiología, imágenes de calcio, IHC y smFISH. Los ratones homocigóticos Piezo1tdTomato se describieron previamente25 y se mantuvieron en el laboratorio (B6;129-Piezo1tm1.1Apat/J; Jackson Laboratories 029214). Los ratones HM3dGq fl/fl;Mrgprd CreERT2+/− se generaron cruzando ratones HM3dGq fl/fl disponibles comercialmente (B6N;129-Tg(CAG-CHRM3*,-mCitrine)1Ute/J; Jackson Laboratories 026220) con Mrgprd CreERT2+/− ratones (Mrgprd tm1.1(cre/ERT2)Wql; Jackson Laboratories 031286), y cruzando la progenie para obtener los genotipos deseados. La recombinación se logró con una inyección intraperitoneal una vez al día de 75 mg por kg de peso corporal de tamoxifeno (Sigma) disuelto en 0,22 µm de aceite de maíz filtrado estéril administrado a ratones experimentales y de control durante cinco días consecutivos. Los ratones Ai9 fl/fl;SstCre+/− se generaron cruzando ratones hembra Ai9 fl/fl disponibles comercialmente (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J; Jackson Laboratories 007909) con Ai9fl/fl; SstCre+/+ machos (B6J.Cg-Sst tm2.1(cre)Zjh/MwarJ; Jackson Laboratories 028864). No se usaron ratones visiblemente rosados ​​o rojos para los experimentos, ya que se observó cierta recombinación de la línea germinal. También se generaron ratones Piezo1 fl/fl;Sst Cre+/− a partir de esta línea. Los ratones Piezo1 fl/fl;PirtCre+/ se generaron cruzando ratones hembra Piezo1 fl/fl (Piezo1 tm2.1Apat/J; Jackson Laboratories 029213) con machos PirtCre+/− (Pirttm3.1(cre)Xzd, obsequio de X. Dong, Johns Hopkins University), y luego cruzar la descendencia masculina Piezo1 fl/+;Pirt Cre+/− con Piezo1 fl/fl o Piezo1 fl/+;Ai9 fl/+ o Ai9 +/+ ratones hembra para generar knockouts homocigotos, ratones heterocigotos y Ratones de control PirtCre-/-, algunos de los cuales portaban el alelo Ai9 fl/+. La línea de ratón PIEZO1GOF lleva de manera ubicua el cambio de nucleótido c.GG7742-7743AC y se ha descrito previamente4. Se generaron ratones PIEZO1GOF experimentales a partir de apareamientos heterocigóticos. Estas cepas anteriores se mantuvieron en un fondo C57BL6/J cuando no se cruzaron para generar los genotipos deseados, excepto Piezo1tdTomato y MrgprdCreERT2+/-, que se mantuvieron como cepas endogámicas. Los ratones macho C57BL6/J de tipo salvaje usados ​​en las Figs. 3h,i y 4d–i se compraron en la colonia de cría de roedores del Departamento de Investigación de Recursos Animales de Scripps. El genotipado por PCR a partir de muestras de ADN de corte de cola se realizó internamente siguiendo las pautas del Laboratorio Jackson. Todos los ratones, excepto los ratones C57BL6/J comprados, recibieron etiquetas de identificación de metal (National Band & Tag, 1005-1) en la oreja derecha cuando tenían entre 18 y 30 días de edad. Después del destete entre los días 21 y 30 de edad, los ratones se alojaron en grupos de 2 a 5 compañeros de camada del mismo sexo.

Para los experimentos con ratones, los tejidos DRG se extrajeron inmediatamente, se incrustaron en un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT, Sakura) y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Para el tejido humano, se obtuvo un DRG de nivel T1 (torácico) ultracongelado de Anabios de una mujer donante de 45 años sin antecedentes de enfermedad neurológica. El DRG humano se incrustó en OCT preenfriado sobre hielo seco de modo que permaneció congelado, y se usaron criosecciones de 20 µm para todos los experimentos. El protocolo para el kit de reactivos fluorescentes multiplex RNAscope V2 (ACDBio: 323100) se siguió exactamente de acuerdo con las instrucciones para tejido fresco congelado. Se aplicó proteasa IV durante 22 min para tejido de ratón y 30 min para tejido humano después de experimentos piloto para optimizar las condiciones de proteasa. Sondas (todas de ACDBio) para mouse Piezo1 (C1; 400181), mouse Piezo2 (C1; 400191, C2; 400191-C2), mouse Mrgprd (C3; 417921-C3), mouse Nppb (C3; 425021-C3), mouse Mrgpra3 (C2; 548161-C2), Calca de ratón (C2; 417961-C2), Scn10a de ratón (C2; 426011-C2), PIEZO1 humano (C1; 485101), PIEZO2 humano (C1 o C2; 449951, 449951-C2) , se aplicaron NPPB humano (C2; 448511-C2) y tdTomato (C2; 317041-C2) para detectar la transcripción. La cuantificación de imágenes se realizó manualmente en ImageJ (Fiji, 2.3.0/1.53f) utilizando regiones de interés (ROI) para definir el área de cuantificación. En tejidos de ratón, las ROI positivas se contaron como aquellas con más de cinco puntos por ROI, sobre la base de experimentos con la sonda de control negativo Dapb de 3 plex (320871). Los bordes de las células se dibujaron alrededor de señales de transcripción de marcadores altamente expresadas para definir células individuales. En humanos, las células con más de tres puntos por ROI se contaron como células positivas, según la sonda de control negativo Dapb. Los bordes de las células se dibujaron alrededor de señales de transcripción de marcadores altamente expresadas para definir células individuales, y las células debían tener un borde glial satelital claramente definido. La lipofuscina estaba presente en los GRD humanos, y esas áreas se identificaron mediante señales de fluorescencia idénticas a través de múltiples canales de detección utilizando los criterios publicados49, por lo que no se contaron los puntos puncta en esas regiones. Las imágenes mostradas se recortaron uniformemente de las imágenes originales de 20x en las que se realizó la cuantificación.

Para los experimentos de PIEZO1tdTomato, los tejidos se procesaron utilizando un protocolo modificado para preservar la señal50. En resumen, los DRG recién congelados y los ganglios del trigémino se incluyeron en OCT y se seccionaron a 20 µm. Las secciones se fijaron posteriormente en portaobjetos en paraformaldehído (PFA) frío al 4 % en PBS durante 10 min a temperatura ambiente y se enfriaron con glicina 20 mM y cloruro de amonio 75 mM con Triton X-100 al 0,1 % v/v en PBS durante 10 min. Los portaobjetos se lavaron en PBS y luego se incubaron en tampón de bloqueo (gelatina de piel de pescado al 0,6 % p/v con saponina al 0,05 % p/v en PBS con suero normal de burro o cabra al 5 % v/v) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron en anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C en tampón de bloqueo sin suero: anti-RFP de conejo 1:200 (Rockland 600-401-379), anti-PECAM1 de rata 1:200 (Sigma CBL1337-I) y anti-PECAM1 de rata 1:200 (Sigma CBL1337-I) y pollo anti-NefH (Abcam ab4680). Los portaobjetos se lavaron en PBS y luego se incubaron en anticuerpos secundarios en tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente (todo 1:1000): cabra anti-conejo AlexaFluor 594 (Life Technologies A11037), burro anti-rata AlexaFluor 488 (Jackson 712-546) -153) y burro anti-pollo AlexaFluor 647 (Jackson 703-605-155). Las muestras se montaron en SlowFade Diamond y se sellaron con esmalte de uñas. Para IHC convencional, los ratones se perfundieron transcardiacamente con 15-30 ml de PBS helado seguido de 30 ml de PFA al 4 % en PBS. Los DRG se diseccionaron en PBS y se fijaron posteriormente durante 20 min en hielo en PFA al 4 % en PBS. Los tejidos se crioprotegieron durante la noche en sacarosa-PBS al 30 % (p/v) a 4 °C antes de incluirlos en OCT y seccionarlos a 20 µm en un criostato. Las secciones se enjuagaron brevemente en PBS, se lavaron durante 10 min en Triton X-100 al 0,3 % en PBS (PBST), luego se bloquearon durante 1 h en suero de cabra normal al 5 % en PBST al 0,3 %. Las secciones se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en anti-CGRP de conejo (Immunostar 24112) diluido 1:1000 en PBST al 0,3 %. Las secciones se lavaron en PBS y se incubaron en AlexaFluor 488 anticonejo de cabra 1:1000 (Thermo Fisher Scientific A32731) y 25 µg ml−1 de conjugado de isolectina B4 AlexaFluor 647 (Life Technologies I32450) durante 1 h a temperatura ambiente. Los tejidos se enjuagaron en PBS, se montaron en Fluoromount G + DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) y se sellaron con esmalte de uñas. Tanto para smFISH como para IHC, se tomaron imágenes de todas las muestras en un microscopio confocal Nikon A1 o Nikon C2 y los ajustes de imagen (potencia del láser, ganancia, resolución original de 1024 × 1024, permanencia de píxeles, objetivo y uso del zoom Nyquist) se mantuvieron constantes. dentro de los experimentos. Para todas las imágenes, los ajustes de brillo y contraste se aplicaron uniformemente a toda la imagen.

El cultivo celular se llevó a cabo como se describió previamente18. En resumen, los GRD se diseccionaron y se incubaron durante 60 min a 37 °C en 6,25 mg ml−1 de colagenasa IV (Life Technologies 17104-019) en medio sin suero, seguido de incubación en 1 U ml−1 de papaína (Fisher NC9199962) durante 30 min a 37 °C. Las células se trituraron y se transfirieron a un medio con suero bovino fetal al 10 % suplementado con los siguientes factores de crecimiento (de Gibco): GDNF 50 ng ml−1, NGF 100 ng ml−1, NT-4 50 ng ml−1, NT-3 50 ng ml-1 y BDNF 50 ng ml-1. Para la formación de imágenes de calcio, se añadió al medio arabinósido de citosina 10 µM (Sigma). Las células se sembraron en placas sobre cubreobjetos de vidrio revestidos con poli-d-lisina y laminina (Corning, para electrofisiología) o cubreobjetos con cámaras de ocho pocillos (Ibidi, para imágenes de calcio). Medio: HyClone DMEM/F12 1:1 con l-glutamina y HEPES (Cytiva o Gibco) complementado con penicilina-estreptomicina 1:100 (Gibco). Para la formación de imágenes de calcio, las células se usaron dentro de uno a tres días. Para los experimentos de nucleofección, las células se usaron de tres a cinco días después de la siembra. Los cultivos DRG y la transfección de siRNA se realizaron exactamente como se describe3,37 utilizando el Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S (Lonza, V4XP-3032); Se nucleofectaron 120 pmol de siRNA y 400 ng de plásmido pIRES2-eGFP (Clontech 6029-1) por reacción. Reactivos: mouse Piezo1 siRNA (ON-TARGETplus mouse Piezo1 (234839) siRNA SMARTpool; L-061455-00-0005), mouse Piezo2 siRNA (ON-TARGETplus mouse Piezo2 (667742) siRNA SMARTpool; L-163012-00-0005) y siRNA no dirigido (ON-TARGETplus no dirigido siRNA; D-001810-10-05).

Las células se cargaron durante 60 min a temperatura ambiente con Fura-2AM 10 µM (Life Technologies F1201) complementado con Pluronic F-127 al 0,01 % (p/v; Life Technologies) en una solución de Ringer fisiológica que contenía NaCl 127 mM, KCl 3 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2,5 mM, MgCl2 1 mM y D-(+)-glucosa 10 mM, pH 7,3. Todos los productos químicos se compraron a Sigma. Las neuronas se presentaron con Yoda1 20 µM (Tocris) en vehículo de DMSO-Ringer al 1 %, diclorhidrato de histamina 100 µM (Tocris) en Ringer, β-alanina 1 mM (Tocris) en Ringer y/o isotiocianato de alilo 100 µM (AITC, Sigma) en 0,1% de DMSO-Ringer. Las imágenes se adquirieron con el software MetaFluor (v.7.8.2.0) y se mostraron como una relación de 340 nm/380 nm. Las células se identificaron como neuronas provocando la despolarización con solución de Ringer rica en potasio (71,5 mM) al final de cada experimento. Las neuronas que respondieron se definieron como aquellas que tenían un aumento de más del 15 % con respecto a la proporción inicial. El análisis se realizó utilizando métodos previamente establecidos en Igor Pro 6.3.7 (WaveMetrics)51,52. Cincuenta y siete neuronas individuales con artefactos de adición de compuestos (grandes picos en la traza de imágenes de calcio) se excluyeron del análisis del área bajo la curva, pero aún se usaron para el análisis de la relación normalizada máxima. En experimentos separados, las células se incubaron durante 5 minutos en histamina 1 µM por debajo del umbral (que no provocó transitorios de calcio), antes de la estimulación con Yoda1 20 µM. Las proporciones de Fura2 se normalizaron a la proporción de referencia F340/F380 = (Relación)/(Relación = 0).

Las grabaciones de pinzamiento de parche de células completas se realizaron utilizando un amplificador Axopatch 200B como se describe utilizando métodos estándar para lograr una resistencia de acceso de 6,6 ± 0,2 MΩ (n = 186)3,18. Durante el registro, las células se mantuvieron a 21-23 °C en solución de Ringer fisiológica y se sujetaron a -80 mV. Los electrodos tenían resistencias de 3,4 ± 0,1 MΩ (n = 186) cuando se llenaron con una solución intracelular baja en cloruro basada en gluconato: gluconato de K 100 mM, KCl 25 mM, CaCl2 0,483 mM, MgCl2 3 mM, HEPES 10 mM, BAPTA 1 mM sal de tetrapotasio, Mg-ATP 4 mM y Na-GTP 0,4 mM (pH 7,3 con KOH). Los somas neuronales se sometieron a pruebas de mecanosensibilidad utilizando una sonda de vidrio pulido al fuego. El desplazamiento de la sonda se avanzó en incrementos de 1 μm usando un estimulador piezoeléctrico controlado por computadora3,18. Todos los datos se analizaron como se describió anteriormente3,18,37 utilizando pClamp 10 y Prism 9.3.0.

Dos experimentadores realizaron en paralelo grabaciones de patch clamp de células completas utilizando un amplificador Axopatch 200B o un amplificador Multiclamp 700A. Las corrientes activadas mecánicamente de línea de base se midieron como se describe anteriormente utilizando incrementos de desplazamiento crecientes de 0,5 µm hasta que la relación estímulo-intensidad-respuesta se acercó a Imax. El diclorhidrato de histamina (100 µM; Tocris) se administró mediante perfusión por gravedad a una velocidad de 2–3 ml min−1. Las corrientes activadas mecánicamente se evaluaron de nuevo en presencia de histamina, que provocó una corriente hacia el interior. El lavado de histamina se realizó durante varios minutos. Finalmente, las células se perfundieron con Yoda1 10 µM para evaluar si la cinética de inactivación de las corrientes activadas mecánicamente se ralentizaba como se ha demostrado previamente para las corrientes PIEZO1 heterólogas26.

Todos los experimentos de comportamiento se realizaron entre las 12:00 y las 18:00 en la misma habitación. Cuando se realizaron múltiples pruebas en una cohorte de ratones (como en la Fig. 3), las pruebas se realizaron en el siguiente orden en el transcurso de siete días: serie de von Frey, arriba-abajo de von Frey, pinchazo, Randall-Selitto, clip de cola , picor mecánico y picor histamínico agudo seguido de medición de aloknesis. Con la excepción del modelo MC903, en el que los compañeros de jaula podían ingerir el químico aplicado tópicamente y, por lo tanto, se alojaban individualmente, los ratones se alojaban con uno a cuatro compañeros de camada del mismo sexo. Los ratones con lesiones, heridas, condritis del oído o mala condición física notorios no se usaron para los estudios de comportamiento. El experimentador y el (los) anotador (es) (para la picazón) desconocían el genotipo y el compuesto inyectado (cuando fuera relevante).

Las medidas conductuales del picor y el dolor agudo se realizaron como se describió previamente51,53,54. Los ratones se afeitaron en la nuca, los pelos esponjosos de la parte posterior de la oreja izquierda o la mejilla derecha de cinco a siete días antes del experimento con maquinillas quirúrgicas con isoflurano al 1-2%. A menos que se indique lo contrario, todos los comportamientos de picor se realizaron en la nuca. Para todos los experimentos de comportamiento de picor, los ratones se aclimataron en las cámaras de comportamiento durante los dos días anteriores a las mediciones de comportamiento durante una hora. Para experimentos químicos de prurito, compuestos (diclorhidrato de histamina: 50 µg en PBS, Tocris; Yoda1: 14,2 ng, 142 ng o 355 ng en DMSO-PBS al 1 %, Tocris; difosfato de cloroquina: 200 µg en PBS, Tocris; IL- recombinante de ratón 31: 60 pmol en NaCl al 0,9%, Peprotech; agonista DREADD 21: 25 µg en PBS, Tocris) por vía intradérmica utilizando una jeringa de insulina de 31 g en un volumen total de 20 µl. Los ratones se colocaron individualmente en cámaras de plexiglás de cuatro partes cubiertas con divisores opacos (Ugo Basile) sobre una plataforma de plexiglás (Fab Glass and Mirror) con un pequeño cuadrado de papel para absorber el exceso de orina. La cantidad de episodios y episodios, y la duración de los episodios, se puntuaron manualmente a partir de videos grabados con una cámara GoPro Hero 8 o una cámara Nikon D3200. Todos los videos de comportamiento se grabaron desde abajo usando un espejo y se puntuaron durante 30 minutos, excepto la Fig. 4f, i que se grabaron y puntuaron durante 25 minutos. La puntuación del comportamiento se realizó con QuickTime 10.4. Un episodio de rascado se definió como un período de uno o más episodios de rascado desde el momento en que se levantó la pata del piso de plexiglás hasta que se devolvió, o el acicalamiento de la pata persiste durante tres o más segundos. Un ataque se definió como una serie de uno o más rasguños dentro de un episodio en el que la pata se levantaba hacia y luego se alejaba del lugar del rasguño. Las toallitas se definieron como movimientos unilaterales de las patas delanteras en la mejilla que no ocurrieron durante un período de aseo facial (en el que la cara se limpia con ambas patas).

Se realizaron experimentos de picor mecánico similares a los métodos descritos anteriormente14,32. Los ratones se colocaron en cámaras de plexiglás de cuatro partes sobre una plataforma de plexiglás y se aclimataron durante 30 min. Desde arriba, los ratones fueron probados en la nuca afeitada o en la parte posterior afeitada de la oreja izquierda (Datos extendidos Fig. 7k) con una serie de fuerza descendente de cinco ensayos por fuerza usando monofilamentos de von Frey (Prueba táctil) que van desde 1 g hasta 0,008 g. Una respuesta positiva se calificó como uno o más casos de rascado dirigido al sitio con la pata trasera. Los ratones que se rascaban espontáneamente no se probaron hasta 1 minuto después de que dejara de rascarse. Las respuestas acumulativas de arañazos informan el número total de respuestas de arañazos dividido por el número total de ensayos como porcentaje, independientemente de la fuerza del filamento.

En los modelos de aloknesis provocados por histamina y Yoda1, el rascado provocado por picor se registró inmediatamente después de la inyección de 50 µg de histamina, 60 pmol de IL-31 o 355 ng de Yoda1 durante 30 minutos antes de la evaluación. La nuca afeitada se sondeó en busca de respuestas mecánicas al picor (ver arriba) con el filamento de 0,04 g tres veces en un intervalo de 5 min durante un total de 30 min (21 pruebas en total)14,32.

El modelo MC903 de prurito crónico se realizó como se describió previamente42,51. En resumen, los ratones se afeitaron en la nuca y se alojaron individualmente cinco días antes del inicio del modelo. MC903 (0,2 mM; Calcipotriol, Tocris) se preparó fresco en etanol absoluto y se aplicaron 20 µl usando una micropipeta a la piel cada mañana entre las 07:00 y las 09:00. El día 8, se registró el rascado espontáneo durante 30 minutos antes de la evaluación de la hipersensibilidad al picor usando métodos idénticos al método de aloknesis anterior.

GsMTx4 se adquirió de Abcam, se preparó fresco en PBS estéril y se inyectó por vía intraperitoneal a 540 µg por kg de peso corporal39. El prurito mecánico inicial se evaluó el día antes de la inyección utilizando una serie de filamentos atenuados de 0,4 ga 0,04 g. Al día siguiente, se inyectó vehículo GsMTx4 o PBS, y se registró el rascado provocado por histamina durante 25 min 1 h después de la inyección. Inmediatamente después se evaluó la aloknesis histamínica. Para los comportamientos de picor inducidos por MC903, se evaluó la hipersensibilidad mecánica al picor de referencia el día 7 del modelo. El día 8, se administró GsMTx4 1 h antes de las mediciones de rascado provocadas por picazón (registradas durante 25 min) y el ensayo de hipersensibilidad a la picazón descrito anteriormente.

El umbral mecánico se midió utilizando monofilamentos de von Frey calibrados (Touch Test) sobre una plataforma de malla metálica (Ugo Basile). Los experimentos de von Frey se realizaron como se describió anteriormente usando el método arriba-abajo comenzando con 1 g, o una serie de fuerza descendente de cuatro ensayos por fuerza desde 4 g hasta 0,008 g (refs. 18, 37). Las respuestas válidas incluyeron retirada rápida de la pata; lamer, morder o sacudir la pata afectada; o estremecerse. Se permitió que los ratones se aclimataran en la plataforma durante 1 h antes de las mediciones. Para el comportamiento de alodinia mecánica de von Frey, se inyectaron 355 ng de Yoda1 en la superficie plantar de la pata trasera y el umbral mecánico se cuantificó utilizando el método de arriba hacia abajo justo antes de la inyección y 5 min, 15 min y 30 min después de la inyección.

El ensayo de pinchazo se realizó en la plataforma de prueba de von Frey. La pata trasera del ratón se pinchó con una aguja de jeringa de 27 g sin romper la piel para inducir un dolor mecánico agudo rápido18,37. Cada pata se estimuló 10 veces con la aguja, con un descanso de 5 minutos entre ensayos, y el porcentaje de retirada (retirada rápida; lamer, morder o sacudir la pata; saltar y/o estremecerse) se calculó a partir del número total de ensayos Para las mediciones de latencia, el ensayo se realizó igual que el anterior, excepto que la aguja se soldó a un cable de cobre trenzado que se conectó mediante un cable BNC a un osciloscopio digital estándar (Tektronix). Usando el modo 'disparador', la duración de la traza de voltaje se usó para determinar cuánto tiempo estuvo la pata en contacto con el filamento para determinar la latencia hasta la retirada.

El ensayo de corte de cola se realizó como se describió previamente18,37. Los ratones se aclimataron en una mesa de trabajo de metal durante 15 minutos en cámaras de plexiglás circulares transparentes antes de la evaluación. La pinza de cocodrilo se colocó cerca de la base de la cola del ratón. Se anotó una respuesta cuando los ratones mostraron conciencia del clip mordiendo, vocalizando, agarrando la cola o dando una respuesta de salto. La latencia se midió con cronómetro, con un tiempo mínimo registrable de 1 s.

El ensayo de Randall-Selitto se realizó como se describió anteriormente18. En resumen, los ratones se sujetaron suavemente en la mano del experimentador y se aplicó una fuerza de pellizco en la pata trasera utilizando un dispositivo Randall-Selitto (IITC Life Sciences). Se utilizó un punto de corte de 300 g. Se puntuó una respuesta por cualquier estremecimiento visible de la extremidad trasera o vocalización audible.

En resumen, los ratones adultos ingenuos fueron sujetos por la cola y sostenidos sobre el mostrador o la jaula de la casa y se fotografiaron las patas traseras. Se desarrolló un sistema de puntuación de 0 a 2, en el que las imágenes de un ratón Piezo2 fl/fl;Hoxb8 Cre+/−37 representaban '0', o déficit propioceptivo grave; imágenes de un ratón C57BL6/J representado '2', o normal; y cualquier imagen intermedia o incierta se calificó con un '1', lo que podría haber sido indicativo de un posicionamiento transitorio de las extremidades de un ratón propioceptivamente normal o un compromiso leve en la propiocepción. Las imágenes fueron puntuadas por cinco evaluadores ciegos e independientes y los resultados de cada experimentador se promediaron para cada ratón.

Se inyectó Yoda1 (355 ng) o vehículo por vía intradérmica en la piel de la nuca afeitada de ratones C57BL6/J. Los ratones fueron sacrificados 30 minutos después de la inyección, la piel se depiló con crema depilatoria (Nair) y luego se enjuagó con agua, y la sección de la piel de la espalda inmediatamente alrededor del sitio de la inyección se diseccionó y se fijó en formalina al 10 % para inclusión en parafina. seccionamiento y tinción con hematoxilina y eosina (H&E). Las secciones de piel se tomaron imágenes a 20x usando un microscopio Keyence.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este documento.

Los datos brutos están disponibles de los autores previa solicitud razonable. Los datos de RNA-seq de una sola célula publicados anteriormente que se muestran en la Fig. 1 de datos extendidos están disponibles en: https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a A. Maximov y F. Polli por el regalo de los ratones Ai9fl/fl;SstCre; D. Bautista, K. Marshall, Y. Zhang, E. Mulhall, L. Stowers, L. Ye y A. Chesler por sus sugerencias y comentarios; S. Shirvan por su asistencia con la calificación del comportamiento; MR Servín Vences e Y. Zhang por las aportaciones de ratones experimentales y de cría; y S. Lechner por su asesoramiento sobre el ensayo de pinchazo. También agradecemos a K. Spencer, el Centro de Imágenes Nikon Center of Excellence, M. van Meter y el Departamento de Investigación de Recursos Animales de Scripps por sus recursos y servicios de apoyo. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Médico Howard Hughes, NIH subvención R35 NS105067 a AP y una beca de la Fundación Helen Hay Whitney a RZH

Instituto Médico Howard Hughes, Departamento de Neurociencia, Centro de Neurociencia Dorris, Instituto de Investigación Scripps, La Jolla, CA, EE. UU.

Rose Z. Hill, Meaghan C. Loud, Brooke Peet y Ardem Patapoutian

Departamento de Neurociencia, Centro de Neurociencia Dorris, Instituto de Investigación Scripps, La Jolla, CA, EE. UU.

Adrienne E. Dubin

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RZH y MCL realizaron disecciones DRG y nucleofecciones. AED y RZH realizaron, diseñaron y analizaron experimentos de electrofisiología. BP y RZH realizaron una puntuación de comportamiento de picazón. RZH diseñó y realizó todos los demás experimentos, analizó los datos y escribió el manuscrito. AP contribuyó al diseño del proyecto, la edición del manuscrito y la supervisión. Todos los autores discutieron los resultados y contribuyeron a la edición del manuscrito.

Correspondencia a Ardem Patapoutian.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a Xinzhong Dong, Martin Schmelz y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Datos de RNA-seq de una sola célula de un informe anterior8 presentados como un diseño dirigido por la fuerza que muestra la expresión de Piezo1 en el grupo que contiene neuronas Sst/Nppb+ DRG (recuadro). Descargado de: https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all.

a–d, Imágenes representativas (ver Fig. 1d, e, 4–6 imágenes por marcador de 2 ratones) de DRG de ratón seccionado procesado para smFISH de Piezo1 (a–d), Mrgprd (a), Calca (b), Scn10a (c) y Piezo2 (d) con tinción DAPI e imagen fusionada. Escala = 100 µm.

a, b, Imágenes representativas (ver Fig. 1d-g, 4-6 imágenes por marcador de 2 ratones) de DRG de ratón seccionado procesado para smFISH de Mrgpra3 (a, b), Nppb (a, b), Piezo1 (a) , y Piezo2 (b) con tinción DAPI en la imagen fusionada. Escala = 100 µm.

a, Imagen representativa (ver Fig. 1h, 7-8 imágenes por marcador de 1 donante) de smFISH DRG humano T1 seccionado para PIEZO1 (magenta) y NPPB (verde), e imagen combinada con DAPI (azul). b, Imagen representativa (ver Fig. 1h) de smFISH DRG humano T1 seccionado para PIEZO2 (magenta) y NPPB (verde), e imagen combinada con DAPI (azul). Los asteriscos indican señal de lipofuscina y las puntas de flecha indican células PIEZO+NPPB+. Escala = 100 µm.

a, ganglios del trigémino de ratón PIEZO1tdTomato seccionados marcados con anticuerpos contra NEFH, PECAM1 y tdTomato (PIEZO1) e imagen fusionada. b, Nervio trigémino de ratón PIEZO1tdTomato seccionado marcado con anticuerpos contra NEFH, PECAM1 y tdTomato (PIEZO1) e imagen fusionada. c, ganglios del trigémino de ratón de tipo salvaje seccionados marcados con anticuerpos contra NEFH, PECAM1 y tdTomato, e imagen fusionada. Los asteriscos indican vasos sanguíneos PECAM1+ y las puntas de flecha indican fibras nerviosas y neuronas PIEZO1+. Todas las imágenes se presentan como proyecciones z de máxima intensidad de imágenes confocales; barras de escala = 100 µm. El experimento se repitió una vez más.

a, Imágenes representativas de smFISH (de 2 ratones) de Ai9fl/fl; SstCre+/- DRG para Piezo1 (magenta) y tdTomato (verde) con DAPI e imagen fusionada. Escala = 100 µm. b, Imax de las corrientes de MA en neuronas nucleofectadas con los grupos de siRNA indicados. Las células que no mostraron corrientes MA no se incluyeron para el análisis (ANOVA unidireccional: p = 0,6616; F (3, 76) = 0,5321). El número de células que responden se indica a partir de 2 ratones por condición. c, τinactivación de corrientes MA de b (ANOVA unidireccional: **p = 0,0021; F(3, 76) = 5,352; Tukey (de izquierda a derecha): **p = 0,0026; *p = 0,0346; *p = 0,0270). d, Imax frente a τinactivación de las corrientes MA de b y c, con siRNA n no dirigido (círculos negros) agrupados entre los experimentos de eliminación Piezo1 (cuadrados blancos) y Piezo2 (triángulos grises). Las líneas punteadas indican límites para las categorías actuales SA, IA y RA. e, τinactivación de las corrientes MA en las neuronas antes (línea base), durante el tratamiento con histamina 100 µM, el lavado y con el tratamiento con Yoda1 10 µM (medidas repetidas ANOVA: **p = 0,0077; F(2,11) = 10,11; Dunnett: * fitamina = 0,0281; *pYoda1 = 0,0115). f, datos en e presentados como el % de cambio en la inactivación de τ en comparación con la línea de base (0%). g, Imax de corrientes MA de e (medidas repetidas ANOVA: p = 0,0714; F(2,11) = 3,737). h, datos en g representados como % de cambio en Imax en comparación con la línea de base (0%). e-h son de n = 12 células de 2 ratones. i, rastros representativos de los experimentos en e-h, con el rastro de sangría que se muestra en la parte superior. j, proporción de Fura2 normalizada representada en el tiempo con la adición de Yoda1 después de una preincubación de 5 min en histamina 1 µM o vehículo. Algunas neuronas tuvieron una respuesta retardada a Yoda1 que se indica en las curvas bifásicas para histamina y vehículo. El eje quebrado indica 3 minutos de tiempo transcurrido durante la incubación. k, área bajo la curva para datos de imágenes de calcio en j (Mann-Whitney: **p = 0,0021, U = 5596). l, índice de Fura2 normalizado máximo para datos de imágenes de calcio en j (Mann-Whitney: ***p = 0,0005, U = 5384). j–l son de n = 120 histamina y 121 neuronas vehículo de 2 ratones. Las barras de error representan la media ± sem de n réplicas biológicas (células) y las pruebas estadísticas son de dos colas cuando corresponde.

Datos fuente

a, Prurito evocado por histamina (Kruskal-Wallis: *p = 0,0386; χ2 = 6,510; Dunn: *ajustado = 0,0216). b, Episodios de scratch totales después de la histamina (Kruskal-Wallis: *p = 0,0296; χ2 = 7,043; Dunn: *p = 0,0165). c, Media de combates por episodio de a (Kruskal-Wallis: **p = 0,0047; χ2 = 10,73; Dunn: **ajustado = 0,0021). d, Episodios de Scratch después de histamina (Kruskal-Wallis: p = 0,9401; χ2 = 0,1234). a-d son de n = 11 WT, n = 6 HET y n = 8 ratones KO de 3 experimentos. e, prurito provocado por cloroquina (Mann-Whitney: p = 0,8078; U = 50, n = 12, 9). f, Episodios de scratch totales después de la cloroquina (Mann-Whitney: p = 0,6511; U = 47). ef son de n = 12 WT y n = 9 ratones KO de 2 experimentos. g, picor provocado por IL-31 (Mann-Whitney: ***p = 0,0008; U = 16,50, n = 11, 13). h, Episodios de scratch totales después de IL-31 (Mann-Whitney: ***p = 0,0009; U = 17). i, Media de episodios por episodio de g (Mann-Whitney: ****p < 0,0001; U = 0,5). j, aloknesis provocada por IL-31 (Mann-Whitney: ****p < 0,0001; U = 0). gi son de n = 11 WT y n = 13 ratones KO de 2 experimentos. k, modelo de oído de picor mecánico (ANOVA de dos vías: ***pgenotipo = 0,0002; F(2, 22) = 12,93; ajuste de Sidak: *p0,16g = 0,0214; ****p0,4g < 0,0001, n = 11 WT, n = 6 HET y n = 8 ratones KO de 3 experimentos). l, % de respuesta de abstinencia (ANOVA de dos vías: ***pgenotipo = 0,0007; F(2, 29) = 9,524; Dunn's **ajustado = 0,0014). m, umbral de von Frey de retirada del 50 % (Kruskal-Wallis: ***p = 0,0002; χ2 = 16,71; Dunn: ***p = 0,0007). n, respuesta Pinprick (Kruskal-Wallis: p = 0,2568; χ2 = 2,719). o, latencia Pinprick (Kruskal-Wallis: p = 0,3500; χ2 = 2,100, N = 11 WT, N = 6 HET y N = 8 ratones KO de 3 experimentos). p, Randall-Selitto (Kruskal-Wallis: p = 0,2225; χ2 = 3,006). q, Clip de cola (Kruskal-Wallis: p = 0,2505, χ2 = 2,769). Los datos en l–n y p,q son de n = 16 WT, n = 6 HET y n = 10 ratones KO de 4 experimentos. r, puntuaciones de propiocepción (Mann-Whitney: p = 0,6430, U = 57, n = 10, 13 ratones de 1 experimento). Las barras de error representan la media ± sem de n réplicas biológicas (ratones) y las pruebas estadísticas son de dos colas cuando corresponda.

Datos fuente

a, umbral de abstinencia del 50 % en ratones de tipo salvaje medido antes (línea de base) y después de la inyección intraplantar de Yoda1 en los minutos indicados después de la inyección (mpi) (Friedman: p = 0,5433; estadística de Friedman = 2,143, n = 7 ratones de 1 experimento ). b, Sección de piel de ratón inyectado con Yoda1 teñido con H&E (representativo de 5 ratones, escala = 100 µm). c, Sección de piel de ratón inyectado con vehículo teñido con H&E (representativo de 5 ratones, escala = 100 µm). d, Prurito evocado por histamina (Mann-Whitney: **p = 0,0045; U = 30). e, Episodios de rascado tras histamina en d (Mann-Whitney: **p = 0,0018; U = 25,50). f, aloknesis histamínica (Mann-Whitney: ****p < 0,0001; U = 10). d-f son de n = 10 WT y n = 17 ratones GOF de 3 experimentos. g, picor provocado por Yoda1 en ratones Piezo1+/+ y Piezo1GOF/GOF o Piezo1GOF/+ macho y hembra (Mann-Whitney: *p = 0,0180; U = 14,50). h, aloknesis Yoda1 (Mann-Whitney: ****p < 0,0001; U = 0). i, % de respuesta a la retirada (ANOVA de dos vías: pgenotipo = 0,6151; F(1, 25) = 0,2592). Los datos en g, h son de n = 7 WT y n = 12 ratones GOF de 2 experimentos. j, umbral de von Frey de retirada del 50% (Mann-Whitney: *p = 0,0276; U = 41,50). k, respuesta Pinprick (Mann-Whitney: p = 0,5350; U = 73). l, Randall-Selitto (Mann-Whitney: p = 0,9411; U = 83). m, clip de cola (Mann-Whitney: p = 0,5152; U = 73,50). Los datos en i-m son de n = 10 WT y n = 17 ratones GOF de 3 experimentos. Las barras de error representan la media ± sem de n réplicas biológicas (ratones) y las pruebas estadísticas son de dos colas cuando corresponde.

Datos fuente

a, Media de combates por episodio de scratch de Piezo1fl/fl; Ratones PirtCre que se muestran en la Fig. 4c (Kruskal-Wallis: *p = 0,0359; χ2 = 6,656; Dunn * ajustado = 0,0279). Los datos son de n = 12 WT, n = 5 HET y n = 9 ratones KO de 2 experimentos. b, datos no normalizados del ensayo de picor mecánico de la nuca representados con valores y resultados de pruebas estadísticas (símbolos *) que representan los valores P de la Fig. 4d (n = 14 ratones de 2 experimentos). Las barras de error representan la media ± sem de n réplicas biológicas (ratones) y las pruebas estadísticas son de dos colas cuando corresponde.

Datos fuente

Modelo de mejilla del agonista DREADD 21 provocado por picor en HM3dGq fl/fl; Ratones MrgprdCreERT2+/- y -/- (Mann-Whitney: ***p = 0,0002; U = 0, n = 6,10 ratones de 1 experimento). Las barras de error representan la media ± sem de n réplicas biológicas (ratones) y las pruebas estadísticas son de dos colas cuando corresponde.

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Hill, RZ, Loud, MC, Dubin, AE et al. PIEZO1 transduce picor mecánico en ratones. Naturaleza 607, 104–110 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04860-5

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Recibido: 28 diciembre 2021

Aceptado: 12 de mayo de 2022

Publicado: 22 junio 2022

Fecha de emisión: 07 de julio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-04860-5

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